一种具有防治多种植物病原真菌效果的生防菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物工程技术领域，特别涉及一种具有防治多种植物病原真菌效果的生防菌株及其应用。


背景技术：

2.全球约有15％的作物产量受到植物病害而造成损失，其中约70％～80％的作物病害是受土传真菌侵染所致，土传真菌在土壤中或作物残余物中以菌核、分生孢子等抗性繁殖体在不良环境中存活，并且具有广泛的寄主范围，通过分泌降解酶或毒素杀死寄主组织，同时产生菌丝体从寄主中吸收养分，进而导致植物萎蔫、发病或坏死。土传真菌病害隐蔽性、传染性、爆发性和毁灭性极强，并且会随着空气、雨水、灌溉、农事操作等途径进行传播，在温湿度适宜时，短期内就会造成病害的流行和爆发。
3.生物防治是利用生防微生物抑制病原菌生命活力或繁殖能力的方法，因其环境友好的特点，在近几十年来成为防治土传病原真菌病害的研究热点。其中利用生防细菌(如芽孢杆菌、假单胞菌等)是防治土传真菌的主要手段之一，通过其具有的竞争作用、拮抗作用、寄生作用、诱导植物抗性或产生一些挥发性物质、细胞裂解酶和次级代谢产物等抗菌物质的方式抑制土传真菌病原体，能有效防治土传真菌病害。目前大多数生防细菌在土壤中定植能力差、存活率低、抗病效果不稳定，在混合土传真菌造成的植物病害防治过程效果不理想。


技术实现要素：

4.本发明针对常见土传病原真菌，提供一株具有防治多种病原真菌效果的生防芽孢杆菌 bacillus velezensis ber1及其应用。不仅对土壤中常见病原真菌具有较好的拮抗效果，并且对真菌病害有显著防治效果。
5.本发明的目的通过如下的技术方案来实现：
6.一种具有防治多种植物病原真菌效果的生防菌株，该生防菌株名称为贝莱斯芽孢杆菌 ber1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年9月 13日，保藏编号为cgmcc no.23398，分类命名为：贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis。
7.一种如上所述的生防菌株的应用，其特征在于，所述生防菌株用于防治马铃薯干腐病菌、西瓜枯萎病菌、番茄立枯病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜根腐病菌、辣椒疫病菌引起的病害。
8.进一步地，所述黄瓜根腐病菌为瓜类腐皮镰孢，黄瓜枯萎病菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型，西瓜枯萎病菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型。
9.进一步地，所述生防菌株用于防治病害的浓度为5
×
106cfu/ml。
10.一种生防菌剂，该生防菌剂由上述的生防菌株制备得到。
11.进一步地，所述生防菌剂为所述的生防菌株通过液体发酵培养后获得的发酵液，
其活菌数为1
×
109cfu/ml。
12.进一步地，所述发酵液的制备方法为：将生防菌在luria-bertani固体培养基上活化后，以5％v/v接种量接种于luria-bertani液体培养基中，培养36小时，即获得发酵液。
13.本发明的有益效果如下：
14.本发明的具有防治多种真菌病害的生防芽孢杆菌bacillus velezensis ber1，具有对多种病原真菌拮抗功能，具有广谱抗性，对环境无污染，且易于工业化生产。
附图说明
15.图1为本发明的ber1对多种土传病原真菌拮抗效果示意图；
16.图2为本发明的ber1的系统发育树；
17.图3为生防菌剂ber1对马铃薯干腐病发病率影响的柱状图。
具体实施方式
18.下面根据附图和优选实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明白，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
19.本发明的具有防治多种植物病原真菌效果的生防菌株的筛选和测序过程如下：
20.1、番茄根际拮抗细菌的分离
21.从苏州市复合病害发生的番茄园中采集健康番茄根际土壤，按照1:10质量比添加121℃灭菌的0.85％nacl，在28℃180转速培育3小时，后稀释10倍后涂布于lb平板上，于37℃培养24小时，挑取菌落形态不同的细菌分离纯化，将纯化的菌株-20℃甘油管保存。
22.2、拮抗根际细菌的筛选
23.采用平板对峙法测定根际细菌抑制真菌活性的能力，具体方法为：将土传病原真菌(马铃薯干腐病菌、西瓜枯萎病菌、番茄立枯病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜根腐病菌、辣椒疫病菌)，在固体pda培养基上培养5～7天后，用直径5mm打孔器切取病原真菌菌碟，将真菌菌碟置于pda培养基中央，在距离菌碟3cm处点10ul经步骤1分离纯化后的单菌落发酵液(5
×
108cfu/ml)，将培养皿放置在25℃培养5天，筛选出对病原真菌具有拮抗作用的菌株。图1所示，其中一株贝莱斯芽孢杆菌(命名为ber1)对马铃薯干腐病菌、西瓜枯萎病菌、番茄立枯病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜根腐病菌、辣椒疫病菌均有显著的拮抗能力，表明ber1对这些病原真菌具有潜在的防治能力。
24.3、菌株gyrb基因序列分析鉴定
25.gyrb基因扩增引物和反应条件参考satoshi等方法(yamamoto s和harayama s,1995)。将gyrb基因扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，gyrb序列在 genbanl数据库中用ncbi-blast软件进行同源性比较。取同源性较高的序列，用mega 5.0 软件构建系统发育树。经鉴定菌株ber1为贝莱斯芽胞杆菌(bacillus velezensis)(图2)。于2021 年9月13日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.23398。ber1的gyrb基因序列详见基因序列表 seq id no.1。
26.下面通过几个实施例来说明本发明的具有防治多种植物病原真菌的生防菌株用于分别用于防治马铃薯干腐病菌、西瓜枯萎病菌、番茄立枯病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜根腐
病菌、辣椒疫病菌的效果。
27.实施例1 ber1发酵液用于防治储藏期马铃薯干腐病
28.1、贝莱斯芽孢杆菌ber1菌液制备
29.将贝莱斯芽孢杆菌接种一环至100ml lb液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， nacl 10g，蒸馏水1 000ml，调节ph至7.0)中，37℃、220转/min培养18小时，获得高活性贝莱斯芽孢杆菌发酵液，检测发酵液浓度在109cfu/ml以上。
30.2、病原真菌孢子悬浮液制备
31.在pda(马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，自然ph，蒸馏水1 000ml)平板培养马铃薯干腐病病原真菌7天后，用无菌手术刀将pda平板上培养的病原真菌轻轻刮取，并用 10ml无菌水冲洗，用纱布滤除菌丝体制成分生孢子悬浮液，用血球计数板板计数，并用无菌水并将浓度调至5
×
107个/ml左右。
32.3、种薯接种生防菌对储藏期马铃薯干腐病的防治
33.在马铃薯种植前将块茎在5
×
108cfu/ml发酵菌液中浸泡5min，后种植于田间，作为处理组。以不浸泡菌液的马铃薯块茎为阴性对照。每个处理设置独立的3垄进行实验。在马铃薯收获后在两个处理组中各随机挑取5次，每次全取50颗马铃薯。将挑取的薯块随机置于 20℃干燥的环境，并预先在空气中喷洒马铃薯干腐病菌(茄病镰孢，fusarium solani(mart.) sacc.)中，存放42天后观察薯球表面病症，并切开薯球，观察是否发病。计算发病率。最终的统计结果如图3所示。相对于未接种菌剂的情况，接种菌剂后，马铃薯干腐病的发病率显著降低，下降约60％。
34.实施例2 ber1发酵液对黄瓜根腐病的防治实验
35.1、贝莱斯芽孢杆菌ber1菌液制备
36.将贝莱斯芽孢杆菌接种一环至100ml lb液体培养基中，37℃、220转/min培养18小时，获得高活性贝莱斯芽孢杆菌发酵液，检测发酵液浓度在109cfu/ml以上。
37.2、病原真菌孢子悬浮液制备
38.在pda平板培养黄瓜根腐病病原真菌7天后，用无菌手术刀将pda平板上培养的病原真菌轻轻刮取，并用10ml无菌水冲洗，用纱布滤除菌丝体制成分生孢子悬浮液，用血球计数板板计数，并用无菌水并将浓度调至5
×
107个/ml左右。
39.3、温室实验验证ber1对黄瓜根腐病的防治效果
40.将穴盘中黄瓜幼苗培养至3叶期后移栽至容积约为350cm3的一次性塑料杯中(基质为东北黑土：蛭石：珍珠岩，按照3:1:1比例均匀混合)，每个塑料杯1株苗，移栽当天接种 20ml ber1(5
×
108cfu/ml)菌液，同时接种20ml 5
×
107个/ml黄瓜根腐病病原真菌孢子。其中黄瓜根腐病为瓜类腐皮镰孢(fusarium solani(mart.)app.et wollenw.f.cucurbitaesnyderet hansel.)，阴性对照组接种等量无菌水，阳性对照组接种等量4％春雷霉素，每个处理包含24棵幼苗。幼苗在16h/8h光周期，25℃温度，80％相对湿度的温室条件下生长，接种病原菌后每天观察其发病情况，15天后统计防病效果。
41.黄瓜根腐病病情指数调查及防效计算：接种病原菌后15d对黄瓜根腐病的发生情况进查。
42.黄瓜根腐病的分级标准：
43.0级，植株生长良好；
44.1级，胚轴或子叶上出现轻微症状，但生长正常；
45.2级，胚轴或子叶上出现明显的坏死斑，或1片子叶黄化，生长受到一定影响；
46.3级，坏死斑引起局部性萎蔫，或1片子叶枯死，或生长僵化；
47.4级，整体萎蔫，倒伏枯死。
48.实施例3 ber1发酵液对西瓜枯萎病的防治实验
49.1、贝莱斯芽孢杆菌ber1菌液制备
50.将贝莱斯芽孢杆菌接种一环至100ml lb液体培养基中，37℃、220转/min培养18小时，获得高活性贝莱斯芽孢杆菌发酵液，检测发酵液浓度在109cfu/ml以上。
51.2、病原真菌孢子悬浮液制备
52.在pda平板培养西瓜枯萎病病原真菌7天后，用无菌手术刀将pda平板上培养的病原真菌轻轻刮取，并用10ml无菌水冲洗，用纱布滤除菌丝体制成分生孢子悬浮液，用血球计数板板计数，并用无菌水并将浓度调至5
×
107个/ml左右。
53.3、温室实验验证ber1发酵液对西瓜枯萎病的防治效果
54.将穴盘中西瓜幼苗培养至3叶期后移栽至容积约为350cm3的一次性塑料杯中(基质为东北黑土：蛭石：珍珠岩，按照3:1:1比例均匀混合)，每个塑料杯1株苗，移栽当天接种 20ml ber1(5
×
108cfu/ml)菌液，同时接种20ml 5
×
107个/ml西瓜枯萎病病原真菌孢子。西瓜枯萎病为尖孢镰刀菌西瓜专化型(fusarium oxysporumf.sp.hiveum(e.f.smith)wollen)。阴性对照组接种等量无菌水，阳性对照组接种等量4％春雷霉素，每个处理包含24棵幼苗。幼苗在16h/8h光周期，25℃温度，80％相对湿度的温室条件下生长，接种病原菌后每天观察其发病情况，15天后统计防病效果。
55.西瓜枯萎病的病情分5级。
56.0级:植株外表无症状；
57.1级:植株1/3以下叶面积萎蔫；
58.2级:植株1/3～2/3叶面积萎蔫；
59.3级:植株2/3以上叶面积萎蔫或仅生长点存活；
60.4级:整株枯死。
61.实施例4 ber1发酵液对黄瓜枯萎病的防治实验
62.1、贝莱斯芽孢杆菌ber1菌液制备
63.将贝莱斯芽孢杆菌接种一环至100ml lb液体培养基中，37℃、220转/min培养18小时，获得高活性贝莱斯芽孢杆菌发酵液，检测发酵液浓度在109cfu/ml以上。
64.2、病原真菌孢子悬浮液制备
65.在pda平板培养西瓜枯萎病病原真菌7天后，用无菌手术刀将pda平板上培养的病原真菌轻轻刮取，并用10ml无菌水冲洗，用纱布滤除菌丝体制成分生孢子悬浮液，用血球计数板板计数，并用无菌水并将浓度调至5
×
107个/ml左右。
66.3、温室实验验证ber1对黄瓜枯萎病的防治效果
67.将穴盘中黄瓜幼苗培养至3叶期后移栽至容积约为350cm3的一次性塑料杯中(基质为东北黑土：蛭石：珍珠岩，按照3:1:1比例均匀混合)，每个塑料杯1株苗，移栽当天接种 20ml ber1(5
×
108cfu/ml)菌液，同时接种20ml 5
×
107个/ml黄瓜枯萎病病原真菌孢子。黄瓜枯萎病菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)。阴性对
照组接种等量无菌水，阳性对照组接种等量4％春雷霉素，每个处理包含24棵幼苗。幼苗在16h/8h光周期，25℃温度，80％相对湿度的温室条件下生长，接种病原菌后每天观察其发病情况，15天后统计防病效果。
68.黄瓜枯萎病病情分级标准如下：
69.0级，生长正常；
70.1级，叶片或萎蔫面积由下而上占全株的1/4，或不足1/4；
71.2级，叶片或萎蔫面积由下而上占全株的1/2；
72.3级，叶片或萎蔫面积由下而上占全株的3/4；
73.4级，病株的叶全部萎蔫或整株死亡。
74.实施例2～4中，15天后按照如下公式计算病情指数及防效
75.病情指数(％)＝∑(病情级数
×
该级病情株数)/(病情最高级值
×
总株数)
×
100。
76.生防效果＝(对照病害严重度－处理病害严重度)/对照病害严重度
×
100。
77.实施例2～4的温室实验验证的贝莱斯芽孢杆菌ber1对三种土传病原真菌的防效效果如表1所示。
78.表1贝莱斯芽孢杆菌ber1对三种土传病原真菌的防效效果表
[0079][0080]
从表1中可以看出，相对于清水对照组而言，接种贝莱斯芽孢杆菌ber1后，病害严重度降低了一半，其防效在51-55％之间；同时相对于市面上常用的4％春雷霉素，接种贝莱斯芽孢杆菌ber1后，病害严重度降低了20％左右，相对防效提高了约25％左右。
[0081]
本领域普通技术人员可以理解，以上所述仅为发明的优选实例而已，并不用于限制发明，尽管参照前述实例对发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在发明的精神和原则之内，所做的修改、等同替换等均应包含在发明的保护范围之内。