可用于诊治脑卒中的标志物的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及可用于诊治脑卒中的标志物。


背景技术：

2.脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，是危害人类健康的主要疾病之一。脑卒中已成为世界范围内的首要致残原因及第三位致死原因，且由其致死的人群中，三分之二的患者集中于发展中国家。脑卒中包括缺血性脑卒中以及出血性脑卒中，研究显示我国人群中缺血性脑卒中的患病比例要大于出血性脑卒中。临床调查研究显示，脑卒中发病率目前仍呈不断上升趋势，且具有致死率高、发病率高、致残率高等特点，轻则影响患者的生活质量，重则导致瘫痪、失语、痴呆甚至死亡。脑卒中不仅严重影响患者的生活质量，更是给家庭和社会带来了沉重的负担。尽管磁共振成像(magnatic resonance imaging，mir)在脑卒中诊断中具有重要的参考价值，然而，由于mir在中国的普及率低及费用高等现实问题，脑卒中的早期诊断率仍然不十分理想，而及时、确切的诊断是治疗措施实施的重要依据，从而降低脑卒中的致残率。
3.由于蛋白质组学及基因组学的发展，有关疾病相关生物标志物的研发如雨后春笋般得到了迅速发展。生物标志物为脑组织以外其他系统疾病的快速诊断、指导治疗及评估预后提供了非常重要的依据，几十年来，许多研究者一直致力于探讨生物标志物与脑卒中之间的关系。寻找敏感特异的生物标志物有望为脑卒中诊断提供新的途径。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种可用于诊断脑卒中的产品。
5.本发明的第二目的在于提供一种预防或治疗脑卒中的药物组合物。
6.本发明的第三目的在于提供一种诊断对象是否患有脑卒中或预测对象是否存在患脑卒中的风险的系统或装置。
7.为实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：
8.本发明一方面提供了一种可用于诊断脑卒中的产品，所述的产品包括可以检测样本中生物标志物表达水平的试剂，所述的生物标志物包括daam2、echdc3、folr3中的两个或三个。
9.进一步，所述的脑卒中包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中。
10.进一步，所述的脑卒中为缺血性脑卒中，
11.进一步，所述的缺血性脑卒中包括大动脉粥样硬化性卒中、心源性脑栓塞、小动脉闭塞性卒中、或其他原因引发的缺血性卒中。
12.进一步，所述的缺血性脑卒中为心源性脑栓塞。
13.进一步，所述的试剂包括通过数字成像技术、蛋白免疫技术、染料技术、核酸测序技术、核酸杂交技术、色谱技术、质谱技术检测样本中生物标志物表达水平的试剂。
14.进一步，所述的样本为血液。
15.进一步，所述的试剂包括与所述生物标志物基因特异性结合的引物或探针；与所述标志物蛋白特异性结合的抗体、肽、适配体或化合物。
16.进一步，所述的产品包括核酸膜条、制剂、芯片、试剂盒。
17.本发明另一方面提供了生物标志物在制备前面所述产品中的应用，所述的生物标志物包括daam2、echdc3、folr3中的两个或三个。
18.本发明另一方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括daam2的抑制剂、echdc3的抑制剂、folr3的抑制剂中的两个或三个。
19.本发明另一方面提供了前面所述的药物组合物在制备预防或治疗脑卒中的药物中的应用。
20.进一步，所述的脑卒中包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中。
21.进一步，所述的脑卒中为缺血性脑卒中。
22.进一步，所述的缺血性脑卒中包括大动脉粥样硬化性卒中、心源性脑栓塞、小动脉闭塞性卒中、或其他原因引发的缺血性卒中。
23.进一步，所述的缺血性脑卒中为心源性脑栓塞。
24.本发明另一方面提供了一种诊断对象是否患有脑卒中或预测对象是否存在患脑卒中的风险的系统或装置，所述的系统/装置包括：
25.分析单元，所述单元适于测量对象样本中生物标志物的量；和
26.评估单元，其包含存储的参考和数据处理器，所述数据处理器已经实现了用于比较分析单元测量的生物标志物的量与存储的参考的算法，由此诊断对象是否患有脑卒中或预测对象是否存在患脑卒中的风险；
27.所述的生物标志物包括daam2、echdc3、folr3中的两个或三个；
28.进一步，所述的脑卒中包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中。
29.进一步，所述的脑卒中为缺血性脑卒中。
30.进一步，所述的缺血性脑卒中包括大动脉粥样硬化性卒中、心源性脑栓塞、小动脉闭塞性卒中、或其他原因引发的缺血性卒中。
31.进一步，所述的缺血性脑卒中为心源性脑栓塞。
32.本发明还提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现前面所述的系统/装置。
附图说明
33.图1为daam2差异表达的箱线图；
34.图2为echdc3差异表达的箱线图；
35.图3为folr3差异表达的箱线图；
36.图4为daam2诊断心源性脑栓塞的roc曲线图；
37.图5为echdc3诊断心源性脑栓塞的roc曲线图；
38.图6为folr3诊断心源性脑栓塞的roc曲线图；
39.图7为daam2和echdc3联合诊断心源性脑栓塞的roc曲线图；
40.图8为echdc3和folr3联合诊断心源性脑栓塞的roc曲线图；
41.图9为daam2和folr3联合诊断心源性脑栓塞的roc曲线图；
42.图10为daam2+echdc3+folr3联合诊断心源性脑栓塞的roc曲线图。
具体实施方式
43.生物标志物
44.本发明提供了一种可用于诊断脑卒中的产品，所述的产品包括可以检测生物标志物的试剂，所述的生物标志物包括daam2、echdc3、folr3中的两个或三个。
45.术语“生物标志物”是指可用于预测个体的疾病状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。生物标志物可包括，但不限于，核酸、蛋白质及其变体和片段。生物标志物可以是包含编码该生物标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的dna。可用于本发明的生物标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的dna和rna。
46.所述的daam2是指gene id为23500的基因。
47.所述的echdc3是指gene id为79746的基因。
48.所述的folr3是指gene id为2352的基因。
49.术语“引物”或“探针”涵盖具有特定序列的寡核苷酸或具有特定序列的寡核苷酸。在其他实施方案中，通过间接检测方法检测核酸。例如，生物素化的探针可以与链霉亲和素缀合的染料组合以检测结合的核酸。链霉亲和素分子结合扩增的生物标志物上的生物素标记，并且结合的生物标志物通过检测附着在链霉亲和素分子上的染料分子来检测。在一个实施方案中，缀合链霉亲和素的染料分子包含phycolink。链霉亲和素r-藻红蛋白(prozyme)。其他缀合染料分子是本领域技术人员已知的。
50.标记包括，但不限于：发光、光散射和吸光化合物，其产生或淬灭可检测的荧光、化学发光或生物发光信号。在一些实施方案中使用包括报告荧光团和淬灭剂荧光团的双重标记的荧光探针。应当理解，选择具有不同发射光谱的成对荧光团，使得它们可以容易地区分。在某些实施方案中，标记是杂交稳定部分，其用于增强、稳定或影响双链体的杂交，例如，嵌入剂和嵌入染料。
51.术语“抗体”是指一种免疫球蛋白，其可特异性识别靶抗原上的表位，所述识别由重链和轻链(vhs和vls)的免疫球蛋白可变区的结合特性决定，更具体地说，由互补决定区(cdrs)的结合特性确定。许多潜在的抗体形式在本领域是已知的，可能包括但不限于：多个完整的单克隆抗体或包含完整的单克隆抗体的多克隆混合物、抗体片段(如fab、fab’和fv片段，包含抗体片段的多特异性抗体和线性单链抗体)、单链可变片段(scfvs)、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和融合蛋白，其包含识别靶抗原上给定的表位所必需的结构域。优选地，在本发明背景下引用的抗体指的是单克隆抗体。抗体也可以与各种可检测的标记偶联从而使检测成为可能，这些标记包括但不限于放射性核素、荧光探针、染料或酶类，例如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶等。
52.术语“适配子”是指寡核苷酸分子或多肽分子，其可与靶分子特异性结合。寡核苷酸适配子可以是核苷酸(rna)或脱氧核苷酸(dna)，通常由短链寡核苷酸组成。多肽适配子通常由短肽结构域组成，所述短肽结构域可以附到蛋白骨架的一端或两端。
53.术语“特异性结合”，在抗体-表位相互作用的背景下，指的是一种相互作用，其中，与抗体或表位中的任意一个被替代物，如非相关蛋白质，所代替的情况相比，所述抗体和表位的结合更频繁或更快，或持续时间更长或存在更大的亲和力，或以上述的任一方式的组
合结合。通常，但不是必然地，提及的结合指的是特异性识别。此外，应当理解的是，一种抗体可以特异性识别一种以上的抗原。本领域中已知的通过单克隆抗体测定靶的特异性结合或其缺失的技术包括但不限于：facs分析、免疫细胞化学染色法、免疫组织化学、蛋白质印迹法/斑点印迹法、elisa和亲和层析。作为示例而不是限制，特异性结合或其缺失可以通过有对照的对比分析来测定，所述对照包含本领域中已知可特异性识别所述靶的抗体，和/或不特异性识别或最小限度地特异性识别所述靶的对照(例如，所述对照包含非特异性抗体的使用)。所述对比分析可以是定性或定量分析。但是，应当理解的是，据报道，与抗体，例如同时特异性识别给定靶和同源蛋白质的抗体相比，专门地特异性识别所述给定靶的抗体或结合部分对所述靶有更高的特异性。
54.试剂盒
55.本发明提供了用于诊断脑卒中的试剂盒，该试剂盒用于确定生物标志物的水平(其中序列任选地包含尿嘧啶以代替所公开的胸腺嘧啶中的一种、多于一种或全部)及其组合。试剂盒可以包括适于选择性检测来源于受试者的样品中用于诊断脑卒中的生物标志物或生物标志物组的存在的材料和试剂。例如，在一个实施方案中，该试剂盒可以包括与生物标志物特异性杂交的试剂。这类试剂可以是适于检测生物标志物的形式的核酸分子，例如，探针或引物。该试剂盒可以包括用于进行测定以检测一种或多种生物标志物的试剂，例如，可以用于在qpcr反应中检测一种或多种生物标志物的试剂。该试剂盒同样可以包括用于检测一种或多种生物标志物的微阵列。
56.在进一步的实施方案中，试剂盒可以含有标记或产品插页形式的合适操作参数的说明书。例如，说明书可以包括关于如何收集样品，如何确定样品中一种或多种生物标志物的水平，或如何将样品中一种或多种生物标志物的水平与受试者的脑卒中状态相关联的信息或指导。
57.在另一个实施方案中，试剂盒可以含有一个或多个容器，其具有生物标志物样品，以用作参比标准，合适的对照，或用于测定的校准以检测测试样品中的生物标志物。
58.药物组合物
59.本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括daam2的抑制剂、echdc3的抑制剂、folr3的抑制剂中的两个或三个。
60.所述的抑制剂包括核酸分子、碳水化合物、小分子化合物或干扰慢病毒；所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、双链rna、小干扰rna或短发夹rna。
61.如本文所用，所述的“小干扰rna”是一种双链小rna分子，其由完全互补的第一链和第二链组成，由dicer(rnaaseⅲ家族中对双链rna具有特异性的酶)加工而成。所述第一链和所述第二链互补共同形成rna二聚体，并且所述第一链的序列与前面所述生物标志物基因中的靶序列相同，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。所述双链rna第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；优选地，长度均为19-23个核苷酸；更优选地，长度均为19、20或者21个核苷酸。sirna是sirisc的主要成员，激发与之互补的目标基因的沉默。rna干扰(rnainterference，rnai)是指内源性或外源性双链rna(dsrna)介导的细胞内mrna发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。
62.如本文所用，所述shrna，即小发卡或短发卡rna(a small hairpin rna or shorthairpin rna,shrna)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的rna序列，其包
含正义链片段、反义链片段以及连接正义链片段和反义链片段的茎环结构，常被用于rna干扰沉默靶基因的表达。其中正义链和反义链的序列互补，并且所述正义链片段的序列与前面所述生物标志物基因中15-27个连续的核苷酸序列相同，优选地，所述正义链片段与前面所述生物标志物基因中19-23个连续的核苷酸序列相同；更优选地，所述正义链片段与前面所述生物标志物基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列相同，或者为与上述各序列在高等严紧条件下杂交的序列。shrna的发卡结构可被细胞机制切割成sirna，然后sirna结合到rna诱导沉默复合物上(rna-induced silencing complex，risc)，该复合物能够结合到目的基因并将其降解。
63.本发明所述的小干扰rna可以是化学合成的双链rna；也可以是载体或表达框架表达的双链rna，所述载体或表达框架中可采用例如rna聚合酶iii启动子和rna聚合酶iii终止子调控小干扰rna在哺乳动物细胞中的表达，rna聚合酶iii启动子包括人源或鼠源的u6启动子和人h1启动子等。
64.本发明所述的小干扰rna可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰rna组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰rna组成；所述的靶序列可以是前面所述生物标志物基因的基因组序列，或前面所述生物标志物基因的cdna序列。
65.本发明的sirna可通过本文实施例中公开的方法或者本领域已知的方法筛选。
66.本发明的sirna中的第一链和shrna中的正义链的序列与靶序列相同，其与sirna靶序列相比具有至少连续10个(优选至少连续15个，更优选至少连续18个)相同的核苷酸序列，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。
67.在本发明中，所述核酸构建体是指包括复制系统以及能够在给定的靶细胞内转录的序列。其可以通过将编码本文中所述的shrna的片段克隆入已知载体获得。进一步地，所述核酸构建体为慢病毒载体。所述慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染细胞，进而转录出本发明所述shrna，通过酶切加工等步骤，最终获得所述sirna，用于特异性沉默前面所述生物标志物基因的表达。
68.本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的载体。术语载体包括适用于制备所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括，但不限于，糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及根据配制人员的判断，组合物中还可以存在其他无毒相容的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
69.在制备本发明的药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉
剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
70.该药物组合物的应用为脑卒中的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象脑卒中的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。
71.所述药物组合物用于预防或治疗对象脑卒中时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。用于局部给药的典型剂型包括乳膏、软膏、喷雾、洗液和膏药。然而，药物组合物可以被配制成用于任何类型的给药，例如，利用注射器或其它装置的皮内注射、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、鼻内注射、大脑内注射、气管内注射、动脉内注射、腹膜内注射、膀胱内注射、胸膜内注射、冠状动脉内或肿瘤内注射。还考虑通过吸入(例如，气雾剂)给药或口服给药、直肠给药或阴道给药的剂型。
72.系统或装置
73.本发明涉及一种诊断对象是否患有脑卒中或预测对象是否存在患脑卒中的风险的系统/装置，包括：
74.分析单元，所述单元适于测量对象样本中生物标志物的量；和
75.评估单元，其包含存储的参考和数据处理器，所述数据处理器已经实现了用于比较分析单元测量的生物标志物的量与存储的参考的算法，由此诊断对象是否患有脑卒中或预测对象是否存在患脑卒中的风险。
76.如本文应用的装置应至少包括上述单元。装置的单元可操作地彼此连接。如何以操作方式链接单元将取决于装置中包含的单元的类型。例如，在分析单元中应用用于自动定量测量生物标志物的工具的情况下，由所述自动操作单元获得的数据可以由评估单元处理，例如，由在作为数据处理器的计算机上运行的计算机程序处理，以便促进诊断。在一个实施方式中，数据处理器实行生物标志物的量与参考的比较。
77.进一步，在这种情况下，单元由单个装置构成。然而，分析单元和评估单元也可为物理上分离的。在这种情况下，可以经由允许数据传输的单元之间的有线和无线连接来实现操作连接(operative linkage)。无线连接可使用无线lan(wlan)或互联网。有线连接可通过单元之间的光学和非光学电缆连接实现。用于有线连接的电缆进一步适于高通量数据传输。
78.以下结合附图对本技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本技术，并不用于限制本技术。
79.实施例1高通量测序分析
80.1、样本采集
81.收集4例脑卒中患者和4例健康对照者的血液样本。
82.1.1脑卒中患者纳入标准：
83.(1)诊断为脑卒中；
84.(2)尚未接受药物方式或手术等任何针对脑卒中的治疗；
85.(3)无感染性、自身免疫性或严重慢性疾病。
86.1.2健康对照者的纳入标准：
87.(1)男性或女性志愿者，年龄在20到90岁之间；
88.(2)身体健康，没有任何慢性、感染性或遗传学疾病；
89.(3)近期没有服用常规处方药；
90.(4)没有献血、怀孕，在研究开始前的3个月内没有接种过疫苗；
91.(5)非过敏体质；
92.(6)经常规体检确认身体健康。
93.2、实验方法
94.2.1血液总rna的提取
95.使用paxgene血液rna提取试剂盒(paxgene blood rna kit)提取外周血总rna。
96.2.2样品检测
97.使用agilent 2100bioanalyzer(agilent rna 6000nano kit)检测total rna的浓度、rin值、28s/18s和片段大小。
98.2.3文库的构建与转录组测序
99.1)dnase消化去除dna：利用dnase i消化total rna样品中存在的dna片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于depc水。
100.2)去除rrna：取消化好的total rna样品，使用试剂盒去除rrna，去除之后进行agilent 2100检测，验证rrna去除效果；
101.3)rna打断：取上一步样品，加入打断buffer，置于pcr仪中进行热打断，打断到130-160nt；
102.4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系mix，在pcr仪上按相应程序合成一链cdna；
103.5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在thermomixer上适温反应一定时间，合成二链cdna，反应产物用磁珠进行纯化回收。产物用磁珠进行纯化回收；
104.6)末端修复：配制末端修复反应体系，在thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cdna双链的粘性末端进行修复。末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于eb solution；
105.7)cdna末端加“a”：配制加“a”反应体系，在thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cdna的3’末端加上a碱基；
106.8)cdna adapter的连接：配制接头连接反应体系，在thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与a碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收。
107.9)pcr反应及产物回收：配制pcr反应体系，选择适当的pcr反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增。对pcr产物进行磁珠纯化回收。回收产物溶于eb溶液中。贴上标签，文库制备至此完成。
108.10)文库质量检测：使用agilent 2100bioanalyzer(agilent dna 1000reagents)检测文库的片段大小及浓度。
109.11)pcr产物环化：将pcr产物变性为单链后，配制环化反应体系，充分混匀适温反应一定时间，得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性dna分子后，即得到最终的文库。
110.12)上机测序：单链环状dna分子通过滚环复制，形成一个包含200多个拷贝的dna纳米球(dnb)。将得到的dnbs采用高密度dna纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内。通过
边合成边测序的方法，得到50bp/100bp的测序读长。
111.2.4测序数据质量控制
112.对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据(clean data)，步骤如下：去除reads中的adapter序列；剪切前去除5’端含有非agct的碱基；修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于q20)；去除含n的比例达到10％的reads；舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。
113.2.5与参考基因组比对
114.使用hisat2分析软件将测序数据比对到参考基因组上。参考基因组来自于ensembl数据库。
115.2.6基因表达水平分析
116.通过比对到参考基因组区域的序列(clean reads)的数量来计算基因的表达水平。使用stringtie根据hisat2软件的比对结果，计算每个基因/转录本在样本中的fpkm值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。
117.2.7 mrna差异表达分析
118.使用deseq2比较对照组跟疾病组mrna的表达差异，差异分析步骤如下：首先对原始的read count进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正；通过统计学模型进行假设检验概率(p-value)的计算，进行多重假设检验校正(bh)，得到padj值(错误发现率)，差异表达基因的筛选标准为：pvalue《0.05和|log2foldchange|》1。
119.3、结果与分析
120.与对照组相比，本发明所涉及的生物标志物daam2、echdc3、folr3在脑卒中患者中表达显著上调，差异具有统计学意义。
121.实施例2生物标志物表达情况
122.以来源于数据库的患有心源性脑栓塞受试者(n＝23，女性11例，男性12例)、无症状性血管疾病史的受试者(n＝23；11名女性，12名男性)的血液作为样本(数据集为gse58294)，对基因表达数据进行差异分析。把对应到多个基因的探针去掉，然后有多个探针对应的基因只保留平均表达量最大的一个探针。对数据集scale标准化。差异分析使用工具为r-4.0.5，采用metama、limma包分析，meta分析中p值合并所用方法为inverse normal method。metama包对p、fdr值计算的描述(calculates differential expression p-values and effect sizes from data either from classical or moderated t-tests(limma,smvar)for study and combines these p-values by the inverse normal method，fdr值计算：benjamini hochberg threshold.by default,the false discovery rate is controlled at 5％)。
123.差异表达基因筛选标准：adj.p.val《0.05&|logfc|》1，得到208个差异表达基因，本发明所涉及的生物标志物在心源性脑栓塞受试者中的表达情况如表1、图1-3所示，所述生物标志物在疾病组中均是表达上调的，差异具有统计学意义。
124.表1生物标志物在心源性脑栓塞患者血液样本中的表达情况
[0125][0126][0127]
实施例3诊断效能
[0128]
受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic,roc)能够直观地鉴别各诊断指标的诊断效能，roc曲线越靠近左上角，曲线下面积(area under curve,auc)越大，诊断价值越高(参考the meaning and use of the area under a receiver operating characteristic(roc)curve.[j].radiology,1982)。本发明使用r语言proc对上述基因进行roc诊断分析，以筛选具有诊断价值的生物标志物。
[0129]
结果：
[0130]
auc＞0.5的情况下，auc值越接近1，表明诊断标志物的诊断效果越好。基于geo数据集，本发明利用r语言绘制了本发明所涉及的基因的roc曲线。结果如图4-6所示，本发明所述的基因的auc值基本位于0.70～0.85，其中，daam2(auc＝0.733)，echdc3(auc＝0.829)，folr3(auc＝0.826)，进一步分析生物标志物组合的诊断效能，如图7-10，表2所示。
[0131]
表2生物标志物组合诊断效能
[0132]
生物标志物组合aucdaam2+echdc30.825echdc3+folr30.909daam2+folr30.872daam2+echdc3+folr30.922
[0133]
与单个生物标志物或两个生物标志物相比，三个生物标志物组合具有更好的诊断效能。上述结果证明，本发明所涉及的生物标志物可用于诊断心源性脑栓塞。
[0134]
以上结合附图详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本技术对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本技术的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本技术的思想，其同样应当视为本技术所公开的内容。