用色谱法制备高纯度小分子类肽化合物的方法与流程

本发明属于化学提纯，具体涉及一种小分子类肽化合物的纯化方法。

背景技术：

1、肽在生物的生长、发育和代谢中起着重要作用，它是由具有一定序列的氨基酸通过肽键组成的。两个氨基酸组成的叫二肽。式i化合物是一种非天然的被合成的赖氨酸衍生物，由两个氨基酸组成的二肽结构，也是一种常见的不可降解的adc linker，可用于合成抗体偶联药物(adc)。

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3、有文献(tetrahedron letters,vol.38,no.30,pp.5257-5260,1997)公开了式i化合物的制备方法。其中式i化合物按照以下合成路线合成，采用硅胶柱层析的方法进行纯化。

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5、经调研发现目前市售的式i化合物产品纯度区间在95％～98％，鉴于产品的用药安全性，需要提供更成熟的纯化工艺以制得高纯度的产品。然而，从目前的文献资料看，由于存在种种的缺陷，还没有一种制备高纯度的适用于商业化生产的类肽化合物的生产方法。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中小分子类肽化合物纯度低的缺陷，提供一种高效率的适用于商业化生产的高纯度(色谱纯度达到98.5％)低杂质小分子类肽化合物的方法。

2、本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题：

3、本发明提供了一种小分子类肽化合物的纯化方法，其包括如下步骤：采用离子交换色谱法或反相色谱法，将小分子类肽化合物粗品进行洗脱，即可；

4、所述离子交换色谱条件为：离子交换色谱的固定相为高分子聚合物；离子交换色谱的洗脱体系中，洗脱剂a为酸性缓冲液，洗脱剂b为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇和四氢呋喃中的一种或多种；

5、所述反相色谱条件为：反相色谱的固定相为反相硅胶或聚合物微球；反相色谱的洗脱体系中，洗脱剂a为酸性缓冲液，洗脱剂b为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇和四氢呋喃中的一种或多种；

6、其中，所述小分子类肽化合物的结构如式i所示，

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8、所述离子交换色谱中，所述固定相可为阳离子交换树脂，优选为弱酸性阳离子交换树脂，例如大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂；更优选为d113，d151或d152；进一步优选为d151。

9、所述离子交换色谱中，所述固定相填料的粒径可为本领域常规，较佳地，所述固定相填料的平均粒径优选为0.2-2mm，更优选为0.3-1.25mm或0.4-0.7mm。

10、所述离子交换色谱中，所述洗脱剂a可为本领域常规的酸性缓冲溶液，较佳地，所述洗脱剂a为缓冲盐溶液；其中，阳离子为na+、k+、li+、h+、nh4+和et3nh+中的一种或多种，阴离子为po43-(磷酸根离子)、hpo42-(磷酸一氢根离子)、h2po4-(磷酸二氢根离子)、ch3coo-(醋酸根离子)、hcoo-(甲酸根离子)、cl-、hco3-(碳酸氢根离子)、clo-(次氯酸根离子)和so32-(亚硫酸根离子)中的一种或多种；所述阳离子优选为na+和/或nh4+；所述阴离子优选为ch3coo-和/或h2po4-，例如：磷酸二氢钠，乙酸铵或乙酸钠。

11、所述离子交换色谱中，所述洗脱剂a的ph值优选为4.0～6.5，较佳地，通过乙酸调节所述洗脱剂a的ph值。

12、所述离子交换色谱中，所述洗脱剂b优选甲醇或乙腈。

13、所述离子交换色谱中，所述洗脱体系，洗脱剂为磷酸二氢钠-甲醇、乙酸钠-乙腈或乙酸铵-甲醇，并通过乙酸调节洗脱剂a的ph值为4.0～6.5。

14、所述离子交换色谱中，所述洗脱剂a与所述洗脱剂b的体积比可为5:95-95:5，优选为40:60-80:20；更优选为50:50-70:30，例如：50:50、60:40或70:30。

15、所述离子交换色谱中，所述的小分子类肽化合物粗品在洗脱前可进行预处理，以符合进样标准。所述的预处理可为本领域常规的预处理，较佳地，所述预处理包括下述步骤：将所述小分子类肽化合物粗品溶于所述洗脱剂a和所述洗脱剂b的混合溶剂中，加酸调节ph至完全溶解。

16、所述预处理中，所述的酸可为乙酸。

17、所述离子交换色谱中，所述洗脱方式可为等度洗脱或梯度洗脱；优选为等度洗脱。

18、所述离子交换色谱中，所述洗脱温度可为本领域常规的洗脱温度，优选为20-35℃，例如25℃。

19、所述离子交换色谱中，所述洗脱后的洗脱液的处理方法可为真空浓缩、萃取干燥浓缩和冷冻干燥中的一种或几种；优选为先进行真空浓缩再进行冷冻干燥。

20、所述反相色谱中，所述固定相可为十八烷基硅烷键合反相硅胶或苯乙烯-二乙基烯基苯交联聚合物微球，例如silicabio-c18或unips40-300。较佳地，所述固定相为十八烷基硅烷键合反相硅胶。

21、所述反相色谱中，所述固定相填料的粒径可为本领域常规，较佳地，所述固定相填料的平均粒径5-200μm，优选为20-50μm，例如20μm或50μm。

22、所述反相色谱中，所述洗脱剂a可为本领域常规的酸性缓冲溶液，较佳地，所述洗脱剂a为缓冲盐溶液；其中，阳离子为na+、k+、li+、h+、nh4+和et3nh+中的一种或多种，阴离子为po43-(磷酸根离子)、hpo42-(磷酸一氢根离子)、h2po4-(磷酸二氢根离子)、ch3coo-(醋酸根离子)、hcoo-(甲酸根离子)、cl-、hco3-(碳酸氢根离子)、clo-(次氯酸根离子)和so32-(亚硫酸根离子)中的一种或多种；所述阳离子优选为na+和/或nh4+；所述阴离子优选为ch3coo-和/或h2po4-，例如：磷酸二氢钠，乙酸铵和乙酸钠。

23、所述反相色谱中，所述洗脱剂a的ph值优选为4.0～6.5，较佳地，通过乙酸调节所述洗脱剂a的ph值。

24、所述反相色谱中，所述洗脱剂b优选甲醇、乙腈或异丙醇。

25、所述反相色谱中，所述洗脱体系，洗脱剂为磷酸二氢钠-甲醇、磷酸二氢钠-异丙醇、乙酸钠-乙腈、乙酸铵-甲醇，乙酸铵-乙腈或乙酸钠-甲醇，并通过乙酸调节洗脱剂a的ph值为4.0～6.5。

26、所述反相色谱中，当所述固定相为苯乙烯-二乙基烯基苯交联聚合物微球时，洗脱剂为乙酸钠-乙腈或乙酸铵-甲醇。

27、所述反相色谱中，所述洗脱剂a与所述洗脱剂b的体积比可为5:95-95:5，优选为40:60-80:20；更优选为50:50-70:30，例如：50:50、60:40或70:30。

28、所述反相色谱中，所述洗脱温度可为本领域常规的洗脱温度，优选为20-35℃，例如25℃。

29、所述反相色谱中，所述洗脱方式可为等度洗脱或梯度洗脱；优选为等度洗脱。

30、所述反相色谱中，所述洗脱后的洗脱液的处理方法可为真空浓缩、萃取干燥浓缩和冷冻干燥操作中的一种或几种；优选为先进行真空浓缩再进行冷冻干燥。

31、所述纯化方法中，还可在洗脱前进行预纯化步骤。所述的预纯化可为本领域常规的预纯化，较佳地，所述预纯化包括下述步骤：将待处理的小分子类肽化合物粗品用溶剂a溶解，然后与溶剂b混合，静置，下部油状物浓缩，即可；所述溶剂a为卤代烃类溶剂，所述溶剂b为醚类溶剂。

32、所述预纯化中，所述溶剂a优选为二氯甲烷。

33、所述预纯化中，所述溶剂b优选为甲基叔丁基醚。

34、所述预纯化中，所述溶剂b和所述溶剂a的质量比可为(1-25):1，例如1:1、3:1、5:1、7:1、10:1或25:1，优选为(7-25):1，更优选为(7-10):1。

35、所述预纯化中，所述混合时间可为1-16h，优选为2h。

36、所述待处理的小分子类肽化合物粗品可通过下述方法制备：溶剂中，式ib化合物与二乙胺进行反应，浓缩，即可；

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38、所述反应中，较佳地，所述溶剂为二氯甲烷。

39、所述式ib化合物和所述二乙胺的摩尔比为1:(1-5)，例如1：3。

40、所述反应的温度为室温。

41、所述反应的进程可采用本领域中的常规测试方法(如tlc、hplc、gc或nmr)进行监控，一般以式ib化合物不再反应时作为反应终点。所述反应时间可为2小时。

42、本发明中，“室温”是指10-30℃。

43、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。发明的积极进步效果在于：

44、1)通过离子交换色谱纯化制备得到的纯度大于99.5％的高纯度类肽化合物，杂质含量大大降低。

45、2)通过反相色谱纯化即可得到类肽化合物含量大于97.8％类肽化合物，方法简易。

46、3)该方法对馏分的处理，采用真空浓缩和萃取干燥浓缩，避免了反相分离操作的冷冻干燥的繁琐操作，仅通过简单操作就可得到高纯度样品粉末，产品状态良好，后处理操作简单易行。

47、4)该方法采用的两种色谱填料固定相，简单易得，经济适用，并且可以重复使用，提高了使用效率，降低了生产成本。

48、5)该纯化方法不仅提高了产品品质，而且该技术极大地减少了环境不友好型溶剂的使用，以达到最大程度的对环境的保护。