一种蔗糖磷酸化酶及葡萄糖-1-磷酸生产工艺的制作方法

1.本发明涉及酶催化技术领域，具体领域为一种蔗糖磷酸化酶及葡萄糖-1-磷酸生产工艺。


背景技术：

2.在碳水化合物的代谢中，葡萄糖-1-磷酸(α-glucose-1-phosphate)是一个重要的中间体，它是由a-1,4-葡聚糖的末端葡萄糖基连接的磷酸化作用形成的。为了通过细胞的分解代谢产生能量和代谢物，g1p被磷酸葡糖异构酶转化为d-葡萄糖-6-磷酸(g6p)，然后进入葡萄糖分解途径。
3.g1p也用作细胞中糖共轭物的生物合成的重要起始材料，特别是对于核糖焦磷酸化酶催化的核苷酸二磷酸葡萄糖(ndp-葡萄糖)的合成。此外，g1p可能具有医疗价值，用于制备细胞抑制剂、治疗心脏病药物、抗生素和抗肿瘤药物的重要原料。
4.葡萄糖-1-磷酸(α-glucose-1-phosphate)广泛存在于动物、植物和微生物中，并在生物体内发挥着重要作用。g-1-p是多糖(如糖原)降解的第一个产物。它可以在葡萄糖磷酸酯异构酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸，并进入emp途径；它还可以用于核酸二磷酸酯。在葡萄糖焦磷酸化酶的催化下合成ndp-葡萄糖，进一步用于合成各种糖类。还是一种潜在的抗生素或免疫抑制药物，用于生产线性直链淀粉和其他相关葡萄糖聚合物，用于合成直链淀粉－脂质复合物和糖工程。
5.在生物体中，葡萄糖-1-磷酸(g-1-p)是通过葡聚糖磷酸化酶催化糖原，淀粉或者麦芽糊精等多糖和无机磷酸盐反应产生的，它是糖异生途径的第一个代谢物，可以在葡萄糖磷酸变位酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸，进入糖酵解或者其他代谢途径。
6.作为一种活化葡萄糖，葡萄糖-1-磷酸(α-glucose-1-phosphate)在复合糖化合物(比如糖脂、寡糖、糖核苷酸)的合成中是一种重要的前体。此外，该化合物还可以用于合成人工淀粉，通过生物糖电池产生电力，以及高得率产氢。迄今为止，葡萄糖1-磷酸的应用仍未得到充分发掘，这可能缘于其过高的生产成本。
7.葡萄糖-1-磷酸(α-glucose-1-phosphate)作为有价值的化合物，能够通过糊精或者其他淀粉类物质酶解生成。葡萄糖-1-磷酸作为合成葡萄糖醛酸的前体物质，也可以用作底物合成线性麦芽寡糖和α，α-海藻糖。
8.目前，主要有两种生物方法来生产葡萄糖-1-磷酸：
9.(1)用蔗糖磷酸化酶来催化磷酸和蔗糖生成葡萄糖-1-磷酸。
10.(2)以淀粉或者麦芽糊精为底物，用α-1，4-葡聚糖磷酸化酶降解生成。
11.以淀粉和麦芽糊精作为底物由葡聚糖磷酸化酶催化生产葡萄糖-1-磷酸成本更低，但难以达到高浓度的葡萄糖-1-磷酸生产，目前已有的报道中最高者仅为0.2m产物(折合52g/l)，距工业化应用较远。
12.用蔗糖磷酸化酶来催化磷酸和蔗糖生成葡萄糖-1-磷酸是更加高效的一种途径，且目前已有报道生成0.5m的葡萄糖-1-磷酸(折合130g/l)。虽然蔗糖磷酸化酶工艺仅有
50％的理论产率，并且可能具有高产品分离成本，但是可以通用工艺改进(如添加果糖异构酶)重新进入代谢途径(如生成葡萄糖-6-磷酸进入代谢途径或者进一步变位重新生成葡萄糖-1-磷酸)。


技术实现要素：

13.本发明的目的在于提供一种蔗糖磷酸化酶及葡萄糖-1-磷酸生产工艺。
14.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
15.一种蔗糖磷酸化酶，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
16.本发明的蔗糖磷酸化酶的反应速度高于野生型蔗糖磷酸化酶的反应速度。其转化率大于85％，远高于野生型。
17.一种葡萄糖-1-磷酸的生产工艺，具体为：取蔗糖母液，加入缓冲液、纯水，加入所述蔗糖磷酸化酶的粗酶液，37℃反应。
18.经过实验验证，该蔗糖磷酸化酶的最高底物浓度可高达342g/l；且3小时内转化率大于85％。
19.其中，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
20.(1)通过全基因合成的方法，将seq id no：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体表达，以实现在大肠杆菌中的高表达；
21.(2)摇瓶发酵
22.挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基a中，30℃，250rpm过夜培养；
23.次日取1l三角瓶，按1：100的接种比实施例接入到100ml高压灭菌后的培养基b中，于30℃中培养至菌体od 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时；
24.培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；同时取2克菌体加入6ml纯水超声破碎后进行sds-page检测，并将粗酶液-20℃保存；
25.(3)分批补料发酵
26.分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，初级接种菌种制备200ml培养物，od2.0时接入；在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的ph值由50％正磷酸和30％氨水维持在7.0；
27.发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当od600为35.0时，用0.2mm iptg诱导16小时；取2克菌体加入6ml纯水超声破碎后进行sds-page检测，并将粗酶液-20℃保存。
28.进一步的，步骤(2)中所述培养基a为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。
29.所述培养基b为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘
油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。
30.进一步的，步骤(3)中所用的培养基为：酵母抽提物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖0.4％，2.31g/l磷酸二氢酶和12.54g/l磷酸氢二钾，ph 7.0。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
32.本发明的反应体系转化率高，反应速度快，在高浓度蔗糖反应时，仍可保持3小时反应时间蔗糖转化率大于85％，并有效抑制副产物葡萄糖的生成；尤其适用于工业大规模生产葡萄糖-1-磷酸，可取得较好的社会效益和经济价值。
附图说明
33.图1为底物0小时hplc图谱；10分钟为蔗糖；
34.图2为实施例2的检测结果，10分钟为蔗糖，8.2分钟为目标产物，11.7分钟是葡萄糖，12.8分钟为果糖；
35.图3为对比例1的检测结果，10分钟为蔗糖，8.2分钟为目标产物，11.7分钟是葡萄糖，12.8分钟为果糖；
36.图4为实施例3的检测结果，10分钟为蔗糖，8.2分钟为目标产物，11.7分钟是葡萄糖，12.8分钟为果糖；
37.图5为对比例2的检测结果，10分钟为蔗糖，8.2分钟为目标产物，11.7分钟是葡萄糖，12.8分钟为果糖。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.以下实施例中涉及到的检测条件如下。
40.液相检测条件：
41.流动相：5mm硫酸
42.检测器：示差检测器
43.流速：0.6ml/min
44.柱温：50℃
45.示差检测器池温度：50℃
46.使用250mm*4.6um飞诺美有机酸柱。
47.实施例1粗酶液的制备
48.(1)通过全基因合成的方法，将seq id no：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列seq id no：3进行组装，并克隆到原核表达载体表达，以实现在大肠杆菌中的高表达，并命名为zy4。
49.同样的，将对照野生型蔗糖磷酸化酶蛋白seq id no：2的对应编码多核苷酸序列seq id no：4进行组装，并克隆到原核表达载体表达，命名为zy3。
50.(2)摇瓶发酵
51.挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶，按1：100的接种比实施例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取2克菌体加入6ml纯水超声破碎后进行sds-page检测，并将粗酶液-20℃保存。
52.(3)分批补料发酵：
53.分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容量为15l，工作体积为8l，所用到的培养基为酵母抽提物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖0.4％，2.31g/l磷酸二氢酶和12.54g/l磷酸氢二钾，ph 7.0。初级接种菌种制备200ml培养物，od2.0时接入。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的ph值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油。当od600约为35.0(湿重约为60g/l)时，用0.2mm iptg诱导16小时。取2克菌体加入6ml纯水超声破碎后进行sds-page检测，并将粗酶液-20℃保存。
54.实施例2催化反应应用实例
55.先配制蔗糖母液(800g/l)，取800g蔗糖，加水定容至1l加热助溶，待用。
56.5ml离心管中，配制总反应体系1ml，50mm mes ph6.5，终浓度0.8m pb ph6.5，0.8m蔗糖(约274g/l)，补水至0.9ml，调ph至6.5后，加入酶液zy4 0.1ml，37℃摇床反应。3小时取样检测。hplc结果见图2。蔗糖3小时转化率90％，且副产物葡萄糖的生成量较小。
57.对比例1催化反应的对照
58.5ml离心管中，配制总反应体系1ml，50mm mes ph6.5，终浓度0.8m pb ph6.5，0.8m蔗糖，补水至0.9ml，调ph至6.5后，加入酶液zy3 0.1ml，37℃摇床反应。3小时取样检测。hplc结果见图3。蔗糖3小时转化率87％。且目的产物的浓度仅为实施例2的83％，检测图谱上可见生成了较多的副产物葡萄糖，降低了有效转化率。
59.实施例3高浓度催化反应实例
60.5ml离心管中，配制总反应体系1ml，50mm mes ph6.5，终浓度1m pb ph6.5，1m蔗糖(约342g/l)，补水至0.9ml，调ph至6.5后，加入酶液zy4 0.1ml，37℃摇床反应。3小时取样检测。hplc结果见图4。蔗糖3小时转化率90％。
61.对比例2高浓度催化反应对照实例
62.5ml离心管中，配制总反应体系1ml，50mm mes ph6.5，终浓度1m pb ph6.5，1m蔗糖，补水至0.9ml，调ph至6.5后，加入酶液zy3 0.1ml，37℃摇床反应。3小时取样检测。hplc结果见图5。蔗糖3小时转化率88％。且目的产物的浓度仅为实施例3的87％，检测图谱上可见生成了较多的副产物葡萄糖，降低了有效转化率。
63.通过上述实验结果的对比可以看出，本发明的蔗糖磷酸化酶比野生型蔗糖磷酸化酶有效转化率高，副产物少，且反应速度更快。且在高浓度底物下仍可在短时间内催化反应，明显提高生产效率、减小能耗并综合缩减成本；本反应体系转化率高，反应速度快，在高浓度蔗糖反应时，仍可保持3小时反应时间蔗糖转化率大于85％，并有效抑制副产物葡萄糖的生成。尤其适用于工业大规模生产葡萄糖-1-磷酸，可取得较好的社会效益和经济价值。
64.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。