一种天麻低聚糖gep-2的提取方法和应用
技术领域
1.本发明属于药物及生物技术领域，特别是涉及一种天麻低聚糖gep-2的提取方法和应用。
背景技术：2.中药天麻(gastrodia elata bl.)为兰科(orhidaceae)植物天麻属(gastrodia r.br.)天麻gastrodia elata bl.的干燥块茎，功能息风止痉，平抑肝阳，祛风通络。中药天麻主治肝风内动，惊痫抽搐，眩晕，头痛，肢体麻木，手足不遂，风湿痹痛等；是我国传统名贵中药。关于天麻属化学成分的研究可以追溯到19世纪中。目前，从文献报道可知，天麻属的主要化学成分是酚性成分及其衍生物、多糖，多肽等，共100余个。上述成分在研究中表现出多样的生物活性，如镇静安神，降低外周血管、脑血管和冠状血管的阻力，还有降压、减慢心率及镇痛抗炎作用，天麻多糖的研究中则表明具有免疫活性。
3.天麻富含多糖，目前报道的天麻多糖骨架类型主要为α-(1-4)-吡喃型-d-葡萄糖，前人研究发现上述类型的天麻多糖的分子量为1.54
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103kda或者28.8kda，具有分子量较大难以利用的缺陷，同时分子量为1.54
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103kda的多糖其实际是淀粉类成分，水溶液易成混悬状，难以溶于水中进行使用。因此，现有技术亟需一种便于利用的天麻提取物。
技术实现要素：4.为了解决上述问题，本发明提供了一种天麻低聚糖gep-2的提取方法和应用。本发明提供的天麻低聚糖gep-2具有类似网状的结构，能够显著改善提取物的溶解状态。同时，经过进一步的药理活性研究表明天麻低聚糖还具有类似神经生长因子(ngf)活性，能诱导神经细胞分化，促进嗜铬细胞瘤(pc12)分化，对于治疗神经退行性疾病有重要意义。
5.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
6.本发明提供了一种天麻低聚糖gep-2的提取方法，所述天麻低聚糖gep-2的提取方法包括以下步骤：
7.对脱脂天麻进行水提、过滤和浓缩得到粗浓缩提液；
8.将所述粗提浓缩液进行第一次醇提，得到粗多糖混合物a；所述第一次醇提的体系中乙醇浓度为35％；
9.将所述粗多糖混合物a依次进行静置、过滤和浓缩，得到粗多糖提取物浓缩液；
10.将所述粗多糖提取物浓缩液进行第二次醇提，得到粗多糖提取物b；所述第二次醇提的体系中乙醇的浓度为90％；
11.将所述粗多糖提取物b进行静置和离心，得到粗多糖提取物沉淀；
12.将所述粗多糖提取物沉淀进行复溶得到复溶液；
13.去除所述复溶液中的蛋白质，得到天麻低聚糖gep-2。
14.优选的，所述粗多糖提取物沉淀的复溶方法包括：将粗多糖提取物沉淀与水混合；所述水的温度包括90℃～100℃。
15.优选的，所述去除所述复溶液的方法包括sevage方法；所述去除去除所述复溶液中的蛋白质的次数≥3。
16.本发明还提供了上述提取方法提取得到的天麻低聚糖gep-2，所述天麻低聚糖gep-2的分子量为4.0～10.0kda。
17.本发明还提供了上述述提取方法提取得到的天麻低聚糖gep-2或上述的天麻低聚糖gep-2在提取神经系统保护药物中的应用。
18.本发明还提供了上述述提取方法提取得到的天麻低聚糖gep-2或上述的天麻低聚糖gep-2在提取神经系统保护食品中的应用。
19.本发明还提供了上述述提取方法提取得到的天麻低聚糖gep-2或上述的天麻低聚糖gep-2在提取神经系统保护生物制剂中的应用。
20.优选的，所述药物、食品或生物制剂中天麻低聚糖gep-2的质量百分含量≥50％。
21.本发明提供了一种天麻低聚糖gep-2的提取方法。本发明提供的提取方法提取获得的天麻低聚糖gep-2通过类似网状的结构，制备助溶平台，能够显著改善提取物的溶解状态。同时天麻低聚糖gep-2还具备卓越的类似ngf活性，能诱导神经细胞分化的物质，促进嗜铬细胞瘤(pc12)分化。经由实施例验证可知，本发明提供的天麻低聚糖gep-2能够有效提高神经细胞的分化率。
附图说明
22.图1为本发明提供的天麻低聚糖gep-2及gep-1的提取流程图；
23.图2为gep-1的hplc图谱；
24.图3为gep-2的hplc图谱；
25.图4为gep-1与gep-2溶解度差异图；
26.图5为gep-1的电镜图谱；
27.图6为gep-2的电镜图谱；
28.图7为神经保护活性实验中的空白对照组(blank)；
29.图8为神经保护活性实验中的阴性对照组(negative)；
30.图9为神经保护活性实验中的阳性对照组(positive)；
31.图10为神经保护活性实验中的化合物b组(gep-1)；
32.图11为神经保护活性实验中的化合物a组(gep-2)。
具体实施方式
33.本发明提供了一种天麻低聚糖gep-2的提取方法，包括以下步骤：
34.对脱脂天麻进行水提、过滤和浓缩得到粗浓缩提液；
35.将所述粗提浓缩液进行第一次醇提，得到粗多糖混合物a；所述第一次醇提的体系中乙醇浓度为35％；
36.将所述粗多糖混合物a依次进行静置、过滤和浓缩，得到粗多糖提取物浓缩液；
37.将所述粗多糖提取物浓缩液进行第二次醇提，得到粗多糖提取物b；所述第二次醇提的体系中乙醇的浓度为90％；
38.将所述粗多糖提取物b进行静置和离心，得到粗多糖提取物沉淀；
39.将所述粗多糖提取物沉淀进行复溶得到复溶液；
40.去除所述复溶液中的蛋白质，得到天麻低聚糖。
41.本发明对新鲜或干燥的天麻粉碎后进行醇提处理得到滤渣，对滤渣进行放置得到脱脂天麻。在本发明中，所述醇提的方法优选包括：利用乙醇水溶液对粉碎后的天麻进行浸提，得到滤渣；所述乙醇水溶液中乙醇的质量百分含量优选为90％～95％进一步优选为95％；所述浸提的次数优选为1～3次，进一步优选为3次。
42.本发明得到脱脂天麻后，本技术对脱脂天麻进行水提、过滤和浓缩得到粗浓缩提液。在本发明中，所述脱脂天麻的水提的方式优选包括沸水提取；所述沸水提取的方法优选包括：将脱脂天麻与水混合后进行煮沸处理；所述水优选为蒸馏水；煮沸的时间优选为1.5～3h，进一步优选为2h；所述沸水提取的次数优选为1～3次，进一步优选为2次；所述煮沸处理结束后进行过滤和浓缩；所述浓缩的温度优选为50℃～80℃，进一步优选为65℃。
43.得到粗浓缩提液后，本技术对粗提浓缩液进行第一次醇提，得到粗多糖混合物a；所述第一次醇提时，乙醇在第一次醇提的提取体系中的终体积百分含量为35％。在本发明中，所述第一次醇提的方法优选包括：向粗提浓缩液中添加质量百分含量为95％的乙醇水溶液，直至醇提体系中乙醇的质量百分含量达到35％时，停止加入乙醇水溶液。本发明通过控制粗多糖提取物中乙醇的含量，有利于更纯化地提取获得gep-2。
44.得到粗多糖混合物a后，本技术对粗多糖混合物a依次进行静置、过滤和浓缩，得到粗多糖提取物浓缩液。在本发明中，所述静置的时间优选大于等于12h；所述过滤时优选利用双层纱布进行过滤；
45.得到粗多糖提取物浓缩液后，本技术对粗多糖提取物浓缩液进行第二次醇提，得到粗多糖提取物b；所述第二次醇提时，乙醇在第二次醇提的提取体系中的终体积百分含量为90％。在本发明中，所述第二次醇提的方法优选包括：向粗多糖提取物浓缩液中添加无水乙醇，直至醇提体系中乙醇的质量百分含量达到90％时，停止加入无水乙醇。本发明通过控制粗多糖提取物b中乙醇的含量，能够精准的获得含有gep-2的提取物。
46.得到粗多糖提取物b后，本技术对粗多糖提取物b进行静置和离心，得到粗多糖提取物沉淀。在本发明中，所述静置的时间优选大于等于12h；所述离心的转速优选为3500rpm，离心的时间优选为20min。
47.得到粗多糖提取物沉淀后，本技术对粗多糖提取物沉淀进行复溶得到复溶液。在本发明中，所述复溶使用的溶液包括水；所述粗多糖提取物沉淀的复溶方法优选包括：将粗多糖提取物沉淀与水混合；所述水的温度优选包括90℃～100℃。本发明利用热水进行复溶能够充分去除gep-1，提高gep-2的纯度并改善溶解度。
48.得到复溶液后，本技术去除复溶液中的蛋白质，得到gep-2。在本发明中，所述去除上清液中蛋白质的方法优选包括sevage方法；所述去除蛋白质的次数优选大于等于3次，优选为3次；去除蛋白质后，本发明优选还包括对去除了蛋白质的复溶液进行浓缩和冷冻干燥；所述浓缩的温度优选为50℃～60℃，压力优选为-1.0pa；所述冷冻干燥的温度优选为-42℃，优选冷冻干燥1～2l/24～72h。
49.本发明提供的提取方法能够精准地提取获得gep-2。
50.本发明还提供了上述提取方法提取得到的天麻低聚糖gep-2，所述天麻低聚糖gep-2的分子量为4.0～10.0kda。本发明提供的天麻聚糖gep-2具有类似网状的结构，基于
该理化性质能够建立助溶平台来改善溶解性问题；天麻聚糖gep-2还具有类似神经生长因子(ngf)的功能，具有诱导神经细胞分化的活性，能够促进嗜铬细胞瘤(pc12)分化，对于治疗神经退行性疾病有重要意义。
51.本发明还提供了上述述提取方法提取得到的天麻低聚糖gep-2或上述的天麻低聚糖gep-2在提取神经系统保护药物中的应用。在本发明中，所述药物中天麻低聚糖gep-2的质量百分含量优选大于等于50％。本发明提供的应用能够有效促进pc12分化。
52.本发明还提供了上述述提取方法提取得到的天麻低聚糖gep-2或上述的天麻低聚糖gep-2在提取神经系统保护食品中的应用。在本发明中，所述食品中天麻低聚糖gep-2的质量百分含量优选大于等于50％。本发明提供的应用能够有效提高pc12的分化率。
53.本发明还提供了上述述提取方法提取得到的天麻低聚糖gep-2或上述的天麻低聚糖gep-2在提取神经系统保护生物制剂中的应用。在本发明中，所述生物制剂中天麻低聚糖gep-2的质量百分含量优选≥50％。本发明提供的应用能够有效提高pc12的分化活性。
54.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种天麻低聚糖gep-2的提取方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
55.实施例1
56.gep-1和gep-2的提取分离纯化及结构鉴定
57.1、gep-1和gep-2的提取分离纯化
58.取天麻新鲜块茎7.2kg，切成小块，加入质量百分含量为95％的乙醇水溶液浸提三次，过滤获得滤渣，将滤渣置于室温条件下的通风处，通风至滤渣无醇味，即得到脱脂天麻；
59.对脱脂天麻进行沸水提取，将脱脂天麻与20l蒸馏水混合后，煮沸提取2h，提取进行2次。提取结束后过滤，合并两次的滤液，将合并后的滤液在65℃的条件下减压浓缩至7～10l得到粗浓缩提液。
60.向粗浓缩提液中加入质量百分含量为95％的乙醇水溶液，慢加快搅，使乙醇终浓度达到35％，得到粗多糖混合物a。
61.放置粗多糖混合物a过夜后，使用双层纱布进行过滤，得到沉淀和35％的乙醇水溶液，将沉淀与10l的热水(90℃～100℃)混合后进行复溶，得到含有gep-1的水溶液。
62.将35％的乙醇水溶液浓缩至500ml左右，加入无水乙醇并进行搅拌，进行第二次醇提，当醇提系统内乙醇终浓度达到90％时停止加入无水乙醇，得到粗多糖提取物b。
63.放置粗多糖提取物b过夜后进行离心(5000rpm，20min)，得到粗多糖提取物沉淀。
64.将粗多糖提取物沉淀与2l热水(90℃～100℃)混合进行复溶，得到复溶液即含有gep-2的水溶液。
65.将含有gep-1的水溶液和含有gep-2的水溶液，分别用sevage方法(氯仿：正丁醇4:1)除蛋白，共除三次，除去蛋白质后进行浓缩和冷冻干燥，得到gep-1(380g)和gep-2(113.5g)。上述提取方法的流程图如图1所示。
66.2、gep-1和gep-2的结构鉴定
67.(1)gep-1用hplc-elsd检测，gep-1的hplc图谱如图2所示，gep-1为一个5.4出峰的均一多糖分子，分子量约为1.60
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103kda。
68.(2)gep-2用hplc-elsd检测，gep-2的hplc图谱如图3所示，gep-2的分子量约为4.0～10.0kda。
69.实施例2
70.取实施例1制备获得的gep-1及gep-2各100mg分别溶于10ml纯水中，观察记录溶解状态。gep-1和gep-2的溶解度如图4所示。图4中左边的gep-2水溶液明显为澄清水溶液，右边的gep-1水溶液则明显浑浊，呈混悬状，说明gep-2具有良好的溶解性。
71.分别取gep-1及gep-2各10μl，利用透射电子显微镜(tem)观察这二者分子量差异较大多糖的形态。gep-1的形态如图5所示，呈现类似于淀粉颗粒状的不规则的类圆形或三角形；gep-2的的形态如图6所示，呈现类网状的形态，表明具有改善提取物的溶解状态的功能。
72.实施例3
73.神经保护活性实验
74.1、pc12采用1640+10％hs+5％fbs+100u/ml双抗的培养基进行培养，培养箱温度37℃，5％co2；
75.2、当pc12细胞长至合适数量时，取pc12细胞，胰酶消化，制成细胞悬液；
76.3、将pc12细胞悬液吸至15ml离心管中进行离心处理(1000rpm，5min)；
77.4、离心结束后，离心管用酒精消毒后拿进超净台，将上清倒入废液缸留下沉淀；
78.5、向沉淀中加入新的完全培养基5ml，用移液器吹打十次，尽量吹散细胞，但不能太用力，获得分散的细胞悬液；
79.6、取0.2ml分散的细胞悬液，加入到细胞计数管中，再加0.8mlpbs，混匀，计数；
80.7、将pc12细胞的浓度调整至5
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104cells/ml，加入预先用多聚赖氨酸(pll)包被好的48孔板，每孔0.2ml，放入细胞培养箱培养；
81.8、培养的第二天，将原培养基吸出，然后加入含1640+2.5％胎牛血清(fbs)的培养基(48孔，0.24ml/孔)，和5ng/ml的神经生长因子(ngf)及待测化合物；
82.9、实验设计：分成5组，每组3个重复。
83.空白对照组(blank)：不加ngf，只有细胞和终浓度为0.1％的二甲基亚砜(dmso)；
84.阴性对照组(negative)：含终浓度为5ng/ml的ngf和终浓度为0.1％的dmso；
85.阳性对照组(positive)：含终浓度为50ng/ml的ngf和终浓度为0.1％的dmso；
86.化合物组a组(gep-1)：gep-1终浓度20μg/ml，，dmso终浓度为0.1％，ngf的终浓度为5ng/ml；
87.化合物组b组(gep-2)：gep-2终浓度20μg/mldmso终浓度为0.1％，ngf的终浓度为5ng/ml。
88.10、将各组细胞放入细胞培养箱中继续培养；
89.11、每天观察细胞分化情况，在加入化合物(gep-1和gep-2)并诱导72h后统计细胞分化比例，统计方法如下：
90.(1)判断标准：突起长度大于细胞直径的细胞，认为是有分化的细胞；
91.(2)和阴性对照相比，如果化合物组的突起长度和数量无明显提高，则认为无明显分化活性，不统计分化率；
92.(3)如果化合物组突起的数量、长度明显比阴性对照多，则认为该化合物有分化活性，要求对分化的细胞数量作出统计，每组统计不少于5个视野。pc12促分化活性的结果见表1和图7～图11，图7为神经保护活性实验中的空白对照组(blank)，图8为神经保护活性实
验中的阴性对照组(negative)，图9为神经保护活性实验中的阳性对照组(positive)，图10为神经保护活性实验中的化合物b组(gep-1)，图11为神经保护活性实验中的化合物a组(gep-2)。
93.表1不同组别对pc12的分化率的影响
94.组别blanknegativepositivegep-1gep-272h分化率(％)基本无分化3.97％19.83％4.91％12.32％
95.由表1结合图7～图11可知，化合物a组中的pc12细胞的凸起数量、长度明显比阴性对照组的多，因此可以判断认为gep-2具有显著的分化活性，促进pc12分化。经由与阳性对照组对比可知，gep-2具备类似ngf的作用。
96.虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。