用于检测巴贝斯虫的引物探针组合物、试剂盒及方法与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于检测巴贝斯虫的引物探针组合物、试剂盒及方法。


背景技术：

2.巴贝斯虫是一种蜱传性的血液虫病，该病由寄生于红细胞内的多种巴贝斯虫引起的，其临床特征为发热、精神沉郁、嗜睡、黄疸、贫血、呕吐、呼吸困难等，对犬的健康造成了巨大的危害。犬巴贝斯虫病常规的病原学诊断是血液涂片是染色镜检，是作出诊断的主要依据，但是镜检的敏感性低。pcr技术为准确地诊断感染早期的病犬和带虫犬提供了敏感性高、特异性好的检测方法。而且pcr技术具有操作简便，试剂容易获得，检测速度快的优点。试剂盒中阳性对照和阴性对照，可有效的防止假阳性和假阴性的发生。


技术实现要素：

3.本发明的目的是克服现有技术中检测巴贝斯虫操作时间长和准确度不高的问题。
4.为此，本发明提供了一种用于检测巴贝斯虫的引物探针组合物，包括：
5.正向引物，其序列为：5
’‑
ttcagccttgcgaccatact-3’；
6.反向引物，其序列为5
’‑
gataccgtcgtagtcctaacca-3’；
7.探针，其序列为：5
’‑
ccagaacccaaagactttgatttctctcaa-3’。
8.具体的，上述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
9.具体的，上述荧光报告基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的一种。
10.具体的，上述pcr反应液包括上述任意一项所述的用于检测巴贝斯虫的引物探针组合物。
11.具体的，上述pcr反应液包括：1-5mm的mgcl2、20-50mm的tris、100-500mg/l的bsa、10-100μm的dntps、0.1-1.0μm的正向引物、0.1-1.0μm的反向引物、0.1μm的探针。
12.具体的，上述用于检测巴贝斯虫的试剂盒还包括酶混合液；所述酶混合液包括1-5u/μl的dna聚合酶和1-5u/μl热启动修饰抗体。
13.具体的，上述用于检测巴贝斯虫的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为巴贝斯虫阳性样本；所述阴性对照为超纯水。
14.本发明还提供了一种用于检测巴贝斯虫的方法，包括以下步骤：
15.(1)提取待测样本的dna；
16.(2)以待测样本的dna为模板，进行荧光定量pcr反应，所述pcr反应体系包括上述任意一项所述的用于巴贝斯虫的引物探针组合物；
17.(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。
18.具体的，上述步骤(2)中pcr反应程序为：95℃，3min；94℃，10s，58℃，20s，40个循环。
19.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
20.本发明提供的这种以用于检测巴贝斯虫的引物探针组合物作为主要成分的试剂盒耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高，为诊断巴贝斯虫提供可靠的实验依据。
21.以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
22.图1是本发明实施例2中pcr反应结果。
具体实施方式
23.下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
24.本发明提供了一种用于检测巴贝斯虫的引物探针组合物，包括：
25.正向引物，其序列为：5
’‑
ttcagccttgcgaccatact-3’；
26.反向引物，其序列为5
’‑
gataccgtcgtagtcctaacca-3’；
27.探针，其序列为：5
’‑
ccagaacccaaagactttgatttctctcaa-3’。
28.探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。其中，荧光报告基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的一种。
29.本发明还提供了一种用于检测巴贝斯虫的试剂盒，包括pcr反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照。
30.其中，pcr反应液包括上述任意一项所述的用于检测巴贝斯虫的引物探针组合物。具体的，pcr反应液包括：1-5mm的mgcl2、20-50mm的tris、100-500mg/l的bsa、10-100μm的dntps、0.1-1.0μm的正向引物、0.1-1.0μm的反向引物、0.1μm的探针；
31.酶混合液包括1-5u/μl的dna聚合酶和1-5u/μl热启动修饰抗体。
32.阳性对照为临床收集的巴贝斯虫阳性样本；阴性对照为超纯水。
33.本发明还提供了一种用于检测巴贝斯虫的方法，包括以下步骤：
34.(1)提取待测样本的dna；
35.(2)以待测样本的dna为模板，进行荧光定量pcr反应，所述pcr反应体系包括上述任意一项所述的用于巴贝斯虫的引物探针组合物；pcr反应程序为：95℃，3min；94℃，10s，58℃，20s，40个循环；
36.(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。
37.下面通过具体实施例对本发明的用于检测巴贝斯虫的引物探针组合物、试剂盒及方法的效果进行研究。
38.实施例1：
39.本实施例提供了一种用于检测巴贝斯虫的试剂盒，包括如下组分：
40.(1)pcr反应液：2mm的mgcl2、50mm的tris、500mg/l的bsa、100μm的dntps、0.1μm的
正向引物、0.1μm的反向引物、0.1μm的探针。
41.正向引物序列为：5
’‑
ttcagccttgcgaccatact-3’；
42.反向引物序列为5
’‑
gataccgtcgtagtcctaacca-3’；
43.探针序列为：5
’‑
ccagaacccaaagactttgatttctctcaa-3’。
44.探针的5’端标记有fam荧光报告基团，3’端标记有bhq1荧光淬灭基团。
45.(2)酶混合液：5u/μl的dna聚合酶和1u/μl的热启动抗体；
46.阳性对照：临床收集的巴贝斯虫强阳性样本；
47.阴性对照：超纯水。
48.实施例2：
49.本实施例提供了一种使用实施例1中试剂盒检测巴贝斯虫的方法，包括以下步骤：
50.(1)从冰箱中取出试剂盒，使试剂盒中所需试剂充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
51.(2)核算当次实验所需要的反应数(n)，并根据如下所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
52.n＝阴性对照数(1t)+阳性对照数(1t)+误差预留量(1t)+样本数
[0053][0054]
(3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照3.0μl/孔分装量将试剂分装至芯片的孔上。
[0055]
(4)使用商品化核酸提取试剂盒，进行dna提取，作为待测样本备用。
[0056]
(5)在步骤(3)制备好的芯片反应样本管中分别加入处理好的待测标本、阳性对照、阴性对照各2.0μl，使反应终体积为5μl/孔，盖好pcr反应盖，转移到q3-pllus微型荧光定量pcr仪上进行pcr扩增，反应程序为：95℃，3min；94℃，10s，58℃，20s，40个循环；检测荧光选择fam。
[0057]
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
[0058]
阳性对照ct值小于38，阴性对照ct无数值；在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的s型曲线，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
[0059]
采用本发明提供的方法检测巴贝斯虫时，判断标准如下：
[0060]
1、检测样本ct≤38.0者判为阳性。
[0061]
2、38.0＜ct≤40的检测样本建议重做，重做结果中ct值《40者为阳性，否则为阴性。
[0062]
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。