一种血浆外泌体CircOGDH作为急性缺血性卒中诊断性生物标志物的应用

一种血浆外泌体circogdh作为急性缺血性卒中诊断性生物标志物的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种血浆外泌体circogdh作为急性缺血性卒中诊断性生物标志物的应用。


背景技术：

2.急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,ais)，又称脑梗死，是指各种原因所致脑部血液供应突然中断所导致的局部脑组织缺血、缺氧性坏死，从而出现相应神经功能缺损的一类临床综合征，其发病率高，是人类死亡和致残的病主要病因。急性缺血性脑卒中治疗的关键在于尽早开通阻塞血管、挽救缺血半暗带。目前静脉溶栓治疗和动脉取栓治疗急性脑梗死的主要的治疗手段，治疗时间越早，获益越多，但是静脉溶栓治疗和动脉取栓治疗都有时间窗，超过时间窗的患者就无法接受这两种有效的治疗方法。以静脉溶栓治疗为例，目前的临床治疗指南推荐对脑梗死发病4.5小时内符合适应证的患者推荐基于临床和颅脑ct选择给予静脉溶栓治疗，但是颅脑ct是无法识别24小时内的脑梗死，仅仅可以排除脑出血。目前临床医师根据临床体征和颅脑ct诊断患者病情时，经常会将癔症、短暂性脑缺血发作(transient ischemic attacks，tia)、癫痫的todd麻痹等误诊为脑梗死，从而选择进行静脉溶栓治疗，这会增加患者出血的风险和经济负担。并且在许多偏远地区的医院，因缺乏诊断脑梗死所需的成像设备而无法开展静脉溶栓治疗。因此，目前临床亟需一种方便快捷的可以协助诊断ais的生物标记物。
3.环状rna(circrna)是一类具有特殊封闭环状结构的非编码rna分子。由于其封闭的共价结构和对核酸外切酶的抗性，circrna比其他线性rna表达稳定不易被核酸外切酶降解。除此以外，circrnas碱基序列和表达在物种间相当保守上，这些特点使得环状rna在作为新型临床诊断标记物的方面具有明显优势。circrnas在大脑突触中高度富集，目前在多种神经系统疾病中被发现有作为生物标记物的潜在价值。外泌体是指从各种细胞中释放的纳米级细胞外囊泡，一般呈杯状的圆形结构，其直径约为40-150nm。外泌体存在于几乎所有体液中，包括血浆、脑脊液等，并且外泌体中富含许多生物活性分子，如非编码rna、蛋白质和脂质等。据报道，circrna在外泌体中有较高含量，与保留在细胞中的circrna相比，circrna在外泌体中富集至少两倍，并且外泌体可以穿过血脑屏障。这些证据使得外泌体中的环状rna可以作为中枢神经系统疾病或其他疾病有很大潜力的生物标记物。我们前期实验通过对mcao小鼠脑组织二代测序数据和血液芯片数据进行联合再分析，筛选得到酮戊二酸脱氢酶(oxoglutarate dehydrogenase，ogdh)基因转录生成的环状rna ogdh(circular rna ogdh，circogdh)。并进一步通过实验发现circogdh主要在缺血半暗带神经元胞质内高表达，可以通过外泌体途径转移到外周血，从而引起血浆外泌体内circogdh的高表达。目前，外泌体circogdh与急性缺血性脑卒中病理变化的相关性及其应用未见报道。


技术实现要素：

4.鉴于目前急性缺血性卒中缺少生物标记物协助诊断的问题，本发明提出一种血浆外泌体circogdh作为急性缺血性卒中诊断性生物标志物的应用。
5.本发明的目的之一在于，血浆外泌体circogdh在用于制备急性缺血性卒中的诊断性生物标志物的用途。
6.本发明的目的之二在于，血浆外泌体circogdh作为诊断生物标志物在用于制备急性缺血性卒中的检测试剂中的应用。
7.进一步的，所述血浆外泌体circogdh为环状rna circogdh，包括鼠源circogdh mmu_circ_0000231的核苷酸序列如seq id no:1所示，其对应的亲本基因位于chr11:6213790-6217083，以及人源circogdh hsa_circ_0003340的核苷酸序列如seq id no:2所示，其对应的亲本基因位于chr7:44684925-44687358。所述的circogdh为相关数据库(例如circbase数据库)中rna的代号，可以在数据库中检索得到。
8.本发明的目的之三在于，一种急性缺血性卒中的诊断试剂盒或诊断制剂，包括测定血浆外泌体circogdh的表达量的试剂。
9.进一步的，还包括聚合物沉淀法提取外泌体的试剂，或者其他分离外泌体方法的试剂。
10.进一步的，所述试剂的引物包括检测鼠源circogdh mmu_circ_0000231的引物：
11.上游引物：5
’‑
aactcgtggaggaccacttg-3’，如seq id no.3所示；
12.下游引物:5
’‑
gagcttcgactcagggaaag-3’，如seq id no.4所示；
13.检测使用的内参为actin，检测actin的引物：
14.上游引物：5
’‑
acggccaggtcatcactattg-3’，如seq id no.5所示；
15.下游引物：5
’‑
caagaaggaaggctggaaaaga-3’，如seq id no.6所示。
16.进一步的，所述试剂的引物包括检测人源circogdh has_circ_0003340的引物：
17.上游引物：5
’‑
gtcgctcatcagggcatatc-3’，如seq id no.7所示；
18.下游引物：5
’‑
gcttctaccagggactgtgc-3’，如seq id no.8所示；
19.检测使用的内参为actin，检测actin的引物：
20.上游引物：5
’‑
aaggattcctatgtgggcgac-3’，如seq id no.9所示；
21.下游引物：5
’‑
cgtacagggatagcacagcc-3’，如seq id no.10所示。
22.本发明的诊断试剂盒或诊断制剂还包括pcr反应常用试剂，如taq酶，逆转录酶，缓冲液，dntps，mgcl2和depc水等；还可以含有标准品和/或阳性阴性对照品；本发明还可以选用β-actin或gapdh作为内参。
23.本发明的诊断试剂盒或诊断制剂还包含其它一些辅助耗材，这些为专业领域技术人员所熟知。所述的试剂或耗材包括但不限于：荧光定量pcr反应板、pcr反应板封口膜等。
24.本发明的环状rna circogdh在急性缺血性卒中发病后，在缺血缺氧的神经元中具有高表达，并通过外泌体从脑组织转运到外周血，从而导致血浆中外泌体circogdh表达升高，因此可作为诊断性生物标志物用于急性缺血性卒中的检测。此外，本发明的血浆外泌体circogdh作为诊断急性缺血性卒中的生物标志物具有较高的敏感性和特异性，具有临床推广价值。
附图说明
25.图1为敲低mcao模型小鼠脑组织circogdh导致血清circogdh表达下调。其中：a)小鼠实验设计流程图。b)将小鼠分为sham+sh_circctrl组、mcao+sh_circctrl组和mcao+sh_circogdh组进行实验，rt-qpcr分析各组小鼠血清中circogdh的表达水平。数据以平均值
±
标准差表示，三组小鼠例数分别为4、5、6例。
**
p《0.01mcao+sh_circctrl组和sham+sh_circctrl组比较,
&&&
p《0.001mcao+sh_circogdh组和mcao+sh_circctrl组的比较,单因素方差分析检验；
26.图2为原代神经元外泌体的鉴定。其中：a)透射电镜下观察原代神经元外泌体形态。标尺为100nm。b)通过纳米颗粒跟踪分析评估常氧组和缺血缺氧再灌注组外泌体的分布大小。c)western blot图像显示，在神经元细胞和神经元外泌体中外泌体蛋白标记物(cd63、tsg101和hsp90)和内质网标记蛋白calnexin的相对表达水平；
27.图3为神经元外泌体circogdh高表达。采用rt-qpcr方法分析对照和缺氧复灌神经元外泌体中circogdh的表达水平。数据以3个独立实验的平均值
±
标准差表示。
**
p《0.01,双尾t检验；
28.图4为血浆外泌体的提取和鉴定。其中：a)透射电镜下观察对照组受试者血浆外泌体形态。标尺为100nm。b)通过纳米颗粒跟踪分析评估ncd对照组受试者外泌体的分布大小；
29.图5为circogdh在ais患者血浆外泌体中表达水平增高。其中：a)rt-qpcr方法检测急性缺血性卒中(ais)组和非脑血管病对照组(ncd)血浆外泌体的circogdh表达水平，非脑血管病对照组(ncd)n＝30,ais组n＝31，
**
p《0.01,双尾t检验。b)ais发病24小时内血浆外泌体circogdh表达水平的roc曲线，ncd对照组n＝30,ais组n＝31。circogdh曲线下面积(auc)为0.8817，敏感性为80.65％，特异性为86.67％。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明设计、阳性样本验证和结果分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
31.实施例1.缺血缺氧神经元通过外泌体转运circogdh到外周血
32.为了验证“circogdh是否可以通过外泌体从缺血的脑组织转运到外周血”这个科研设想，我们构建了腺病毒包装的shrna，其靶向circogdh的反向剪接位点以敲低circogdh的表达，并携带gfp荧光蛋白，英文缩写为adv_gfp_shrna_circogdh，简称sh_circogdh；阴性对照(negative control，nc)腺病毒英文缩写为adv_gfp_shrna_nc，简称sh_circctrl，并通过实验验证了sh_circogdh腺病毒可以敲低小鼠脑组织circogdh。此外，我们进一步设计了以下实验：将小鼠分为sham(假手术)+sh_circctrl组、大脑中动脉阻塞模型(mcao)+sh_circctrl组和mcao+sh_circogdh组，在实验第1天向小鼠脑组织立体定位注射sh_circctrl或sh_circogdh腺病毒，在转染病毒后第6天造mcao模型，造模3小时后收集小鼠血清，使用实时荧光定量pcr(rt-qpcr)检测circogdh在mcao小鼠血清的表达水平(图1a)，结果显示:与sham+sh_circctrl组相比，mcao+sh_circctrl组中circogdh表达显著上调(p《0.01)；而在mcao+sh_circogdh组(circogdh敲低组)，血清中circogdh的水平较mcao+sh_
circctrl组显著降低(p《0.001)(图1b)。该实验说明敲低mcao模型小鼠脑组织circogdh会降低血清的circogdh表达量，结合前期的实验结果，我们证实了circogdh是通过外泌体途径从缺血的脑组织转运到外周血。
33.实施例2.缺血缺氧神经元中外泌体circogdh高表达
34.2.1原代神经元外泌体的提取和鉴定
35.将原代神经元培养至第5天后，分为常氧组和缺血缺氧再灌注(anoxia-ischemia(ai)/reperfusion)组两组进行造模，造模结束后使用超高速离心法从原代神经元培养基中纯化外泌体。透射电镜显示，从原代神经元培养基中收集的外泌体的平均大小约为100nm(图2a)。通过纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，nta)进一步确认两组原代神经元外泌体的大小，常氧组峰值对应的粒径为143nm，缺血缺氧再灌注组峰值对应的粒径为150nm，均基本符合外泌体粒径大小(图2b)。western blot实验证实，原代神经元外泌体中存在cd63、tsg101和hsp70外泌体蛋白标记物(图2c)。
36.2.2缺血缺氧再灌注原代神经元外泌体circogdh高表达
37.使用超高速离心法提取神经元外泌体后，我们用实时荧光定量定量pcr(rt-rt-qpcr)检测常氧组和缺血缺氧再灌注组神经元外泌体circogdh的表达量，结果发现缺血缺氧再灌注组神经元外泌体circogdh的表达量显著提高(p《0.01)(图3)。
38.实施例3.急性缺血性卒中(ais)患者外泌体血浆circogdh高表达
39.3.1血浆外泌体的提取和鉴定
40.我们使用聚合物沉淀法从非脑血管病对照组(non-cerebrovascular disease controls,ncd)受试者的血浆中纯化外泌体。透射电镜显示，从患者血浆中收集的外泌体的平均大小约为100nm(图4a)。通过纳米颗粒跟踪分析(nta)进一步确认从ncd对照组受试者血浆外泌体的大小，ncd对照组峰值对应的粒径为126nm，均基本符合外泌体粒径大小(图4b)。
41.3.2circogdh在ais患者血浆外泌体中表达水平增高
42.我们将研究对象的血浆提取外泌体并检测外泌体的circogdh表达量，其中缺血性脑卒中组患者31例、ncd对照组30例。我们采用rt-qpcr方法检测ais组和对照组血浆外泌体的circogdh表达水平，结果显示ais组血浆外泌体circogdh表达水平明显高于对照组(p《0.05)(图5a)。我们做roc曲线去评价ais发病24小时内血浆外泌体circogdh表达水平作为诊断ais生物标记物的价值，结果显示：circogdh曲线下面积(auc)为0.8817；约登指数最大时，cut-off值为1.6732，敏感性为80.65％，特异性为86.67％(图5b)。
43.综述所述，本发明专利表明缺血性脑卒中发病后，缺血缺氧的神经元中circogdh高表达，并可将circogdh通过外泌体从脑组织转运到外周血，从而导致血浆中外泌体circogdh表达升高。此外，本发明专利还表明血浆外泌体circogdh作为诊断ais的生物标记物具有较高的敏感性和特异性。
44.以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。