外泌体分离系统的制作方法

1.本实用新型涉及外泌体分离系统，尤其是用于大规模外泌体分离的工艺系统。


背景技术：

2.外泌体(exosomes)是活细胞分泌的，大小为30-200nm，密度为1.13-1.18g/ml的双层膜结构囊泡状小体。外泌体携带了多种生物活性物质(如蛋白质、脂质、mirna等)，因此由细胞分泌的外泌体可代替细胞发挥修复治疗多种重要器官及组织损伤的功能。而且，外泌体的应用避免了细胞直接移植存在的多种潜在风险，且免疫原性低又便于保存和运输，作为“无细胞的细胞治疗技术”显示出独特的优势。因为外泌体的独特运输特性，其也被研究做为药物递送载体，如递送rna用于基因治疗。而做为递送平台，外泌体的需求量非常大，仅在一只动物(如小鼠)身上进行实验就需要10
9-10
11
个外泌体，因此大规模生产外泌体以及大规模分离外泌体是外泌体临床转化的重要的技术。
3.获取高纯度、高产量、标准化的外泌体，是外泌体广泛应用的前提条件。然而，针对外泌体的分离纯化方法还没有统一的标准，严重制约着外泌体相关的基础研究及临床应用。目前已有多种方法用于分离外泌体，如超速离心法、密度梯度离心法、免疫分离法及聚合沉淀法等，但都具有一定的局限性。超速离心法是最常用的方法，被视为外泌体提取的“金标准”，但需要配备昂贵的超速离心机，且操作复杂，耗时久，产量低，难以大规模地处理大体积样品；免疫分离法则只能特异性富集表达某种或某几种特异性表面蛋白质的外泌体，需要用到抗体等昂贵试剂，同样难以大规模处理大体积的样品；聚合沉淀法获得的外泌体通常会混有蛋白质和聚合物等杂质，纯度低，且外泌体的活性得不到保障，使后续分析受到一定的限制。因此，为了加速外泌体的应用，开发一种装置，用于大规模地分离纯化外泌体，具有重要的意义。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本实用新型提供了一种外泌体分离系统，其包括：
5.1)第一死端过滤装置，用于从包括所述外泌体的细胞培养上清液中除去粒径大于所述外泌体的粒径的细胞组分；
6.2)与所述第一死端过滤装置连接的第一容器，其容纳经所述死端过滤装置过滤后的滤出液；以及
7.3)切向流过滤装置，用于对所述第一容器中的所述滤出液进行循环浓缩，同时除去粒径小于所述外泌体的粒径的细胞组分。
8.在一些实施方案中，所述第一死端过滤装置包括至少两个串联连接的死端过滤器。
9.在一些实施方案中，至少一个所述死端过滤器为滤孔孔径为0.22μm的囊式过滤器。
10.在一些实施方案中，所述切向流过滤装置包括截留分子量为100～750kd的中空纤
维柱。
11.在一些实施方案中，所述切向流过滤装置的进口和出口分别与所述第一容器的同一侧的下部连接。
12.在一些实施方案中，所述外泌体分离系统还包括，第一蠕动泵，用于向所述第一死端过滤装置输入包括所述外泌体的细胞培养上清液；第二蠕动泵，用于将所述第一容器中的所述滤出液输入所述切向流过滤装置。
13.在一些实施方案中，所述外泌体分离系统还包括与所述切向流过滤装置的透过口相连的第二容器，用于容纳来自所述切向流过滤装置的透出液。
14.在一些实施方案中，所述外泌体分离系统还包括与所述第一容器相连的第三容器，用于容纳经浓缩的、包括所述外泌体的所述滤出液。
15.在一些实施方案中，所述外泌体分离系统在所述第一容器和所述第三容器中间还包括用于进行除菌过滤的第二死端过滤装置。
16.在一些实施方案中，所述外泌体的平均粒径为30-200nm。
17.本实用新型提供的用于外泌体大规模分离的工艺系统，解决了现有技术中操作复杂、样本量小、重复性差，不能用于大规模制备外泌体的问题。
附图说明
18.图1为本实用新型外泌体分离系统的结构示意图。
19.图2为本实用新型外泌体分离系统的一个具体实例的结构图。
20.图3为培养的细胞随时间的增殖曲线图。
21.图4为分离的外泌体的电镜图。(a)从实施例2day4细胞上清分离的外泌体的电镜图；(b)实施例3分离的外泌体的电镜图；(c)实施例4分离的外泌体的电镜图；(d)实施例5分离的外泌体的电镜图；(e)实施例6分离的外泌体的电镜图；(f)实施例7超速离心所分离的外泌体的电镜图。
22.图5为分离的外泌体的粒径分布示意图。(a)实施例2中不同培养天数分离的外泌体粒径分布示意图；(b)实施例3分离的外泌体粒径分布示意图；(c)实施例4分离的外泌体粒径分布示意图；(d)实施例5分离的外泌体粒径分布示意图；(e)实施例6分离的外泌体粒径分布示意图；(f)实施例7分离的外泌体粒径分布示意图。横坐标为粒径(nm)，纵坐标为浓度(颗粒数/ml)。
23.图6为实施例4分离的外泌体的蛋白标志物表达电泳图。
具体实施方式
24.除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0025]“死端过滤”，也称为“垂直过滤”或“全量过滤”，指溶剂和小于过滤孔的溶质 (如小颗粒物)在压力的驱动下穿过过滤装置的过滤孔(流动方向大体上与过滤膜表面垂直)，而大于过滤孔的颗粒被截留，通常留在过滤装置中，例如堆积在过滤膜表面上。加压或者抽真空的方式可以为过滤提供所需的压力。过滤过程中，随着过滤膜表面上堆积的颗粒逐渐增多，过滤阻力增大，过滤速率会下降。因此，死端过滤是间歇式的，通常需要周期性地停下
来清洗膜表面的污染层，或者更换过滤膜。
[0026]“切向流过滤”，也称为“错流过滤”，指过滤时液体流动方向与过滤方向呈大体上成垂直角度，即液体流动方向基本上与滤膜表面平行(即切向流)，而滤出液的流动方向基本上与滤膜表面垂直。切向流可以对过滤膜表面进行有效清洗，把表面的截留物冲刷掉，使过滤膜恢复保持过滤能力。切向流过滤的运行方式比较灵活，既可以间歇运行，又可以连续运行。
[0027]
在提及粒径大小时，例如提及“粒径大于外泌体的粒径”的细胞组分，是指这些细胞组分的粒径均值大于外泌体粒径均值，例如，细胞组分的粒径均值可以为外泌体粒径均值的1.5倍、2倍、3倍、4倍或更高，或指这些细胞组分的大部分的粒径大于外泌体粒径均值，例如，至少60％、70％、80％或至少90％的细胞组分的粒径大于外泌体粒径均值。类似地，本领域技术人员可以容易地理解“粒径小于外泌体的粒径”的细胞组分或颗粒物的含义。由于待分离的外泌体的粒径及其分布范围可以随其分泌细胞(或细胞状态) 的不同而变化，本文使用的过滤装置的孔径也可以相应地进行调整。
[0028]
通过过滤从原液(如细胞培养上清液)中“除去”细胞组分指将这些细胞组分与待分离的外泌体分开。本领域技术人员可理解，通过过滤除去某些细胞组分并指这些细胞组分被完全除去，而是减少其存在的量，例如可减少至少50％、至少80％、至少90％、或至少95％的量，尽管减少100％可能是所期望的。
[0029]
本文提供的外泌体分离方法和工艺系统将死端过滤与切向流过滤方式组合使用，实现了外泌体的大规模分离。
[0030]
图1显示了本文提供的外泌体分离系统的示意性结构，其主要部件包括多个死端过滤器、一个切向流过滤器、若干个容器以及若干个蠕动泵、连接管和管夹等。
[0031]
如图1所示，第一死端过滤器1与第二死端过滤器2串联连接，在蠕动泵3作用下，让包括外泌体的原液如细胞培养上清液通过这两个过滤器依次过滤，以除去较大的细胞碎片和大细胞囊泡等组分。经过滤的原液通过中间产品容器5上的开口5a进入中间产品容器5中。中间产品容器5的出口5b与切向流过滤器4的入口4a连接，通过蠕动泵8将中间产品容器5中的液体泵入切向流过滤器4。切向流过滤器4可以为中空纤维柱 (purification column，pur)，其过滤孔径小于外泌体粒径，能够除去水和其他小分子杂质。切向流过滤器4的出口4b与中间产品容器5的另一入口5c连接，让相对于切向流过滤膜表面大体为平行方向流动的液体通过切向流过滤器4的出口4b返回到中间产品容器 5中，而透过切向流过滤膜孔流出的透过液则作为废液通过透过口4c流入废液容器6 中。返回中间产品容器5的液体在蠕动泵8的作用下再次进入切向流过滤器4，循环进行切向流过滤。由于切向流过滤的浓缩作用，中间产品容器5中的液体体积减少，外泌体浓度增加，达到期望的体积后停止进行切向流过滤。中间产品容器5设置有另一出口5d与产品容器7连接。产品容器7用于容纳制备的包括外泌体的液体，即外泌体产品。
[0032]
各容器、过滤器之间可通过连接管(如软管，例如硅胶管)连接。软管上可配备有软管夹(如罗伯特夹)以关闭或开放液体流动，软管与容器入口可通过鲁尔接头连接。
[0033]
将本文提供的外泌体分离系统用于外泌体制备时，首先通过第一死端过滤器1和第二死端过滤器2从原液(如包括外泌体的细胞培养上清液)中除去粒径大于外泌体粒径的杂质 (完整细胞、较大的细胞碎片、细胞器、颗粒性物质等)，接着通过切向流过滤器4的循
环过滤除去粒径小于外泌体粒径的杂质(例如小细胞膜碎片、蛋白质等)和部分水，让外泌体得到浓缩(例如浓缩30-50倍)，从而得到高浓度的外泌体产品。
[0034]
在一些实施方案中，第一死端过滤器1与第二死端过滤器2具有不同的过滤孔径，形成多级过滤，例如第一死端过滤器1的过滤孔径为1μm，用于除去较大的细胞碎片和大细胞囊泡；第二死端过滤器2的过滤孔径为0.22μm，用于除去200nm以上的微囊泡。视待处理原液的总量和杂质量，在一些实施方案中，可以仅使用一个死端过滤器；在另一些实施方案中，可以使用串联连接的三个或更多个死端过滤器。在一些实施方案中，这些死端过滤器中的至少一个为囊式过滤器(表面积例如为0.2-0.4m2)；在另一些实施方案中，这些死端过滤器均为囊式过滤器。出于排气或控制压力的考虑，第一死端过滤器1 和/或第一死端过滤器2可分别设置有可关闭的排气口，排气口可分别通过一次性滤膜10 和11与外界相通。
[0035]
在一些实施方案中，中间产品容器5的入口5c和出口5b位于该中间产品容器5的同一侧。更优选地，中间产品容器5的入口5c和出口5b位于该中间产品容器5的同一侧，并且设置在中间产品容器5的较低位置(即下部，例如靠近容器底面)。这样的设置使得中间产品容器5的入口5c和出口5b均保持于其中液体液面下方，以防止产生大量气泡。
[0036]
在一些实施方案中，在中间产品容器5的出口5b和切向流过滤器4的入口4a之间的连接管以及切向流过滤器4的出口4b和中间产品容器5的入口5c之间可设置有三通阀 12和13，以方便采用清洁剂或消毒剂(例如naoh)对中间产品容器5和切向流过滤器4进行清洁或杀菌处理。在一些实施方案中，在中间产品容器5的出口5b和切向流过滤器4 的入口4a之间的连接管上可设置压力传感器14，以监测切向流过滤器4内的压力状态。在一些实施方案中，在切向流过滤器4的出口4b和中间产品容器5的入口5c之间的连接管上设置有调压阀15，用于调节切向流过滤器4的进口压力。
[0037]
在一些实施方案中，切向流过滤器4包括中空纤维柱。在一个具体实例中，其截留分子量为100-750kd，表面积0.4-1m2，采用聚醚砜pes材质。在一个实施方案中，蠕动泵8转速450rpm，以对应流速1520ml/min将中间产品容器5内液体输入切向流过滤器 4，保持压力传感器显示的压力≈0.2bar。
[0038]
在一些实施方案中，中间产品容器5可为袋状容器，即中间产品袋。在制备外泌体产品时，中间产品袋倾斜放置，让出口5b和进口5c在中间产品袋的一侧，且较低位置使其保持在液面以下防止产生大量气泡。类似地，废液容器6和产品容器7也可为袋状容器。
[0039]
在一些实施方案中，在中间产品容器5的出口5d与产品容器7连接管上设置有另一死端过滤器9，用于在蠕动泵作用下进行除菌过滤。
[0040]
图2为本文提供的外泌体分离系统的一个具体实例。如图2所示，串联连接的第一死端过滤器1与第二死端过滤器2、切向流过滤器4、蠕动泵3和8等容纳在一个箱体16 内。该箱体16还设置有箱门17、箱体抽屉18和触摸屏19。在该具体实例中，中间产品容器5、废液容器6、和产品容器7均为袋状容器，其中中间产品容器5和产品容器7位于箱体抽屉18内，废液容器6位于箱体外侧。称重装置20可用于称取该废液容器的总重量，以判断中间产品容器5中外泌体的浓缩状况或浓度。触摸屏19可显示该工艺系统的运行状态，控制工艺参数，例如蠕动泵转速等。
[0041]
本文提供了用于外泌体大规模制备方法和分离系统(多级过滤体系)，以解决现有技术中外泌体制备存在的操作复杂、样本量小、重复性差、不能用于大规模制备外泌体的问
题。在一些实施方案中，采用微载体三维培养细胞，收获细胞上清，首先经过两级过滤，以去除细胞上清中的大颗粒杂质及蛋白，再经过合适孔径及材质的中空纤维膜循环浓缩外泌体，同时去除小分子蛋白杂质，最终获得外泌体溶液。总体上，本文提供的技术方案可以分为两部分：大规模制备外泌体和大规模分离外泌体。
[0042]
以下通过具体实施例来进一步说明本文提供的分离方法和分离系统。
[0043]
实施例1：
[0044]
目的：通过mscs三维培养获得大体积培养上清，以便后续大规模制备外泌体。
[0045]
简要操作步骤：将脐带间充质干细胞以1.5
×
108接种到7g 3d微载片中，接种当天d0使用无血清培养基补充到3l，接种第1天d1补充培养基到5l，三维培养5 天，每天进行细胞取样计数，最后收取培养基上清液4l放置于四度冰箱。通过细胞技术获得的细胞增殖情况如图3所示。随着培养天数增加，细胞增殖数量不断增加，培养第5 天细胞总数量达到1.98
×
109个。
[0046]
实施例2：
[0047]
目的：评估mscs三维培养随培养天数增加，连续收获外泌体，用于分析分泌的外泌体变化。
[0048]
简要操作步骤：
[0049]
a.微载体准备：使用平头镊子轻轻夹取20片微载片
tm
(20mg/片)投入到500ml透气内置叶轮培养瓶(以下简称培养瓶)中，取40ml完全培养基沿培养瓶侧臂加样口加入到培养瓶中，晃动培养瓶使微载片
tm
分散于培养基中，待用；
[0050]
b.细胞准备：每20片微载片
tm
准备10ml细胞悬液，密度为1.2
×
108个细胞/ml，待用；
[0051]
c.细胞接种：将上述细胞悬液混匀，并将细胞悬液(共10ml)沿培养瓶侧臂加样口加入到培养中，补加150ml完全培养基，终体积为200ml，拧紧瓶盖；
[0052]
d.细胞培养：将培养瓶转移到事先安装好的3d flotrix
tm
minispin生物反应器搅拌台的瓶位中心，通过触屏控制器将搅拌速度设置为35rpm进行培养；
[0053]
e.接种后24h(day1)补加100ml完全培养基，终体积300ml，转速调为40rpm；
[0054]
f.分别在day4、6、8用蠕动泵泵出250ml细胞上清，-80℃保存，同时补加250ml新鲜完全培养基；
[0055]
g.day10收集全部细胞上清，-80℃保存。
[0056]
h.外泌体分离前，以上day4、6、8、10收获的细胞上清置于4℃复溶，再用超速离心法提取外泌体，简要步骤如下：取适量细胞培养上清，300g、4℃离心10min，弃沉淀；上清2000g、4℃离心10min，再次弃沉淀；然后将上清10000g、4℃离心30min后，转移到超速离心管中；将上清100000g、4℃离心90min后，弃上清；加入1ml pbs重悬沉淀，制成外泌体预混液；将外泌体预混液转移至离心管中，100000g、4℃再次超速离心90 min，弃上清，加适量pbs重悬，即为外泌体提取液(注：全部过程在4℃条件下进行)。
[0057]
实施例3：
[0058]
脐带间充质干细胞三维培养4d后，收集细胞上清(根据实施例1制备)，用于本实施例以及下文实施例分离纯化外泌体。
[0059]
目的：采用本文提供的外泌体分离系统，评估在外泌体分离中，科百特深层纸板的
效果
[0060]
简要操作步骤：
[0061]
a.三维细胞上清500ml先经过0.04-9.0μm深层纸板(科百特，cdfcdcsd0140pcp) 过滤，流速25ml/min；
[0062]
b.将步骤a中过滤后的细胞上清经过0.04-0.4μm(科百特，cdfcdcsd0102pcp)深层纸板进一步过滤，流速25ml/min；
[0063]
c.再将步骤b中过滤后的细胞上清经过切向流过滤(tangential flow filtration，tff) 浓缩至20-30ml，流速为100ml/min，剪切力为3psi，处理时间约为3.5h。其中中空纤维膜材质为聚醚砜(pes)，表面积为75cm2，纤维内径为1mm，截留分子量为500kd，所得溶液即为外泌体提取液。
[0064]
实施例4：
[0065]
目的：采用本文提供的外泌体分离系统，评估在外泌体分离中，科百特囊式过滤器的效果。
[0066]
简要操作步骤：
[0067]
a.三维细胞上清500ml先经过1μm pes囊式过滤器(表面积为180cm2，科百特， c01bbpafpa1p)过滤，流速25ml/min；
[0068]
b.将步骤a中过滤后的细胞上清经过0.22μm pes囊式过滤器(表面积为180cm2,科百特，c01bbslena1p)进一步过滤，流速25ml/min；
[0069]
c.再将步骤b中过滤后的细胞上清经过tff浓缩至20-30ml，流速为100ml/min，剪切力为3psi，处理时间约为3.5h。其中中空纤维膜(repligen，d02-e500-10-n)材质为pes，表面积为75cm2，纤维内径为1mm，截留分子量为500kd，所得溶液即为外泌体提取液。
[0070]
实施例5：
[0071]
目的：采用本文提供的外泌体分离系统，评估在外泌体分离中，上海冠欧囊式过滤器的效果。
[0072]
简要操作步骤：
[0073]
a.三维细胞上清3.75l先经过1μm pes囊式过滤器(表面积为2000cm2,上海冠欧净化科技有限公司，ksl-2h2h-5-s1)过滤，流速200ml/min；
[0074]
b.将步骤a中过滤后的细胞上清经过0.22μm pes囊式过滤器(表面积为2000cm2,上海冠欧净化科技有限公司，ksl-2h2h-5-s2y)进一步过滤，流速200ml/min；
[0075]
c.再将步骤b中过滤后的细胞上清经过tff浓缩至130ml，流速为650ml/min，剪切力为3psi，处理时间约为2h。其中中空纤维膜(repligen，s04-e300-10-n)材质为 pes，表面积为0.1m2，纤维内径为1mm，截留分子量为300kd，所得溶液即为外泌体提取液。
[0076]
实施例6：
[0077]
目的：采用本文提供的外泌体分离系统，评估在外泌体分离中，山东博纳生物中空纤维膜的效果
[0078]
简要操作步骤：
[0079]
a.三维细胞上清3.75l先经过1μm pes囊式过滤器(表面积为2000cm2,上海冠欧净化科技有限公司，ksl-2h2h-5-s1)过滤，流速200ml/min；
[0080]
b.将步骤a中过滤后的细胞上清经过0.22μm pes囊式过滤器(表面积为2000cm2,
上海冠欧净化科技有限公司，ksl-2h2h-5-s2y)进一步过滤，流速200ml/min；
[0081]
c.再将步骤b中过滤后的细胞上清经过tff浓缩至130ml，剪切力为3psi，处理时间约为0.5h。其中中空纤维膜(山东博纳生物科技集团有限公司，us-300-500k)材质为 pes，表面积为0.4m2，纤维内径为1mm，截留分子量为500kd，所得溶液即为外泌体提取液。
[0082]
实施例7(对比例)：
[0083]
目的：通过传统超速离心法分离外泌体，以与本文提供的分离方法所获得的外泌体比较。
[0084]
简要操作步骤：取40ml mscs三维培养上清，采用超速离心法提取外泌体(超离方法参见实施例2)
[0085]
实施例8：
[0086]
对上文实施例中不同方法提取的外泌体进行鉴定，结果如下。
[0087]
8.1外泌体电镜图
[0088]
采用负染色法观察外泌体。简要方法如下：剪封口膜铺在通风橱实验台上，分别取一滴样品、纯水、2％醋酸双氧铀滴在封口膜上，然后将铜片覆盖在样品上2min，铜片在滤纸上吸干，在纯水上洗一下，滤纸吸干，放在铀滴上2min，用滤纸吸干铀，待铜网干燥后，将其放在样品盒里，80kv下拍摄电镜照片。所用透射电镜型号：h-7650 (hitachi)。
[0089]
图4a-4f分别为实施例2-7(其中实施例2外泌体为day4外泌体)制备的外泌体电镜图。各实施例分离的外泌体在电镜下均可观察到外泌体的经典结构。
[0090]
8.2外泌体粒径分布及浓度分析
[0091]
将实施例3、4、5、6分离得到的外泌体稀释50倍，实施例2和实施例7(对比例)分离得到的外泌体稀释400倍，使其颗粒浓度在1
×
10
8-5
×
109颗粒/ml范围内，采用纳米颗粒跟踪分析仪(nanosight lm10，malvern panalytical)进行检测。结果显示在图5a-5f 中。
[0092]
图5a为实施例2培养msc4、6、8、10天后细胞上清分离的外泌体粒径分布示意图，其中500ml上清分离获得的粒子总数分别为4.13
×
10
12
，3.4
×
10
12
，2.0
×
10
12
，2.16
×
10
12
，平均粒径分别为170.5，208.3，186.0，177.8nm。
[0093]
图5b为实施例3分离的外泌体粒径分布示意图，粒子总数为4.37
×
10
11
，平均粒径为 181nm。
[0094]
图5c为实施例4分离的外泌体粒径分布示意图，粒子总数为1.32
×
10
12
，平均粒径为 132.2nm。
[0095]
图5d为实施例5分离的外泌体粒径分布示意图，其中500ml上清分离获得的粒子总数为1.28
×
10
12
，平均粒径为113.5nm。
[0096]
图5e为实施例6分离的外泌体粒径分布示意图，其中500ml上清分离获得的粒子总数为9.36
×
10
11
，平均粒径为123.8nm。
[0097]
图5f为实施例7分离的外泌体粒径分布示意图，其中500ml上清(经换算)分离获得的粒子总数1.37
×
10
12
，平均粒径为197.5nm。
[0098]
比较实施例2中mscs各培养天数中外泌体颗粒数及粒径(图5a)，发现day4上清中外泌体颗粒数较多，平均粒径较小，故mscs培养4天，收集上清，提取外泌体较优。
[0099]
实施例3(图5b)与实施例4(图5c)比较，实施例4获得的外泌体颗粒数较多，平均粒径更小，实施例4较优。
[0100]
实施例4(图5c)与实施例5(图5d)比较，外泌体颗粒数与平均粒径相差不大。
[0101]
实施例4(图5c)与实施例6(图5e)比较，实施例4获得的外泌体颗粒数稍多，粒径相差不大。
[0102]
实施例4(图5c)与实施例7(图5f)比较，实施例4中外泌体平均粒径较小，较优。
[0103]
8.3外泌体western blot检测
[0104]
取适量实施例4分离得到的外泌体溶液，加入上样缓冲液(loading buffer)，沸水浴加热5min使蛋白充分变性。将蛋白样品加到sds-page分离胶的加样孔中，80v电泳分离蛋白样品并进行转膜。转膜完毕后，将膜按蛋白面朝上浸泡于封闭液中封闭1h，然后一抗4℃孵育过夜，再用酶标二抗室温孵育1h，最后将蛋白膜放置在ecl发光液中，避光反应5min，放入化学发光成像系统中进行显色成像(如图6所示)。
[0105]
通过以上实施例描述可知，囊式过滤-tff法为外泌体分离纯化方法的更优选方式，获得的外泌体结构清楚，粒径较小，浓度较高。另外，本实用新型的外泌体分离系统中所使用的过滤器及中空纤维膜可以等比放大，用于更大体积细胞上清中外泌体的分离纯化。