1.本发明涉及微生物的提取、鉴别及应用领域，具体的讲涉及一种蚯蚓体内的贝莱斯芽孢杆菌及应用。
背景技术：2.由于抗生素治疗动物疾病的高效性使其在养殖过程中占着举足轻重的地位。近年来，抗生素滥用导致耐药菌株出现，破坏生态系统，影响畜禽产品品质，人类作为动物源性食品的终端消费者，身体健康受到损害，因此迫切需要寻找替抗物质。益生菌是近年来的研究热点之一，主要通过提高饲料营养的利用率、免疫调节能力及调节肠道环境等为宿主动物机体健康发挥益生作用。芽孢杆菌作为饲用益生菌，具有增殖快、抗逆性强、抗菌谱广、生物安全性高，在恶劣环境中产生孢子，能分泌丰富的酶类及产生抗菌活性很强的次级代谢产物等优势，有促生长、调节肠道微生态平衡、抗菌、提高抵抗力的作用。而贝莱斯芽孢杆菌是2005年被西班牙学者发现的一种新型生防菌，目前被广泛用于生防、化工、医疗、洗涤等领域，尤其在植物健康与病虫害防控方面研究较广，但应用于畜禽的研究很少，本试验通过对贝莱斯芽孢杆菌的益生特性研究为其在畜牧业的发展提供可能，成为潜在的益生菌应用于畜禽生产。
技术实现要素：3.本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种能够提高动物免疫力的贝莱斯芽孢杆菌。
4.本发明目的是由以下技术方案实现的：
5.一种贝莱斯芽孢杆菌(y1菌株)命名为：贝莱斯芽孢杆菌7671菌株，7671菌株于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmcc：24121，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)。
6.本发明得到的一种贝莱斯芽孢杆菌的提取，包括如下步骤：
7.将蚯蚓置于75％酒精中做体表消毒，沿蚯蚓体表剪开取肠道内容物在lb培养基上涂布，培养12～24h，将培养出的菌纯化2～3代，将单菌落接入lb液体培养基培养12～18h。
8.进一步的，本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌制剂，
9.利用所述的7671菌株进行发酵，包括如下步骤：
10.1)菌种活化与扩培
11.将-80℃冰箱保存的7671菌株以1％比例接种于10ml液体培养基中进行一级活化，然后再以2％的接种量接种于含有50ml液体培养基中进行二级活化，37℃，200r/min，12h备用；
12.2)发酵培养基制备：将洗肠后的大平二号鲜蚯蚓匀浆，然后经60～65℃处理10min作为底物；
13.3)将步骤1)所得7671菌株均匀接种到5g步骤2)所得底物中；
14.4)向步骤3)所得产物加入5％葡萄糖，加入20倍蒸馏水，厌氧条件下发酵。
15.进一步的，所述步骤3)7671菌株的活菌数为：0.5～5
×
108cfu/ml，接种量为：1～5％。
16.进一步的，所述7671菌株的活菌数为1
×
108cfu/m，接种量为3％。
17.进一步的，所述步骤4)发酵条件为：培养温度：32～37℃、ph 6.0～7.0、时间：36～48h。
18.进一步的，所述培养温度：32℃、ph 7.0、时间：36h。
19.本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌的应用，所述的7671菌株可用于制备畜禽育肥及提高畜禽的抗氧化及免疫功能的菌制剂。
20.进一步的，7671菌株可用于制备育肥猪及提高猪的抗氧化及免疫功能的菌制剂。
21.动物胃肠道菌群随着胃肠液的ph的变化而变化，同时胃肠液内又含有胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆盐等物质，贝莱斯芽孢杆菌y1若在胃肠道增殖，就要耐受胃肠道环境，保证有足够的活菌数发挥作用。试验结果表明该菌6～12h增殖较快，12～27h生长稳定且对胃肠液及胆盐的耐受效果较好，能抵御消化道胃蛋白酶、胰蛋白酶及胆汁的破坏，保证了y1菌在肠道内能够迅速增殖，为其在畜禽肠道发挥作用提供时间基础。相比刘韶娜研究的贝莱斯芽孢杆菌b13在16～24h处于稳定期，y1菌的稳定期更长，使其在肠道内有足够的时间增殖并产生酶类及次级代谢产物，从而发挥调节肠道微生态环境的作用。
22.在畜禽养殖过程中，抗生素滥用造成了耐药菌株的产生，益生菌是一种优质饲料添加剂，益生菌与抗生素若要联合使用必须考虑两者有无拮抗作用。实验结果表明，贝莱斯芽孢杆菌y1对环丙沙星、头孢羟氨苄、氟苯尼考、替米考星、庆大霉素高度敏感，在饲喂畜禽益生菌添加剂时应避免使用此类敏感药物；对阿莫西林、青霉素g、氨苄西林不敏感，两者可以配合使用，y1菌能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长繁殖，刘韶娜研究表明贝莱斯芽孢杆菌b13不仅能抑制这两种菌，还对鼠伤寒沙门氏菌有抑制效果，还能提高猪肠道内乳杆菌属等益生菌的相对丰度，显著降低链球菌属等条件致病菌的相对丰度，相比之下y1菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果要优于菌b13。
23.cat可以清除体内活性氧，通过快速转化h2o2以减少机体的损害；gsh-px是机体广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰，这两种酶维持着机体的氧化平衡，保护细胞免受氧化损伤；生物体内，自由基作用于脂质发生过氧反应，氧化终产物为丙二醛，具有细胞毒性，mda含量则反映脂质过氧化程度，间接反映细胞受损伤程度；t-aoc可以衡量机体自由基清除能力，在机体中广泛存在，通过清除体内产生的各类活性氧及自由基来减少氧化应激产生的有害物质。一个体系内的所有抗氧化物质水平体现该体系的总抗氧化能力，t-aoc越高，机体防御力越强。因此测定t-aoc含量具有生物学意义。
24.本发明结果显示，试验前试验组与空白组的抗氧化因子均无显著性差异，与对照组相比，第30d的试验组yz与yg组mda显著降低，yz与yg组gsh-px显著增高，yd、yz、yg组t-aoc显著增高，yz和yg组cat(过氧化氢酶)也显著增高，抗氧酶增高可以提高机体清除自由基的能力，从而提高抗氧化功能。在育肥猪日粮中添加贝莱斯发酵蚯蚓浆1％、3％、5％均可以不同程度的提高肥育猪的抗氧化功能，添加5％的含量综合抗氧化效果最好。
25.免疫指标检测结果表明，与对照组相比，第30d试验组iga、igg、tnf-α均有显著增高(p＜0.05或p＜0.01)，说明饲喂贝莱斯芽孢杆菌发酵蚯蚓浆可以提高育肥猪的免疫水平，从而增强免疫力。
26.本发明的有益效果
27.本发明的贝莱斯芽孢杆菌7671菌株具有抗菌谱广、生长迅速、抗逆性强、热稳定好和生物安全性高等优点，从而作为益生菌在农业、食品、医学、林业、环保等方面被广泛研究。本发明的贝莱斯芽孢杆菌y1抑菌效果好、耐酸耐胆盐抗逆好、生长迅速和生物量较高等优点，同时该菌作为好氧菌，进入动物体内，可以快速好氧，抑制有害菌的生长，为肠道有益菌群提供一个厌氧的微环境。通过益生特性研究和安全性评价，可用于畜禽育肥。通过临床试验可提高畜禽的生长性能，增强畜禽的抗氧化能力和改善其免疫能力。本发明贝莱斯芽孢杆菌y1可作为一种潜在的益生菌添加剂应用于畜禽生产具有使用成本低、对人畜安全的特点。
附图说明
28.图1为y1菌基因的pcr扩增，dl-2 000dna相对分子质量标准，1～2:样品y1的基因片段；
29.图2为y1菌16s rdna序列系统发育树；
30.图3为y1菌gyrb基因序列系统发育树；
31.图4为y1菌的菌落形态、革兰氏染色镜检及扫描电镜结果，a:y1菌tsa培养基宏观形态；b:y1菌光学显微镜镜检结果(10
×
100)；c:y1菌电子显微镜镜检结果；
32.图5为贝莱斯芽孢杆菌y1生长曲线；
33.图6为y1菌耐胆盐结果；
34.图7为y1菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌结果。
35.图8为溶血试验结果，a.金黄色葡萄球菌；b.贝莱斯芽孢杆菌y1。
36.图9为各组抗氧化指标结果。
具体实施方式
37.实施例1
38.贝莱斯芽孢杆菌的提取及纯化
39.将蚯蚓置于75％酒精中做体表消毒，沿蚯蚓体表剪开在lb培养基上涂布，培养12～24h，将培养出的菌纯化2～3代，将单菌落接入lb液体培养基培养12～18h。
40.实施例2
41.革兰染色、镜检
42.对培养12h的菌进行革兰氏染色并在光学显微镜下镜检，培养基宏观形态见图4a所示，利用成像系统拍照如图4b所示；收集培养12h的菌体，加戊二醛4℃固定过夜。离心收集菌体，经磷酸盐缓冲液漂洗后进行乙醇梯度脱水，然后二氧化碳临界点干燥，喷金后，使用扫描电镜hitachi su8010进行菌体形态观察，如图4c所示。
43.结论：y1菌在tsa培养基上菌落呈黄色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐，在液体培养基形成薄菌膜；镜检菌体为短杆状，可产生芽孢。
44.实施例3
45.生理生化鉴定
46.根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》(9版)对分离菌的种属进行初步鉴定，结果见表1。
47.表1
[0048][0049]
结论：y1菌能够利用葡萄糖、甘露醇、棉子糖、果糖、麦芽糖、古老糖、d-海藻糖、d-核糖；能水解淀粉和七叶苷，产生明胶酶和过氧化氢酶，能在6.5％的氯化钠中生长；不能产生硫化氢，不能利用l-鼠李糖、d-松三糖和d-半乳糖。
[0050]
实施例4
[0051]
分子生物学鉴定
[0052]
对该菌株进行16s rrna基因序列测序，pcr扩增产物送于生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，结果在ncbi核酸数据库中进行blast比对，利用mega 7.0软件构建其系统进化树。
[0053]
鉴定候选菌株的16s rrna基因序列鉴定基因片段约为1 500bp，凝胶电泳目的条带如图1所示，将序列在ncbi核酸数据库进行比对发现y1与贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)的相似率达到99.93％，利用mega 7.0软件构建其系统进化树，如图2。
[0054]
实施例5
[0055]
绘制生长曲线
[0056]
按1％的接种量接种于lb液体培养基，200rpm培养30h，每隔3h取样并检测菌液od
600
值，以时间t为横坐标、od
600
值为纵坐标绘制该菌的生长曲线，如图5所示。
[0057]
结论：y1菌迟缓期很短，6～12h为对数期，15～27h处于稳定期且时间较长，27h后
进入衰退期。
[0058]
实施例6
[0059]
胃肠液耐受试验
[0060]
人工胃液、人工肠液按照按《中国药典》2015年版第四部配制。取菌悬液分别加到人工胃液和人工肠液中，180rpm培养10h，每隔两小时取样进行平板菌落计数，计算存活率。存活率(％)＝n
t
/n0×
100％，其中n
t
为结束时的活菌数，n0为起始的活菌数，结果如表2。
[0061]
结论：
[0062]
y1菌在人工胃肠液中活菌数随孵育时间延长呈逐渐递减趋势，孵育10h的活菌数显著降低(p＜0.05)，y1菌在人工胃液、肠液的中培养10h存活率分别达到60.40％和61.60％，说明y1菌株对人工胃液和人工肠液有较好的耐受性，能够抵御胃蛋白酶和胰蛋白酶的破坏。
[0063]
表2
[0064][0065]
实施例7
[0066]
胆盐耐受试验
[0067]
将菌悬液按1％接种量接种到含有0.3％牛胆盐的液体培养基中，以不含牛胆盐的试管作为对照管，培养10h，每隔1h取样，测定od
600
值，绘制生长曲线。
[0068]
如表3、图6所示，
[0069]
表3
[0070][0071]
结论：
[0072]
y1菌在含有0.3％胆盐的培养基中生长呈递增趋势，随着孵育时间延长活菌数显著增高(p＜0.05)，表明y1菌株对0.3％胆盐有较好的耐受性，而动物小肠中胆汁盐含量波
动范围在0.03％～0.3％，说明贝莱斯芽孢杆菌y1可以在肠道存活。
[0073]
实施例8
[0074]
体外抑菌试验
[0075]
试验方法参照牛津杯法，37℃培养12h，观察并测量抑菌圈直径。结果如表4和图6所示。
[0076]
结论：y1菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有显著抑制效果，对大肠杆菌的抑菌圈直径达到21.33
±
1.53mm(p＜0.05)对金黄色葡萄球菌可达15.67
±
1.53mm(p＜0.05)。
[0077]
表4
[0078][0079]
实施例9
[0080]
药敏试验
[0081]
将含有定量抗生素的药敏纸片(直径为6mm)，放在涂有菌液的培养基表面，培养24h，观察并测量抑菌圈直径，结果见表5。
[0082]
结论：可见y1对环丙沙星、头孢羟氨苄、氟苯尼考、替米考星庆大霉素高度敏感，尤其对头孢羟氨苄抑菌直径可达到40mm，对氨苄西林、羟氨苄青霉素、及青霉素耐药，发现y1菌对大多数β-内酰胺类药物都有抗性。
[0083]
表5
[0084][0085]
实施例10溶血试验
[0086]
蘸取该菌菌悬液扇形划线接种于绵羊血平板培养基，37℃倒置培养12h，观察有无溶血圈，金黄色葡萄球菌作为阳性对照，试验结果显示(见图8)。
[0087]
结论：金黄色葡萄球菌在绵羊血平板上出现明显β-溶血环(图8a)，y1菌则无溶血圈(图8b)，说明y1菌无溶血作用。
[0088]
实施例11
[0089]
动物安全性实验
[0090]
对照组与实验组各五只小鼠，实验组小鼠饲喂新鲜菌液，对照组常规饲养，观察记录其精神、行动、体重、食欲、排泄等变化。
[0091]
在菌浓度1
×
108cfu/ml饮水饲喂情况下，小鼠未出现死亡情况，体态、毛色并无显著差异，仍健康活泼，km小鼠未出现死亡现象以及病理毒性反应。30d剖杀，小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官组织无肉眼可见病变，对各组小鼠的脏器指数进行分析。表6结果显示，与对照组相比，试验组小鼠脏器指数无显著差异(p＞0.05)。
[0092]
表6
[0093]
(n＝10)％
[0094][0095]
结论：试验组均未出现死亡或患病情况，精神状态及行为活动正常，被毛良好不粗糙，采食、饮水、排泄均正常，证明分离菌株安全无毒。
[0096]
实施例12
[0097]
猪体内试验
[0098]
将洗肠后的大平二号鲜蚯蚓匀浆，以蚯蚓浆为底物，将贝莱斯芽孢杆菌(活菌数为1
×
108cfu/ml)菌株以3％接种量均匀的添加到5g蚯蚓浆底物中，加入5％葡萄糖，加入20倍蒸馏水，厌氧条件下发酵48h。
[0099]
试验分组与处理
[0100]
选择选用体重相近(约为40kg)的20头大长白健康育肥猪为试验对象，试验时间为2021年8月～9月。
[0101]
试验条件：自然温度，自由饮水，每日下午五点上料。
[0102]
对照组：饲喂基础日粮(k)
[0103]
试验组：饲喂基础日粮+1％发酵产物(yd)
[0104]
饲喂基础日粮+3％发酵产物(yz)
[0105]
饲喂基础日粮+5％发酵产物(yg)
[0106]
试验开始前，对猪舍栏位、地面、设备、料筒、饮水器等彻底清洗消毒。试验猪进行人工投料饲喂，自由采食，检测并记录猪的表观状况，粪便情况，生长性能。
[0107]
生产性能
[0108]
试验开始后，每天记录各组的日采食量，计算平均日采食量、平均日增重、料重比。结果见表7。
[0109]
结论：由表7可知，试验组与对照组猪群的日采食量、日增重及料重比均无显著性
差异(p＞0.05)。
[0110]
表7
[0111]
(n＝5)/kg
[0112][0113]
抗氧化指标
[0114]
各组随机选择3头猪分别在试验开始前(第0d)和试验结束(第30d)采血，用市售试剂盒测血清中抗氧化指标：mda、gsh-px、cat、t-aoc，按照说明书进行操作，各做3个复孔。结果见图9。
[0115]
结论：由图9结果可以看出，第0d试验组mda、gsh-px、cat、t-aoc的含量与空白组相比均无显著变化(p＞0.05)；第30d各试验组与对照组相比，yd、yz、yg的mda含量均显著降低(p＜0.05或p＜0.01)，yz与yg组的gsh-px含量均极显著升高(p＜0.01)；yz与yg组cat含量均极显著升高(p＜0.01)，yd、yz、yg组的总抗氧化能力(t-aoc)均显著升高(p＜0.05或p＜0.01)。
[0116]
血常规检测
[0117]
各组随机选择3头猪分别在第0d、30d采血，用动物血细胞分析仪检测猪血常规各指标，各做3个重复，结果见表8。
[0118]
表8
[0119]
(n＝5)
[0120][0121]
结论：试验组血常规各指标与对照组相比，均无显著差异(p＞0.05)，均在正常范
围之内。
[0122]
免疫指标
[0123]
各组随机选择3头猪分别在第0d、30d采血，使用elisa试剂盒检测血清il-2、il-8、ifn-γ、tnf-α、iga、igg、igm的含量，按照说明书操作，各做3个重复，结果见表9。
[0124]
结论：试验第0d试验组所有检测指标均与对照组无显著差异(p＞0.05)；试验结束的第30d试验组猪血清中il-2、il-8、ifn-γ、及igm的含量与对照组相比均无显著性差异(p＞0.05)，而yz组与yg组的iga、igg和tnf-α含量均显著高于对照组(p＜0.05或p＜0.01)。
[0125]
表9
[0126]
(n＝5)
[0127][0128]
结论：试验第0d试验组所有检测指标均与对照组无显著差异(p＞0.05)；试验结束的第30d试验组猪血清中il-2、il-8、ifn-γ、及igm的含量与对照组相比均无显著性差异(p＞0.05)，而yz组与yg组的iga、igg和tnf-α含量均显著高于对照组(p＜0.05或p＜0.01)。
[0129]
通过猪体内试验可以看出，虽然试验只有一个月，没有看出育肥效果，但是抗氧化和机体防御能力明显提高，因此长远来看育肥效果肯定不会太差。