紫色叶水稻两系不育系及其选育方法与应用

1.本发明涉及分子生物育种技术领域，具体涉及一种紫色叶水稻两系不育系及其选育方法与应用。


背景技术：

2.水稻是中国重要的粮食作物，其中两系杂交水稻年种植面积约占水稻总播种面积的1/4，但水稻两系不育系因本身种性或天气影响等原因，种子常有3％～5％的自交混杂，每年因此造成的稻谷损失达5-6亿公斤，因此，如何快速有效地鉴别假杂种是两系杂种优势利用的关键环节之一。紫叶性状是一种特殊的叶色标记性状，表达稳定且在整个生育期都易于识别，导入两系不育系后可有效便捷地解决杂交水稻繁制种中的假杂种鉴别问题。国内外已先后选育出带紫叶标记的不育系，如两系不育系中紫s、明紫-2s和明紫-3s、99h114紫s，三系不育系紫iia、先红a。但是这些选育的紫叶不育系均采用传统育种方法选育，存在选育进程较长且缺乏相对的精准性，需要构建较大的育种群体，育种成本高等问题。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明提供了一种紫色叶水稻两系不育系及其选育方法。本发明紫色叶水稻两系不育系为利用分子标记辅助选育，利用紫色突变体将紫色叶基因导入两系不育系中，培育出农艺性状优良且带紫色叶标记的新两系不育系。本发明方法可以缩短育种年限，提高选育的精准性，减小育种群体，降低育种成本，解决了现有带紫叶标记的不育系采用的传统育种方法存在选育进程较长且缺乏相对的精准性，需要构建较大的育种群体，育种成本高等问题，为两系杂交水稻繁制种中的排假除杂提供便利高效的方法。
4.本发明所采用的技术方案如下：一种紫色叶水稻两系不育系，由水稻紫色叶性状基因dfr和plr4的分子标记辅助选育。
5.进一步的，以上所述的紫色叶水稻两系不育系，所述水稻紫色叶性状基因dfr的分子标记引物序列为：
6.dfr-fc gaaggtgaccaagttcatgcttggagctggcggggtc；
7.dfr-fa gaaggtcggagtcaacggattctggagctggcggggta；
8.dfr-r2 tcctcgcccaggtcgg。
9.进一步的，以上所述的紫色叶水稻两系不育系，所述水稻紫色叶性状基因plr4的分子标记引物序列为：
10.plr4ldf tgtcgcaatttcttacaatc；
11.plr4ldr cgttacgccagactactacc。
12.以上所述的紫色叶水稻两系不育系的选育方法，包括以下步骤：
13.(1)以紫叶水稻材料先红b为父本与细长粒型的绿叶水稻泰丰b杂交得f1代种子；
14.(2)种植步骤(1)所得的f1代种子，植株全部为绿叶，与绿叶两系不育系08s杂交得复交f1代种子；
15.(3)种植步骤(2)所得的复交f1代种子，进行水稻紫色叶性状基因dfr、plr4的分子标记跟踪，选择其中的细长粒可育单株与绿叶两系不育系08s杂交得bc1f1代种子；
16.(4)种植步骤(3)所得的bc1f1代种子，进行dfr、plr4分子标记跟踪，选择其中的细长粒可育单株与绿叶两系不育系材料08s回交获得bc2f1代种子；
17.(5)种植步骤(4)所得的bc2f1代种子，选择农艺性状优良的细长粒紫叶不育单株，逐年种植自交株系至bc2f8；
18.(6)种植步骤(5)所得的bc2f8代种子，选择紫色叶、株叶型好、柱头外露率高、米质优的植株即为紫色叶两系不育系材料。
19.进一步的，以上所述的紫色叶水稻两系不育系的选育方法，所述步骤(3)中水稻紫色叶性状基因dfr的分子标记包括以下步骤：
20.s1、提取水稻植株的基因组dna；
21.s2、pcr扩增：将权利要求2所述的3条引物dfr-fc、dfr-fa和dfr-r2及两条通用荧光引物：#1：gaaggtgaccaagttcatgct；#2：gaaggtcggagtcaacggatt同时加入到pcr反应体系中，对水稻植株中的dfr基因进行扩增；
22.s3、将pcr产物在酶标仪中进行荧光信号值的快速读取，通过snp decoder工具进行基因分型，荧光扫描获得fam荧光信号的是紫叶相关的dfr等位基因类型材料，扫描获得hex荧光信号的是绿叶相关的dfr等位基因类型材料，扫描结果为红色信号，则表示该样品为杂合状态。
23.进一步的，以上所述的紫色叶水稻两系不育系的选育方法，所述步骤(3)中水稻紫色叶性状基因plr4的分子标记包括以下步骤：
24.r1、提取水稻植株的基因组dna；
25.r2、pcr扩增：将权利要求3所述的2条引物plr4ldf和plr4ldr同时加入到pcr反应体系中，对所述的水稻植株中的plr4基因进行扩增；
26.r3、将pcr产物在包含荧光染料gelred的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，读取条带，条带210bp的是紫叶相关的plr4等位基因类型材料，条带135bp的是绿叶相关的plr4等位基因类型材料，两条条带都存在则表示该样品为杂合状态。
27.更进一步的，以上所述的紫色叶水稻两系不育系的选育方法，所述水稻紫色叶性状基因dfr的分子标记步骤s2中的pcr反应体系为：
28.10μl：5μl 2
×
parms master mix，
29.0.15μl10 mm dfr-fc标记引物，
30.0.15μl10 mm dfr-fa标记引物，
31.0.4μl10 mm dfr-r2反向引物，
32.1μl模板dna，3.3μl ddh2o；
33.pcr反应程序为：
34.先94℃，3min；
35.再10个循环94℃，20sec，1min，退火温度从65℃开始，每个循环降低0.8℃；
36.最后30个循环94℃，20sec，57℃，1min。
37.更进一步的，以上所述的紫色叶水稻两系不育系的选育方法，所述水稻紫色叶性状基因plr4的分子标记步骤r2中的pcr反应体系为：
38.10μl：5μl 2
×
taq pcr mastermix，
39.0.15μl10 mm plr4ldf标记引物，
40.0.15μl10 mm plr4ldr标记引物，
41.1μl模板dna，3.7μl ddh2o；
42.pcr反应程序为：
43.先94℃，3min；
44.再30个循环94℃20sec，55℃20sec，72℃20sec；
45.最后72℃，5min。
46.以上所述的紫色叶水稻两系不育系的应用为在水稻育种方面的应用。
47.进一步的，以上所述的紫色叶水稻两系不育系的应用，所述应用为用于杂交水稻育种中种子纯度的鉴定、辅助去杂或自动排假。
48.本发明的有益效果在于：
49.1、本发明紫色叶水稻两系不育系为利用分子标记辅助选育而得，其与绿叶稻的杂种f1及其自交产生的植株在秧苗期乃至整个生长发育过程均呈现叶色差异，杂种f1植株表现为绿叶，而自交系产生的植株则表现为紫叶。该特性应用于杂交水稻育种中种子纯度的鉴定、辅助去杂或自动排假，在不育系繁殖的苗期阶段便可通过叶色识别轻易去除绿色叶混杂株，有效提高亲本纯度；与绿叶恢复系配制f1种子，能快速、直观、准确去除由于亲本自交而产生的杂株，有效提高田间杂种纯度。
50.2、本发明方法为利用分子标记辅助选育的方法，可以缩短育种年限，提高选育的精准性，减小育种群体，降低育种成本，克服了现有带紫叶标记的不育系采用的传统育种方法存在选育进程较长且缺乏相对的精准性，需要构建较大的育种群体，育种成本高等缺点。
附图说明
51.图1为紫色叶水稻两系不育系选育过程图。
52.图2为dfr基因分型图，图中：1为水稻紫叶的dfr基因型；2为水稻绿叶的dfr基因型。
53.图3为plr4基因连锁标记的多态性图。
54.图4为紫色叶水稻两系不育系桂紫s与绿色叶水稻两系不育系08s的植株对比图，图中：1为桂紫s，2为08s。
55.图5为紫叶标记在桂紫s不育系种子繁殖生产应用中的幼苗生长图，图中：1为绿叶的异交结实混杂种子产生的杂株。
56.图6为紫叶标记在桂紫s不育系在杂交组合制种生产应用中的幼苗生长图，图中：1为紫叶的自交结实的假杂种植株。
具体实施方式
57.下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围。
58.实施例1：dfr和plr4基因的分子标记
59.(1)水稻紫色叶性状基因dfr的分子标记
60.s1、提取水稻植株的基因组dna；
61.s2、pcr扩增：将3条引物：
62.dfr-fc gaaggtgaccaagttcatgcttggagctggcggggtc
63.dfr-fa gaaggtcggagtcaacggattctggagctggcggggta
64.dfr-r2 tcctcgcccaggtcgg
65.加入到pcr反应体系：
66.10μl：5μl 2
×
parms master mix，
67.0.15μl10 mm dfr-fc标记引物，
68.0.15μl10 mm dfr-fa标记引物，
69.0.4μl10 mm dfr-r2反向引物，
70.1μl模板dna，3.3μl ddh2o中；
71.设定pcr反应程序为：
72.先94℃，3min；
73.再10个循环94℃，20sec，1min，退火温度从65℃开始，每个循环降低0.8℃；
74.最后30个循环94℃，20sec，57℃，1min；
75.对水稻植株中的dfr基因进行扩增；
76.s3、将pcr产物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过snp decoder工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；
77.s4、根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得fam荧光信号的是紫叶相关的dfr等位基因(c)类型材料，扫描获得hex荧光信号的是绿叶相关的dfr等位基因(a)类型材料，荧光扫扫描结果为红色信号，则表示该样品为杂合状态(见图2)。
78.(2)水稻紫色叶性状基因plr4的分子标记：
79.r1、提取水稻植株的基因组dna；
80.r2、pcr扩增：将引物：
81.plr4ldf tgtcgcaatttcttacaatc
82.plr4ldr cgttacgccagactactacc
83.同时加入到pcr反应体系：
84.10μl：5μl 2
×
taq pcr mastermix，
85.0.15μl10 mm plr4ldf标记引物，
86.0.15μl10 mm plr4ldr标记引物，
87.1μl模板dna，3.7μl ddh2o中，
88.设定pcr反应程序为：
89.先94℃，3min；
90.再30个循环94℃20sec，55℃20sec，72℃20sec；
91.最后72℃，5min，
92.对水稻植株中的plr4基因进行扩增；
93.r3、将pcr产物在包含荧光染料gelred的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，读取条带，获得基因型结果；
94.r4、根据基因型结果进行分析，条带210bp的是紫叶相关的plr4等位基因类型材料，条带135bp的是绿叶相关的plr4等位基因(a)类型材料，两条条带都存在则表示该样品为杂合状态(见图3)。
95.实施例2：紫色叶水稻两系不育系桂紫s的选育
96.(1)2015年早季在南宁以紫叶水稻材料先红b为父本与细长粒型的绿叶水稻泰丰b杂交得f1代种子；
97.(2)2015年晚季种植f1，f1植株全部为绿叶，与绿叶两系不育系08s杂交得复交f1代种子；
98.(3)2016年早季种植步骤(2)所得的复交f1，dfr、plr4分子标记跟踪，选择其中细长粒可育单株与绿叶两系不育系08s杂交得bc1f1代种子；
99.(4)2016年晚季在南宁种植bc1f1，dfr、plr4分子标记跟踪，选择其中细长粒可育单株与绿叶两系不育系材料08s回交获得bc2f1代种子；
100.(5)2017年早季种植bc2f1，选农艺性状优良的细长粒紫叶不育单株40株，2017年晚季种植bc2f2。
101.(6)2017年晚季开始，南宁种植，早季植株孕穗后移植云南玉溪转育繁殖、晚季植株孕穗后移植三亚南繁基地转育繁殖，逐年种植自交株系。
102.(7)2020年晚季种植bc2f8，选农艺性状优良的紫色叶植株2株，对不育株进行花粉镜检，严格选择，选出紫色叶、株叶型好、柱头外露率高、米质优的材料作为两系不育系材料桂紫s(见图4)。
103.桂紫s的选育过程图示见图1。
104.实施例3：紫叶标记在桂紫s不育系种子生产上的应用
105.(1)2020年冬季，将南宁种植孕穗后的桂紫s植株移植三亚南繁基地转育繁殖，获得桂紫s自交结实种子；
106.(2)2021年早季，将步骤(1)的种子播种于广西农业科学院水稻所南宁试验田；
107.(3)待步骤(2)的植株生长至一心一叶期，对植株进行叶色鉴定；
108.(4)步骤(3)中植株叶色为绿色的鉴定为异交结实所获得的植株(见图5)，拔除绿叶植株，保证了桂紫s不育系的纯度。
109.实施例4：桂紫s在f1杂交种子生产上的应用
110.(1)2020年晚季，桂紫s与本团队自主选育的r998改良恢复系杂交获得f1代杂交种子；
111.(2)2021年早季，将步骤(1)的种子播种于广西农业科学院水稻所南宁试验田；
112.(3)待步骤(2)的植株生长至一心一叶期，对植株进行叶色鉴定；
113.(4)步骤(3)中植株叶色为紫色的鉴定为假杂种(见图6)，拔除紫叶植株，保证了杂交种子的纯度。