一株巨大芽孢杆菌及在茶树上的应用的制作方法

1.本发明属于农业微生物领域，具体涉及一株巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cy32 及在茶树上的应用。


背景技术：

2.茶叶是全球重要的经济作物，主要种植在亚洲和部分非洲及北美地区。我国是世界第一大产茶国。
3.茶树多生长在温暖、湿润的热带和亚热带地区，这些地区的气候也有利于茶树病害的滋生。茶饼病和轮斑病是茶叶的两种重要病害，在全世界茶叶种植区均有报道，在我国茶区也普遍发生，可造成茶叶大幅度减产，品质下降，严重影响茶叶生产。其中，茶饼病病原菌为坏损外担菌exobasidium vexans，属于专性寄生菌，不能离体培养，这为该病害的研究带来了难度。目前有报道pseudomonas fluorescens pf1对茶饼病田间具有一定的防控效果，但 pseudomonas这类生防菌以营养体形式存在，无芽胞，造成货架期较短，推广应用存在很大困难，另外有枯草芽孢杆菌bacillus subtilis b-9报道对茶饼病病原菌有一定抑菌活性。目前茶饼病国内只有多抗霉素一种农药获得登记。
4.茶轮斑病主要由拟盘多毛孢属真菌(pestalotiopsis spp.)引起，sanjay等从茶园土壤中分离哈慈木霉(trichoderma harzianum)、绿粘帚霉(gliocladium virena)和荧光假单胞杆菌(pseudomonas fluorescens)，田间防治效果均在40％以下，效果不甚理想。另外有报道贝莱斯芽孢杆菌cy30对茶轮病有一定的防效，目前无茶轮斑病的登记药剂。
5.使用化学杀菌剂仍是生产上防治茶饼病和轮斑病的主要手段，但是化学杀菌剂的施用极易引起病菌抗药性，同时会造成农药残留和环境污染。
6.施肥是影响茶叶品质与产量、土壤可持续利用的关键农业措施之一，肥料对茶叶的提质增效的效果十分显著。传统茶园以施用尿素、复合肥等速效化肥为主，并且化肥施用量较大，造成土壤酸化、板结导致了茶叶品质下降等问题，生产上亟需解决上述问题。
7.芽孢杆菌是一类好氧或兼型厌氧、产生抗逆性内生胞子的杆状细菌，由于能够产生脂肽类和蛋白类等抗真菌物质，具有广谱抗真菌活性和良好的稳定性，已成为重要的农业生防菌。同时能分泌促生物质及改善土壤微生物菌群，促进氮磷钾吸收及增产，是一种安全、环保和经济效益高且长效的措施。
8.巨大芽孢杆菌目前已报道对多种病菌具有生防效果，但其抑菌原理并不是特别明确。目前大部分的报道，其对病菌的抑制种类只有一两种，cn111793571a，公开了一株相对来说抑菌谱更大的巨大芽孢杆菌，其主要对真菌，特别是尖孢镰刀菌、香蕉枯萎病菌、青霉，毛霉等有良好的抑制率，达到了93％以上，而对细极链格孢的抑制率仅为27％。
9.针对上述问题，本发明从茶树根际土壤分离筛选一株巨大芽孢杆菌cy32，该生防菌对茶饼病和轮斑病的具有极佳的防控效果、还具备茶树根际定殖能力和茶树促生增产作用。从抑菌效果来看，本发明的菌株特异性的针对茶拟盘多毛胞(pestalotiopsis theae)的抑制率达到了92.34％，而对尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)的抑制率仅为21.68％，
说明本发明提供菌株的有效抑菌物质与cn111793571a中的巨大芽孢杆菌fjw1分泌得不同。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供了一株分离的巨大芽孢杆菌，所述的巨大芽孢杆菌命名为巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cy32，保藏编号为：cctcc no:m 20211409。
11.一株分离的巨大芽孢杆菌的应用，该菌株可用于制备成适用于茶树的微生态制剂。该制剂可用于防治茶饼病和轮斑病，促进茶叶生长。
12.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
13.一株分离的巨大芽孢杆菌，通过对茶轮斑病筛选获得，通过16s rdna比对结合生理生化鉴定确定为巨大芽孢杆菌，该菌株已于2021年11月15日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cy32；保藏编号为：cctcc no: m 20211409；地点：中国，武汉，武汉大学。
14.该菌在na培养基菌落生长良好，菌落乳白色(图1)。
15.巨大芽孢杆菌cy32的制备方法，其步骤包括：
16.1)一级种子培养：500ml三角瓶中装有100ml一级种子培养基，115℃-121℃湿热灭菌 15-30min，取cy32冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在28℃-35℃，180rpm摇床振荡培养8-10h；一级种子培养所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5％-3％，牛肉膏0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，氯化钠0.3-1％，培养基ph为6.5-7.5；
17.2)二级种子培养：500l发酵罐中装有200l或350l二级种子培养基，115℃-121℃湿热灭菌15-30min，将200ml一级种子接种于二级种子培养基中；在28℃-35℃培养8～10h；控制罐压0.02mpa-0.05mpa，搅拌转速150-200rpm，通气比1:0.5-1.0，二级种子培养所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5％-3％，酵母抽提物0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，磷酸二氢钾0.001％-0.005％，硫酸镁0.01％-0.04％，培养基ph6.5-7.5；
18.3)发酵：1吨或10吨发酵罐中装有0.6吨或6吨cy32发酵培养基，121℃湿热灭菌 20-30min，将200l或350l二级种子液移种于发酵培养基中，控制罐压0.02mpa-0.05mpa，搅拌转速100-150rpm，通气比1:0.5-1.0，在28℃-35℃培养26-32h；发酵所用培养基的原料及用量为：玉米粉2.0％-3.0％、糖蜜1.0％-2.0％、花生粕1.5％-2.5％、酵母提取物 0.5％-1.5％、磷酸二氢钾0.005％-0.015％、硫酸镁0.02％-0.04％、碳酸钙0.05％-0.15％，培养基ph6.5-7.5；
19.4)芽胞脱落20-40％时结束发酵。
20.巨大芽孢杆菌cy32在制备茶树微生态制剂中的应用，包括用于防治茶树茶饼病或轮斑病，同时还有促进茶叶生长的作用。
21.巨大芽孢杆菌cy32在制备植物病原菌抑制剂中的应用，特别是用于制备防治茶饼病和轮斑病的药物；茶拟盘多毛胞(pestalotiopsis theae)、核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、茄链格胞(alternaria solani)、胶胞炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)、野油菜黄单胞杆菌(xanthomonas campestris)和/或灰葡萄胞(botrytiscinerea)。
22.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
23.(1)本发明提供了一株巨大芽孢杆菌，该菌株抗逆性强，易于大量发酵，首次报道
能够同时防控茶饼病和轮斑病。
24.(2)菌株兼具对茶树促生活性，可定殖与茶树根部，使用方便，无残留和污染，可以有效减少化肥和农药施用。
附图说明
25.图1菌株cy32的平板菌落形态示意图。
26.图2菌株cy32对茶轮斑病病原菌抑菌效果及抑菌谱。
27.图3cy32发酵液10倍稀释液对茶轮斑病防效示意图。
具体实施方式
28.为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
29.实施例1：
30.巨大芽孢杆菌cy32的获得及鉴定：
31.巨大芽孢杆菌cy32，分离自湖北省恩施州鹤峰县王家坡村茶树根际土壤(图1)，进行杀茶轮斑病抑菌活性筛选获得。该菌株通过16s rdna，结合生理生化鉴定进一步确定其分类学地位(表1，表2)，已于2021年11月15日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cy32；保藏编号为cctcc no:20211409；地点：中国，武汉，武汉大学。
32.该菌在na培养基菌落生长良好，菌落乳白色(图1)。
33.在本发明中，巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)cy32或被简称为cy32。
34.表1菌株cy32生理生化特性
–
酶活、碳源氧化
[0035][0036]
+：阳性反应；-：阴性反应；
[0037]
表2菌株cy32生理生化特性
–
利用碳源产酸
[0038]
[0039][0040]
+：阳性反应；-：阴性反应；
[0041]
实施例2：
[0042]
巨大芽孢杆菌cy32的发酵(以下培养基配方中的百分数均为质量分数)：
[0043]
1)一级种子培养：500ml三角瓶中装有100ml一级种子培养基，121℃湿热灭菌15-30min，取cy32冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在35℃，180rpm摇床振荡培养10h；一
级种子培养所用培养基的原料及用量为：葡萄糖3％，牛肉膏1.5％，蛋白胨0.8％，氯化钠0.5％，培养基ph为7；
[0044]
2)二级种子培养：500l发酵罐中装有200l二级种子培养基，121℃湿热灭菌15-30min，将200ml一级种子接种于二级种子培养基中；在35℃培养10h；控制罐压0.05mpa，搅拌转速200rpm，通气比1:0.5，二级种子培养所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5％，酵母抽提物1％，蛋白胨3％，磷酸二氢钾0.001％，硫酸镁0.01％％，培养基ph7；
[0045]
3)发酵：10吨发酵罐中装有6吨cy32发酵培养基，121℃湿热灭菌30min，将200l 二级种子液移种于发酵培养基中，控制罐压0.02mpa，搅拌转速150rpm，通气比0.5-1.0，在35℃培养24h；发酵所用培养基的原料及用量为：玉米粉2.0％％、糖蜜1.0％％、花生粕1.5％％、酵母提取物1.5％、磷酸二氢钾0.015％、硫酸镁0.04％、碳酸钙0.15％，培养基ph7；
[0046]
4)芽胞脱落20-40％时结束发酵，放罐后，获得的发酵液中芽胞数为50亿cfu/ml。用于以下实施例。
[0047]
实施例3：
[0048]
巨大芽孢杆菌cy32离体抑菌活性及在防治茶饼病和轮斑病中的应用：
[0049]
供试茶轮斑病菌(pestalotiopsis theae)分离自茶轮斑病病叶，4℃保存于pda斜面。其他病原真菌为核桃炭疽病病原菌胶胞炭疽菌(colletotrichum gloeosporioides)、生菜菌核病病原菌核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)、草莓灰霉病病原菌灰葡萄胞(botrytis cinerea)、水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、番茄早疫病病原菌茄链格胞(alternariasolani)、茄病镰刀菌(fusarium solani)和尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum，均4℃保存于pda斜面，瓜果腐霉(pythium aphanidermatum)10℃保存于pda斜面。供试病原细菌为核桃黑斑病病原菌野油菜黄单胞杆菌(xanthomonas campestris)，-20℃保存于甘油管中。
[0050]
将斜面菌株转入pda平板进行活化，30℃培养6d备用。将灭菌滤纸片置于pda平板两端，随后滴入cy32发酵液7μl。24h后用4mm打孔器接入上述真菌病害病原菌菌碟，以接无菌水作为空白对照，病原菌和滤纸片距离为25mm。试验中每个设置三次重复，带对照长满平板后统计各处理和对照菌落直径，并计算抑菌率。
[0051]
抑菌率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]
×
100％
[0052]
细菌病害病原菌野油菜黄单胞杆菌从甘油管划线得到单菌落后转入nb液体培养基摇床180r/min 37℃震荡培养48h后备用。将na培养基融化后约45℃后倒入平板，随后加入野油菜黄单胞杆菌菌液，na和菌液比例为50:1，并充分混匀。随后用灭菌牛津杯对带菌平板进行打孔，并在孔中加入200μl cy32发酵液，放入37℃培养48h观察是否产生抑菌圈。
[0053]
通过离体抑菌试验表明，cy32对茶拟盘多毛胞、核盘菌、胶胞炭疽菌、灰葡萄胞、立枯丝核菌和茄链格胞抑菌活性较高，均在50％以上，对茶轮斑病病原菌茶拟盘多毛胞抑菌活性最高。对病原细菌野油菜黄单胞杆菌也具有良好的抑菌活性，具有明显的抑菌圈。对瓜果腐霉、茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌抑菌活性较差。(图2，表3)。
[0054]
表3 cy32对病原菌抑菌活性
[0060]
茶饼病田间药效试验位于鹤峰县走马镇，在病害发生前喷施100倍稀释的cy32发酵液 (60升每亩)，每隔7d施用一次，共喷施3次，对照喷施清水。试验共设4个重复，每个重复32m2，待对照充分发病后统计处理和对照病情指数，每个小区取5点，共50片叶子调查病情指数，并计算防效。病情指数分级标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占叶片面积 1％以下；3级：病斑面积占叶片面积2％-10％；5级：病斑面积占叶面积11％-25％；7级：病斑面积占叶面积26％-50％；9级：病斑面积占叶面积50％以上；
[0061]
病情指数＝∑(各级植株数
×
级别)/(调查总株数
×
最高代表级别)
×
100；
[0062]
防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100％
[0063]
试验表明，cy32对茶饼病具有良好的田间防效，100倍发酵液防效达到62.13.
[0064]
表4 cy32发酵液对茶饼病防治效果
[0065]
处理病情指数防效(％)cy32 100倍发酵液11.8762.13对照31.34-[0066]
实施例4：
[0067]
巨大芽孢杆菌cy32对茶树的促生增产作用
[0068]
试验田位于湖北省恩施州鹤峰县走马镇，cy32发酵原液(50亿cfu
·
ml-1)稀释20 倍，对茶树进行灌根处理，亩用水量600斤，对照灌清水。7天施用一次，共计施用三次。20d后一芽二叶期统计发芽密度，调查发芽密度(33.3cm
×
33.3cm方框内)，测百芽重。
[0069]
试验表明，cy32能明显提高茶树发芽密度，百芽重虽然有所下降，但单位面积一芽二叶茶叶质量增加，具有明显增产作用(表4)。
[0070]
表4 cy32对茶树促生增产作用
[0071]
处理发芽密度(个)百芽重(g)cy32187.0539.17ck127.4144.63
[0072]
实施例5：
[0073]
巨大芽孢杆菌cy32在茶树根际土壤定殖能力
[0074]
将巨大芽孢杆菌cy32和市售巨大芽孢杆菌菌肥分离的单菌落在含不同浓度利福平培养基进行抗性筛选，获得抗利福平突变菌株(该菌株经检测除具有利福平抗性外，其余生理生化特性与原生菌株无显著性差异)，该菌株可在含300μg
·
ml-1
的利福平的lb中正常生长。
[0075]
将抗性突变cy32和市售巨大芽孢杆菌单菌按照实施例2发酵，将2种发酵液芽胞数用清水调至1亿cfu/ml，喷施于茶树根部，施用量2l/株。30d后采用抖落法获得根际土壤，采用梯度稀释法稀释后，涂布于含300μg
·
ml-1
的利福平的lb平板，37℃培养24h后计数，测定cy32和市售巨大芽孢杆菌在茶叶根际土壤的定殖能力。
[0076]
试验表明，cy32在茶树根际土壤定殖能力更强，定殖量为3.85
×
106cfu/g，而市售巨大芽孢杆菌仅为5.19
×
104cfu/g。