干扰U2AF2基因的shRNA及其在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用的制作方法

干扰u2af2基因的shrna及其在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，更具体地说，涉及一种干扰u2af2基因的shrna及其在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用。


背景技术：

2.2020年最新癌症数据显示乳腺癌已成为全球第一大癌，且是女性癌症死亡的第一大原因。尽管近年来乳腺癌综合治疗已取得了进展，但是转移和复发仍然是提高患者生存率的主要障碍，尤其是在预后较差的三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，tnbc)中显得尤为突出。tnbc约占乳腺癌的15％-20％，因缺乏er、pr及her-2受体，导致内分泌治疗及靶向治疗无法进行，化疗仍是最主要的治疗手段。但棘手的是仅有20％的tnbc患者对标准化疗方案敏感，且相当一部分患者极易出现化疗耐药。因此，靶向tnbc化疗耐药的关键基因是提高患者生存率的重要举措。
3.可变剪切调节因子u2af2(又称为u2af65)，分子量为65kd，在选择性剪切过程中调节u2 snrnp与前mrna结合。可变剪接的错误调节与肿瘤的发生发展密切相关，比如u2af2高表达，与肺癌、肝癌的不良预后呈正相关。但u2af2在乳腺癌尤其是在三阴性乳腺癌中的表达及功能尚未见任何报道。
4.目前研究报道的抑制u2af2基因的方法仅有基因敲除，但该方法研究周期长、对技术条件的要求高且难以应用于临床治疗，因而存在明显的局限性。核糖核酸干扰(rna interference，rnai)是近年来广泛应用的一种基因沉默技术，其通过一种特定的由21个碱基组成的小干扰核糖核酸(short interfering rna，sirna)，可简便、高效、特异地阻断体内特定基因的表达，使细胞表现出相应基因表型的缺失，从而在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等方面得到了较多的应用。但由于sirna片段的半衰期过短，体外合成的sirna片段转移到细胞内后，其发挥出的基因抑制作用一般是很短暂的。因此，临床研究中一般采取事先在体外构建能够表达sirna片段的载体，再将载体转移至细胞内使其表达出sirna片段的策略。目前常用的载体包括逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒表达载体相对于其它表达载体，具有免疫原性低、感染效率高、感染时效长、感染效果稳定且能感染分裂相和非分裂相细胞等优点。目前，慢病毒载体已发展到了临床实验阶段，成为肿瘤治疗领域中应用技术研发的强有力手段。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供干扰u2af2基因的shrna，能有效地干扰u2af2基因在细胞中的表达。本发明所要解决的另一技术问题在于提供干扰u2af2基因的shrna在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.一种干扰u2af2基因的shrna，含有靶点序列为：
[0008][0009]
进一步地，所述的干扰u2af2基因的shrna，其核酸序列如下：
[0010]
正义链：
[0011][0012]
反义链：
[0013][0014]
含有所述的干扰u2af2基因的shrna的载体。
[0015]
进一步地，所述的载体是gv298。
[0016]
一种重组慢病毒，含有编码所述干扰u2af2基因的shrna的核酸序列。
[0017]
所述干扰u2af2基因的shrna或所述的含有干扰u2af2基因的shrna的载体或所述的重组慢病毒在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用。
[0018]
进一步地，所述的抗三阴性乳腺癌药物是提高三阴性乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的药物。
[0019]
进一步地，所述的抗三阴性乳腺癌药物是抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的药物。
[0020]
进一步地，所述的抗三阴性乳腺癌药物是抑制三阴性乳腺癌细胞迁移能力的药物。
[0021]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0022]
本发明通过免疫组织化学染色检测u2af2在人乳腺癌组织中的表达，证明u2af2在乳腺癌组织中高表达，且与化疗用药密切相关。本发明进一步设计人u2af2基因的sirna序列，并构建相应的sirna质粒和shrna慢病毒，通过u2af2的shrna干扰的慢病毒转染人三阴性乳腺癌耐药细胞后，实验证实细胞对紫杉醇的敏感性显著提高，说明u2af2是三阴性乳腺癌耐药的关键基因，且u2af2 shrna慢病毒能显著抑制其化疗耐药性，具有作为治疗抗三阴性乳腺癌药物的巨大潜力。
附图说明
[0023]
图1是免疫组化检测u2af2在人三阴性乳腺癌组织中的表达结果图；
[0024]
图2是wcsternblot检测u2af2在人三阴性乳腺癌细胞中的表达结果图；
[0025]
图3是u2af2在正常乳腺上皮细胞、三阴性乳腺癌细胞及三阴性乳腺癌耐药细胞中的表达图；
[0026]
图4是gv289质粒dna图谱图；
[0027]
图5是helper1.0慢病毒包装辅助质粒结构图；
[0028]
图6是helper2.0慢病毒包装辅助质粒结构图；
[0029]
图7是慢病毒感染细胞后的结果，空载对照慢病毒(sh-u2af2 nc)和u2af2干扰慢病毒(sh-u2af2)感染人三阴性乳腺癌耐药细胞系(mda-mb-231/ptx)的明视野及荧光视野图；
[0030]
图8是sh-u2af2慢病毒感染mda-mb-231/ptx细胞，westemblot检测sh-u2af2干扰效率图；
[0031]
图9是sh-u2af2慢病毒感染mda-mb-231/ptx细胞后，细胞对紫杉醇ic50的变化结果图；
[0032]
图10是u2af2干扰后，mda-mb-231/ptx细胞侵袭能力显著下降结果图；
[0033]
图11是u2af2干扰后，mda-mb-231/ptx细胞迁移能力显著下降结果图。
具体实施方式
[0034]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0035]
实施例1：
[0036]
1、免疫组化检测u2af2在三阴性乳腺癌及癌旁组织中的表达
[0037]
1)经病理诊断为三阴性乳腺癌的石蜡标本及相应的癌旁组织标本进行常规切片。
[0038]
2)组织石蜡切片脱蜡至水：石蜡切片置于烘箱60℃1小时，二甲苯i、ii，各10分钟，梯度酒精：100％酒精2分钟、95％酒精2分钟、80％酒精2分钟、70％酒精2分钟，蒸馏水洗：5分钟
×
2次。
[0039]
3)过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3％h2o2，避光条件下室温10分钟。
[0040]
4)蒸馏水洗：5分钟
×
2次。
[0041]
5)抗原修复：枸橼酸钠缓冲液(10mm，ph6.0)淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却，然后置于pbs中5分钟
×
3次。
[0042]
6)血清封闭：取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分，但保持组织呈湿润状态，每张滴加山羊血清100μl，37℃，孵育15分钟。
[0043]
7)滴加u2af2抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加兔抗人抗体u2af2(1：1000)，4℃孵育过夜。
[0044]
8)pbs：5分钟
×
3次(置于摇床)。
[0045]
9)滴加hrp标记的二抗，37℃，40分钟。
[0046]
10)pbs：5分钟
×
3次(置于摇床)。
[0047]
11)dab显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止)。
[0048]
12)苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。
[0049]
13)自来水冲洗返蓝，15分钟。
[0050]
14)梯度酒精脱水：80％，2分钟95％，2分钟100％，2次，5分钟。
[0051]
15)二甲苯透明：二甲苯i、ii各5分钟。
[0052]
16)封片：中性树胶封片。
[0053]
图1是免疫组化检测u2af2在人三阴性乳腺癌组织中的表达检测结果，结果表明u2af2在细胞浆和细胞核中均有表达，且在人三阴性乳腺癌组织中的表达明显高于正常乳腺组织。
[0054]
2、western blot检测u2af2蛋白在三阴性乳腺癌组织及相应癌旁组织中的表达。
[0055]
1)蛋白提取：每100mg组织标本加ripa裂解液1ml，置于匀浆器上匀浆，冰上静置10分钟后，于离心机以12000rpm、4℃离心10分钟，吸取上清，置于预冷的1.5ml离心管。
[0056]
2)浓度测定：吸取2μl蛋白，进行bca法检测蛋白浓度。
[0057]
3)煮蛋白：将蛋白与5
×
loading按比例混合，并在蛋白加热器上按照95℃，煮沸5分钟。
[0058]
4)制备10％sds-page胶，上样量为50μg每孔，按照80v、120分钟条件进行电泳，260ma、90分钟条件转pvdf膜。
[0059]
5)转膜结束后，将pvdf膜进行5％脱脂牛奶封闭2小时。
[0060]
6)tbst溶液清洗5分钟
×
2次。
[0061]
7)一抗孵育：兔抗人u2af2抗体按照1∶1000比例稀释，4℃孵育过夜。
[0062]
8)tbst溶液清洗5分钟
×
2次，10分钟
×
2次。
[0063]
9)二抗孵育：山羊抗兔二抗以1∶10000稀释，室温孵育2小时。
[0064]
10)tbst溶液清洗5分钟
×
2次，10分钟
×
2次。
[0065]
11)ecl显影，并进行条带分析。
[0066]
图2是westemblot检测u2af2在2对人三阴性乳腺癌组织及相应癌旁组织中的表达，结果提示u2af2在癌组织中的表达明显高于癌旁组织。n表示癌旁组织，t表示癌组织，gd表示gapdh，作为内参。
[0067]
3、westernblot检测u2af2在人三阴性乳腺癌耐药细胞中的表达及ic50测定细胞对紫杉醇(ptx)的敏感性
[0068]
westernblot检测方法同上，结果如图3的左图，提示u2af2在正常乳腺细胞mcf10a、三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231、三阴性乳腺癌耐药细胞mda-mb-231/ptx中均有表达，但在耐药细胞中表达量最高。
[0069]
取对数生长期的细胞稀释成浓度为4
×
104cell/ml的细胞悬液接种于96孔板，每孔100μl置于培养箱培养24h后加入相应的药物，每个浓度设置3个复孔。72小时后，每孔加入20μlcck8检测试剂，在培养基中继续培养。3小时后酶标仪检测细胞增殖数据并分析。结果如图3的右侧图所示耐药细胞mda-mb-231/ptx的ic50是亲本细胞mda-mb-231的5倍。
[0070]
4、设计u2af2基因sirna序列并构建u2af2-sirna和阴性对照质粒
[0071]
首先从genebank中调取u2af2基因的序列(nm_007279)，然后利用上海吉凯基因化学技术公司的设计软件genechem设计3条针对u2af2基因的sirna序列，并从中筛选出干扰效果最佳的sirna序列：5
′‑
cgccttctgtgagtacgtgga-3
′
。随后设计包含u2af2基因sirna序列的双链dna oligo，其序列及结构如表1所示。
[0072]
表1包含u2af2基因sirna序列的双链dna oligo
[0073][0074]
合成上述双链dna oligo，将合成所得的dna干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴
15分钟，然后自然冷却至室温，即形成包含干扰靶点序列的dna双链。以age i和bamh i限制性内切酶作用于gv298载体(载体质粒dna图谱见图4)以使其线性化，酶切反应体系见表2，琼脂糖凝胶电泳鉴定其酶切片段。
[0075]
表2酶切反应体系
[0076]
试剂体积(μl)ddh2o4110
×
cutsmart buffer5纯化的质粒dna(1μg/μl)2age i(10u/μl)1bamh i(10u/μl)1total50
[0077]
通过t4 dna连接酶将线性化的gv298质粒和纯化好的双链dnaoligo连接，连接反应体系如表3所示，16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的感受态大肠杆菌细胞。在连接转化产物长出菌表面沾一下，溶于10μl lb培养基，混匀取1μl作为模板，采用pcr法进行鉴定，pcr鉴定的引物为：上游，5
′‑
ccatgattccttcatatttgc-3
′
；下游，5
′‑
gtaatacggttatccacgcg-3
′
；
[0078]
表3连接反应体系
[0079][0080][0081]
然后对pcr鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含有u2af2干扰片段的载体，命名为sh-u2af2。
[0082]
sirna阴性对照靶点序列为5
′‑
ttctccgaacgtgtcacgt-3
′
，构建sirna对照质粒时，针对sirna阴性对照靶点序列合成双链dnaoligo序列(表4)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同sh-u2af2，构建成功的阴性对照命名为sh-u2af2 nc。
[0083]
表4 sirna阴性对照双链dnaoligo序列
[0084]
[0085]
5、构建sh-u2af2慢病毒及sh-u2af2 nc对照慢病毒
[0086]
将测序正确的菌液转接于10ml含抗生素的lb液体培养基中，37℃培养过夜，以无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提。分别制备成100ng/μl的质粒储存液。同法提取phelper 1.0(图5)和phelper2.0(图6)慢病毒包装辅助质粒。转染前24小时，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293t细胞，以含10％fbs的dmem培养基调整细胞密度为5
×
106细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养，24小时后待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。转染前2小时将细胞培养基更换为无pbs培养基。向一灭菌离心管中加入所制备的sh-u2af2质粒或阴性对照质粒及各包装质粒溶液(sh-u2af2质粒或阴性对照质粒20μg，helper 1.0质粒15μg，helper 2.0质粒10μg)，与相应体积的转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15分钟。将该混合液缓慢滴加至293t细胞培养液中(加入过程注意均匀，避免将细胞吹起)并混匀，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养6小时后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的pbs液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃。缓慢加入含10％fbs的细胞培养基20ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48-72小时，然后收集293t细胞上清液。于4℃，4000g离心10分钟，除去细胞碎片。以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中，在4℃、25000rpm下离心2小时。离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬(尽可能地避免病毒长时间暴露在室温中，减少病毒损失)。经充分溶解后，10000rpm高速离心5分钟后，取上清按要求分装。包含sh-u2af2质粒和sh-u2af2 nc阴性对照质粒的慢病毒分别命名为sh-u2af2慢病毒和sh-u2af2 nc对照病毒。
[0087]
6、sh-u2af2慢病毒感染人三阴性乳腺癌耐药细胞系的感染效率及抑制效率
[0088]
胰酶消化对数生长期的mda-mb-231/ptx人三阴性乳腺癌耐药细胞系，以培养基制成细胞悬液后接种于12孔板中，培养至细胞融合度达到30％左右。按照moi(感染复数)＝50，加入1
×
108/tu/ml的sh-u2af2慢病毒1.25μl，培养12小时后更换培养基，感染72h后荧光拍照评估感染效率，并传代3次后收集细胞采用westernblot检测u2af2的干扰效率。实验结果如图7所示，细胞红色荧光示踪病毒感染情况，sh-u2af2及sh-u2af2 nc组感染细胞效率均达60％以上。图8所示，蛋白水平提示sh-u2af2组u2af2的表达量约为对照组的50％，上述提示sh-u2af2在mda-mb-231/ptx细胞中的抑制效果理想。
[0089]
7、sh-u2af2对三阴性乳腺癌耐药细胞化疗敏感性的影响
[0090]
通过对mda-mb-231/ptx细胞及亲本细胞ic50的检测，方法如前面所述，图9结果显示u2af2干扰后，mda-mb-231/ptx细胞对紫杉醇的敏感性得到了显著提高，细胞存活率降低了约30％。
[0091]
8、sh-u2af2对三阴性乳腺癌耐药细胞侵袭能力的影响
[0092]
铺基质胶：在4℃条件下将matrigel胶用无血清的l15细胞培养基按照1∶8比例稀释，取100μl均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置0.5小时，使其聚合成凝胶。取对数生长期的待测细胞，并用pbs洗涤，接着用无血清l15培养基悬浮细胞，调整细胞密度为1*105/ml。在24孔板下室加入650μl含5％fbs的l15培养基，然后用镊子将transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液200μl加入上室，最后放入培养箱中培养48小时。细胞固定：取出小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭matrigel和上室内的细胞。取新的24孔板加入4％多聚甲醛600μl，将小室放入后固定30分钟。弃固定液，用0.1％结晶紫染色5分钟，pbs洗3遍，除去
未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉。风干后，在高倍显微镜下随机选取5个视野观察细胞并计数。结果显示(图10)，sh-u2af2组细胞的侵袭细胞量显著低于对照组，差异具有统计学意义(p＜0.001)，提示u2af2干扰可显著抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭能力。
[0093]
9、sh-u2af2对三阴性乳腺癌耐药细胞迁移能力的影响
[0094]
首先使用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，约每隔0.5cm一道，横穿过孔。以5
×
105cell/孔铺板，24小时后用枪头沿着第一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕。划痕完成后，使用无菌pbs洗细胞3次并进行拍照，然后更换l15培养基，并将细胞置于37℃的空气培养箱培养。24小时后显微镜线观察拍照并测量划痕的宽度。结果如图11，显示sh-u2af2组细胞的迁移距离显著少于对照组，两组有统计学差异，表明u2af2干扰明显抑制三阴性乳腺癌耐药细胞的迁移能力。