蛋白质治疗剂的制作方法

蛋白质治疗剂
1.相关申请的交叉引用
2.本专利申请根据35 u.s.c.
§
120要求2020年5月21日提交的美国申请号16/880,804的权益。本专利申请还根据35 u.s.c.
§
119(e)要求如下美国临时申请号的权益：2020年3月11日提交的62/988,328、2020年3月18日提交的62/991,504、2020年4月27日提交的63/016,048、2020年4月27日提交的63/016,241、2020年5月8日提交的63/022,146、2020年6月9日提交的63/036,445、2020年9月21日提交的63/080,887、2020年9月23日提交的63/082,145、以及2020年12月3日提交的63/121,102。u.s.16/880,804、u.s.62/988,328、u.s.62/991,504、u.s.63/016,048、u.s.63/016,241、u.s.63/022,146、u.s.63/036,445、u.s.63/080,887、u.s.63/082,145、和u.s.63/121,102的全部内容通过引用特此并入。
3.关于序列表的声明
4.本披露含有对氨基酸序列和核酸序列的引用，这些氨基酸序列和核酸序列已作为序列表文本文件与本披露一并同时提交，该文本文件标题为“62803442_1.txt”，文件大小为788千字节(kb)，创建于2021年3月10日。前述序列表根据37 c.f.r.
§
1.52(e)(5)通过引用以其全文特此并入。
技术领域
5.本披露涉及可以施用于受试者以预防和治疗covid-19和其他此类病毒诱发的疾病的蛋白质。


背景技术：

6.血管紧张素转换酶2(ace2)是肾素-血管紧张素激素系统的调节性羧肽酶，且可作为心血管稳态的调节剂。ace2在许多组织中表达，包括肺泡上皮细胞、小肠肠细胞、睾丸间质细胞和支持细胞、肾近端小管和睾丸。ace2还是人类冠状病毒的受体，这些冠状病毒例如严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。ace2在各种人体组织中的广泛表达使人类冠状病毒有效地大规模感染成为可能。
7.目前，没有已知的有效治疗方案可以减少抑或甚至完全避免冠状病毒感染及其后遗症的致病作用。虽然已经提出了几种药物(例如，瑞德西韦(remdesivir)、羟氯喹、阿奇霉素(azithromycin)、免疫抑制类固醇等)用于治疗covid-19，但疗效目前尚不清楚。此外，大多数已知提出的药物不会直接影响病毒或阻止其进入宿主细胞，而是通常会减少对病毒的过度刺激的免疫反应。同样，没有已知的有效疫苗组合物可以帮助治疗或避免冠状病毒疾病。
8.batlle等人(2020)clin.sci.[临床科学]134:543-45假设可溶性血管紧张素转换酶2(ace2)细胞外结构域(其与丙种球蛋白(igg1)可结晶片段(fc)结构域缀合)可作为抗covid-19感染的治疗剂。
[0009]
batlle和wysocki在国际专利申请公开号wo 18/140456中描述了嵌合ace2-fc构建体。
[0010]
esvelt(2020,“designing virus-specific sace2 mimics for competitive inhibition of sars-cov-2[设计病毒特异性sace2模拟物以竞争性抑制sars-cov-2]”，可在www.covid19-hpc-consortium.org/projects/5e90e0ca836090007f1ddb39获得)假设可以突变ace2构建体以实现各种变种，这些变种对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)刺突蛋白的受体结合结构域(刺突-rbd)具有更高的结合亲和力。假设而言，这样的突变体将在刺突-rbd的竞争中胜过天然ace2，从而阻断刺突-rbd结合人类细胞上的ace2的能力。
[0011]
jiang等人(2020)trends immunol.[免疫学趋势]41(5):355-359报告了针对sars-cov-2的中和单克隆抗体(mab)。


技术实现要素：

[0012]
本文披露了可用于治疗和预防covid-19感染的各种蛋白质治疗剂。在某些实施例中，披露了ace2诱饵肽和ace2诱饵肽片段——任选地与fc结构域缀合，它们与人类野生型ace2相比对sars cov-2刺突rbd具有更高的亲和力。这些ace2诱饵肽及其片段可用于预防或抑制病毒进入非活动性感染sars cov-2的个体。这些诱饵肽还可以用于已经感染sars-cov-2的个体，以防止病毒从受感染的细胞传播到未受感染的细胞，从而减缓和控制疾病。本文还披露了适合用于诱导受试者自身细胞产生这些治疗有效的ace2诱饵肽、片段和/或嵌合体的核苷酸和核苷酸载体(包括病毒载体)。
[0013]
另外地或可替代地，本文还披露了特异性结合sars cov-2刺突的各种mab，以及这些mab的fab和scfv片段。这些mab和片段可用于防止病毒进入非活动性感染sars cov-2的个体。这些诱饵肽还可以用于已经感染sars-cov-2的个体，以防止病毒从受感染的细胞传播到未受感染的细胞，从而减缓和控制疾病。本文还披露了适合用于诱导受试者自身细胞产生这些治疗有效的mab和/或片段的核苷酸和核苷酸载体(包括病毒载体)。
[0014]
各个目标、特征、方面和优点将根据以下关于优选实施例的详细描述以及附图而变得更清楚。
附图说明
[0015]
图1描绘了sars-cov-2刺突蛋白三聚体的晶体结构。指示了该三聚体的s1和s2结构域。虚线标示了图2中放大的三聚体部分。
[0016]
图2描绘了刺突三聚体的s1结构域的受体结合结构域(rbd)的晶体结构。
[0017]
图3描绘了用n-612-004mab获得的spr结果。3a的图示出了针对切割的刺突肽的亲和力结果，而3b示出了针对rbd-s1肽的结果。
[0018]
图4描绘了用n-612-017mab获得的spr结果。4a的图示出了针对切割的刺突肽的亲和力结果，而4b示出了针对rbd-s1肽的结果。
[0019]
图5描绘了说明所选mab阻断sars-cov-2刺突至ace2的能力的生物膜层干涉测定法。标有“缓冲液”的线示出了ace2与rbd无阻碍地结合。n-612-002和n-612-004的线在整个时间序列中基本重叠。n-612-017线距离水平线最近。
[0020]
图6描绘了通过spr进行的n-612-004对rbd肽的kd测定。
[0021]
图7描绘了通过spr进行的n-612-017对rbd肽的kd测定。
[0022]
图8描绘了通过spr进行的n-612-002对sars-cov-2刺突蛋白构建体sc-s-pp-t4f的kd测定。
[0023]
图9描绘了通过spr进行的n-612-004对sars-cov-2刺突蛋白构建体sc-s-pp-t4f的kd测定。
[0024]
图10描绘了通过spr进行的n-612-007对sars-cov-2刺突蛋白构建体sc-s-pp-t4f的kd测定。
[0025]
图11描绘了通过spr进行的n-612-014对sars-cov-2刺突蛋白构建体sc-s-pp-t4f的kd测定。
[0026]
图12描绘了通过spr进行的n-612-017对sars-cov-2刺突蛋白构建体sc-s-pp-t4f的kd测定。
[0027]
图13描绘了通过spr进行的n-612-017scfv对rbd肽的kd测定。
[0028]
图14描绘了通过spr进行的n-612-056scfv对rbd肽的kd测定。
[0029]
图15描绘了通过spr进行的n-612-017scfv对sars-cov-2刺突三聚体的kd测定。
[0030]
图16描绘了通过spr进行的n-612-056scfv对sars-cov-2刺突三聚体的kd测定。
[0031]
图17描绘了ace2-igg1fc的构象结构和晶体结构。
[0032]
图18展示了ace2-igg1fc突变型诱饵肽的纯化。图18a描绘了hplc纯化。图18b示出了回收的ace2 igg1fc突变型诱饵肽在还原和非还原条件下的纯度。
[0033]
图19描绘了野生型ace2诱饵对rbd-sd1的结合亲和力。
[0034]
图20描绘了t27y/h34a突变型ace2诱饵对rbd-sd1的结合亲和力。
[0035]
图21描绘了通过spr进行的与igg1fc融合的ace2野生型和ace2突变型诱饵肽的kd测定。
[0036]
图22展示了活sars-cov-2中和数据。
[0037]
图23描绘了野生型和突变型ace2诱饵肽的稳定性。
[0038]
图24通过尺寸排阻色谱法描绘了t27y/h34a/r273q三突变型ace2诱饵肽的尺寸。
[0039]
图25通过尺寸排阻色谱法描绘了t27y/h34a/r273k三突变型ace2诱饵肽的尺寸。
[0040]
图26通过尺寸排阻色谱法描绘了t27y/h34a/r273l三突变型ace2诱饵肽的尺寸。
[0041]
图27通过尺寸排阻色谱法描绘了t27y/h34a/h345a三突变型ace2诱饵肽的尺寸。
[0042]
图28通过尺寸排阻色谱法描绘了t27y/h34a/h505l三突变型ace2诱饵肽的尺寸。
[0043]
图29通过尺寸排阻色谱法描绘了t27y/h34a/h374n三突变型ace2诱饵肽的尺寸。
[0044]
图30通过尺寸排阻色谱法描绘了t27y/h34a/h378n三突变型ace2诱饵肽的尺寸。
[0045]
图31描绘了三突变型ace2诱饵肽的ace2活性。
[0046]
图32描绘了单突变型、双突变型、和三突变型ace2诱饵肽的稳定性。
[0047]
图33描绘了双突变型和三突变型ace2诱饵肽的稳定性。
[0048]
图34描绘了各种三突变型ace2诱饵肽的稳定性。
[0049]
图35描绘了抗生物素蛋白标记的和未经标记的野生型ace2-iggfc的稳定性。
[0050]
图36描绘了通过spr进行的n-612-017和n-612-056对sars-cov-2刺突蛋白及其变体的kd测定。
[0051]
图37描绘了通过spr进行的n-612-004、n-612-017、n-612-017、和n-612-056对sars-cov-2刺突蛋白及其变体的kd测定。
[0052]
图38描绘了通过spr进行的野生型ace2和t27y/h34a/h374nace2诱饵肽对sars-cov-2刺突蛋白及其变体的kd测定。
具体实施方式
[0053]
i.定义
[0054]
以下定义是指上文和整个披露中使用的各种术语。
[0055]“伴随(concomitant或concomitantly)”包括在另外的药剂(例如，ace2突变体)的存在下施用药剂(例如，il-15激动剂)。治疗性治疗方法中的伴随施用包括共同施用第一、第二、第三或另外的药剂的方法。伴随施用还包括其中第一或另外的药剂在第二或另外的药剂存在下施用的方法，其中第二或另外的药剂例如可以预先施用。伴随的治疗性治疗方法可以由不同的参与者逐步执行。例如，一个参与者可以向受试者施用第一药剂(例如，ace2突变体)，而第二参与者可以向受试者施用第二药剂(例如，il-15激动剂)，并且施用步骤可以在同一时间或几乎同一时间执行。参与者和受试者可以是同一实体(例如，人)。因此，该术语包括同时施用和基本上同时施用，即大约同一时间施用。
[0056]
如本文所用，ace2突变体中的突变位置是相对于seq id no:135中的对应位置指定的。
[0057]“编码”——当用于描述多核苷酸时——表示当从野生型人类细胞中的多核苷酸开始转录时，产生的转录物将被翻译成给定的蛋白质。也就是说，当野生型人trna的密码子三联体根据野生型人细胞中的转录和翻译的正常工作原理从多核苷酸产生多肽时，该多核苷酸“编码”该多肽。
[0058]“有效量”或“治疗有效量”是指带来所需结果所必需的一种或多种药剂的量和/或剂量和/或剂量方案，例如，足以预防受试者感染的量、足以减少受试者感染发生的量、和/或足以治疗受试者感染的量。
[0059]“il-15激动剂”是指结合并激活il-15受体(“il-15rα”)的化合物或分子。il-15激动剂的化合物或分子的类型没有特别限制，只要它结合并激活il-15rα即可。il-15激动剂可以是肽、蛋白质、小分子(例如，药物)或寡核苷酸。肽或蛋白质可以是单个氨基酸序列或经由共价附接(例如，二硫键)或非共价附接(例如，亲水或疏水相互作用、氢键)结合的两个或更多个序列。在特定实施例中，il-15激动剂是抗体、经修饰抗体、嵌合抗体或其衍生物。在进一步的实施例中，il-15激动剂是超级激动剂复合物，例如与il-15rα/igg1 fc融合蛋白结合的il-15衍生物，也称为nogapendekin alfa-imbakicept(nai)。nai在文献中也称为n-803、alt-803、或il-15
n72d
:il-15rαsu/igg1。描述nai的us 9,328,159通过引用以其全文并入本文。涉及n-803的临床试验描述于nct04385849中，该文献通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，il-15激动剂单独施用，和/或作为唯一治疗剂用于治疗如本文所述的疾病、障碍、病症或感染。在另一个实施例中，il-15激动剂与另一种化合物或分子组合施用，例如与以下组合施用：与刺突蛋白或其经修饰的变体结合的抗体或fab片段；ace诱饵肽或其变体；和/或调节ace或ace2信号传导的药剂(例如，ace抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂)。
[0060]
il-15激动剂与il-15rα的结合诱导下游元件的信号以激活il-15信号传导通路并激活细胞。表达il-15rα的细胞包括但不限于t细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细
胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞和神经细胞。guo等人cytokine growth factor rev.[细胞因子与生长因子综述],2017。il-15激动剂与il-15rα的结合通过il-15rα传播信号(例如，经由构象变化)，该信号启动il-15信号传导通路以激活免疫反应，例如抗病毒反应。
[0061]“受试者”、“个体”和“患者”可互换地指哺乳动物，优选地人或非人灵长类动物，但也指驯养哺乳动物(例如，犬科动物或猫科动物)、实验室哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠)和农业哺乳动物(例如，马、牛、猪、绵羊)。在某些实施例中，受试者可以是在医师或其他卫生工作者护理之下的人(例如，成年男性、成年女性、青春期男性、青春期女性、男孩、女孩)。在某些实施例中，受试者可能不在医师或其他卫生工作者的护理之下。
[0062]“sars-cov-2”是指严重急性呼吸综合征冠状病毒2。它是一种高度传染性的正义单链rna病毒，可导致称为covid-19的呼吸系统疾病。野生型病毒的序列可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_045512.2(refseq nc_045512.2)找到。如本文所用，sars-cov-2还包括典型病毒的突变和变体，包括但不限于可在全球人群中诱发covid-19症状的sars-cov-2突变体和变体。在一些实施例中，sars-cov-2突变体和变体在至少10％的全球人群中诱发任何两种或更多种covid-19症状。
[0063]
covid-19是由受试者感染sars-cov-2(包括野生型病毒及其突变体和变体)引起的人类呼吸系统疾病。covid-19的症状包括但不限于头痛、精神错乱、嗅觉和味觉丧失、鼻塞和流涕、咳嗽、肌肉酸痛和/或疼痛、喉咙痛、发烧、发冷、腹泻、呼吸不畅、肺炎、呕吐、呼吸困难、缺氧、呼吸系统衰竭、休克、多器官功能障碍及其组合。在一些受试者中，症状会成群出现，例如，咳嗽、痰、气短和发烧；或肌肉疼痛、关节疼痛、头痛和疲劳。
[0064]“调节ace和ace2信号传导中的至少一种的药剂”是指调节(例如增加或减少)血管紧张素转换酶(ace)或特别是ace2的表达和/或活性的化合物或分子。在一些实施例中，调节ace或ace2信号传导中的至少一种的药剂可以是ace抑制剂或增加ace2表达的化合物。在一些实施例中，化合物可以是ace抑制剂，其选自但不限于由以下组成的组：苯那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、依那普利(enalapril)、培哚普利(perindopril)、莫昔普利(moexipril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)和群多普利(trandolapril)。在一些实施例中，化合物是选自但不限于坎地沙坦(candesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、缬沙坦(valsartan)和氯沙坦(losartan)的血管紧张素受体拮抗剂。另外地或可替代地，另外的药剂可以是bdkrb1/2、agtr1、mas1或肾素的抑制剂。
[0065]“治疗(treat和treatment)”各自指通过向需要治疗的受试者施用治疗剂来减轻、抑制或以其他方式改善感染的方法。在一些实施例中，需要治疗的受试者可以包括患有、诊断为患有或疑似患有感染的受试者。在特定实施例中，治疗(treat或treatment)包括向患有、诊断为患有或疑似患有covid-19的受试者施用治疗剂。另外地或可替代地，受试者可能感染了sars-cov-2、诊断为感染了sars-cov-2、或疑似感染了sars-cov-2。在一些实施例中，受试者可以是无症状的。治疗包括单独地施用任选地与fc结构域融合的ace2诱饵肽或其变体、与刺突蛋白结合的fab片段或抗体、il-15激动剂或调节ace和ace2信号传导中的至少一种的药剂中的任一种，或它们的任何组合。
[0066]
ii.ace2诱饵肽及其变体
[0067]
sars cov-2的天然细胞表面受体是ace2的细胞外结构域。通过使ace2的与sars-cov-2刺突-rbd相互作用的部分发生突变，可以制造与rbd结合的ace2诱饵肽(或其肽片段)，其中结合亲和力高于野生型ace2细胞外结构域的亲和力。可以改变ace2诱饵肽的修饰形式，以保留已知与sars-cov刺突糖蛋白相互作用的至少三个结构域。同样，ace2部分优选地包括前导肽以允许从产生ace2-fc构建体的重组细胞分泌(本文讨论的)。因此，在c末端存在截短的情况下，截短可以去除adam17切割所需的序列基序和/或tmprss11d和/或tmprss2切割所需的序列基序。这些高亲和力的ace2-fc构建体可以有效地将病毒“螯合”远离受试者细胞表面的野生型ace2。
[0068]
ace2蛋白长度为805个氨基酸，但在某些优选的实施例中，ace2诱饵将不包括整个805个氨基酸的ace2序列，而是由截短组成，例如ace2诱饵肽可以缺少跨膜结构域。在某些实施例中，治疗性蛋白质将含有不超过700个氨基酸，例如不超过600个氨基酸、不超过500个氨基酸、不超过400个氨基酸、不超过300个氨基酸、不超过200个氨基酸、不超过100个氨基酸、或甚至50个或更少的氨基酸。例如，某些优选的实施例将由氨基酸残基1-740、或1-615、或10-400、或20-100、或21-614、或20-50、或320-360组成。野生型ace2如seq id no:135所示。
[0069]
提高ace2对刺突-rbd的结合亲和力的合适突变包括在ace2位置24处的谷氨酰胺突变(seq id no:136)、位置27处的苏氨酸突变(seq id no:137)、位置30处的天冬氨酸突变(seq id no:138)、位置34处的组氨酸突变(seq id no:139)、位置35处的谷氨酸突变(seq id no:140)、位置38处的天冬氨酸突变(seq id no:141)、位置41处的酪氨酸突变(seq id no:142)、位置273处的精氨酸突变(seq id no:201)、位置345处的组氨酸突变(seq id no:202)、位置355处的天冬氨酸突变(seq id no:143)、位置374处的组氨酸突变(seq id no:203)、位置378处的组氨酸突变(seq id no:204)、位置505处的组氨酸突变(seq id no:205)。这些单个点突变的各种组合(例如，位置24&位置27、24&30、24&34、24&35、24&38、24&41、24&355、27&30、27&34、37&35、27&38、27&41、27&355、30&34、30&35、30&38、30&41、30&355、34&35、34&38、34&41、34&355、35&38、35&41、35&355、38&41、38&355、41&355、24&27&30、24&27&34、24&27&35、24&27&38、24&27&41、24&27&355、24&30&34、24&30&35、24&30&38、24&30&41、24&30&355、24&34&35、24&34&38、24&34&41、24&34&355、24&35&38、24&35&41、24&35&355、24&38&41、24&38&355、24&41&355、27&30&34、27&30&35、27&30&38、27&30&41、27&30&355、27&34&35、27&34&38、27&34&41、27&34&273、27&34&345、27&34&355、27&34&374、27&34&505、27&35&38、27&35&41、27&35&355、27&38&41、27&38&355、27&41&355、30&34&35、30&34&38、30&34&41、30&34&355、30&35&38、30&35&41、30&35&355、30&38&41、30&38&355、30&41&355、34&35&38、34&35&41、34&35&355、34&38&41、34&38&355、34&41&355、35&38&41、35&38&355、35&41&355、38&41&355、24&27&30&35、24&27&30&38、24&27&30&41、24&27&30&355、24&30&35&38、24&30&35&41、24&30&35&355、24&35&38&41、24&35&38&355、24&38&41&355、27&30&35&38、27&30&35&41、27&30&35&355、27&35&38&41、27&35&38&355、27&38&41&355、30&35&38&41、30&35&38&355、30&38&41&355、35&38&41&355、24&27&30&35&38、24&27&30&35&41、24&27&30&35&355、27&30&34&35&41、27&30&34&35&355、30&34&35&38&41、30&34&35&38&355、30&34&38&41&355、30&35&38&41&355、34&35&38&41&355、24&27&30&34&35&41、24&27&30&34&35&355、24&27&34&35&41&355、24&27&30&34&41&355、24&27&30&34&35&
355、24&30&34&35&38&41、24&30&34&35&38&355、27&30&34&35&38&41、27&30&34&35&38&355、27&30&34&35&41&355、30&34&35&38&41&355、24&27&30&34&35&38&41、24&27&30&35&38&355、24&27&30&34&35&41&355、24&27&30&34&38&41&355、24&27&30&35&38&41&355、24&27&34&35&38&41&355、24&30&34&35&38&41&355、27&30&34&35&38&41&355、和24&27&30&34&35&38&41&355)也可用于提高对rbd的亲和力，并且所有此类突变展示于seq id no:144中。
[0070]
seq id no:136-144、147-159、和201-212仅作为合适的ace2诱饵肽的实例提供，但这些序列的许多变型也可用于抗covid19治疗目的。例如，与seq id no:136-144、147-159、和201-212中任一者具有至少70％序列同一性(即，至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、或至少99％序列同一性)的多肽也可用于治疗目的，条件是该分子广泛地保留单个seq id no:136-144、147-159、和201-212分子的整体结合位点结构和取向。seq id no:136-144披露了在蛋白质内具有潜在单一突变的ace2诱饵肽突变体。seq id no:147-159和201-205披露了在蛋白质内具有特定单一突变的ace2诱饵肽突变体。seq id no:206-212描述了具有三个点突变的ace2诱饵肽突变体(例如，三突变体)。
[0071]
在一个实施例中，考虑了具有突变t27y和h34a的ace2诱饵肽的双突变体。sars-cov-1和sars-cov-2感染的重要机制始于病毒刺突蛋白与人类受体蛋白ace2的结合。双突变的ace2诱饵肽、或结合结构域的肽，可以以非常高的结合亲和力与病毒刺突蛋白结合，从而超过、减少、抑或甚至完全避免病毒对接。在一个实施例中，ace2诱饵肽的α-螺旋具有突变t27y和h34a。这种突变的ace2诱饵肽可以通过将t27y和h34a突变引入ace2的α-螺旋中来产生，其中当rbd和ace2形成结合复合物时，α-螺旋靠近rbd。证明与ace2的野生型α-螺旋相比，突变的α-螺旋对rbd具有更高的结合亲和力。这种双突变的ace2诱饵肽可用于治疗或预防covid-19。
[0072]
另外地或可替代地，ace2诱饵肽部分可以与fc结构域融合，以产生治疗性蛋白质嵌合体(又称为杂合多肽、杂合构建体、融合多肽和/或融合构建体)。虽然可以使用任何fc结构域(例如，来自iga、igd、ige、igg、igm等的fc结构域)，但在优选的实施例中，嵌合体将包含来自iga或igg的fc结构域。在另外的实施例中，iggfc选自由igg1fc、igg2fc、igg3fc、和igg4fc组成的组。例如，fc结构域可以与seq id no:145或146具有至少70％同一性(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％同一性)。在一些实施例中，包含多个突变例如三个突变，例如t27y和h34a以及另外的突变(例如，r273k、r273l、r273q、h345a、h374n、h378n、和h505l)的ace2诱饵肽突变体可以转移到iga支架上。在优选的实施例中，三突变是t27y、h34a、和h374n突变。将ace2部分与igfc结构域融合可以通过将编码ace2突变体和igfc支架(例如igafc支架)的核苷酸序列掺入载体(例如腺病毒载体)中来实现。然后在适合施用(例如通过皮下、肌肉内或口服递送)的药物组合物中配制该载体。可替代地，ace2诱饵肽和fc可以经由柔性肽接头偶联。通常，此类接头可具有5至25个氨基酸，并且所有已知的柔性接头都被认为适用于本文。特别合适的接头包括散布有丝氨酸的一系列甘氨酸(例如，gggs)。另外地或可替代地，ace2-fc杂合构建体可以固定在运载体上。允许固定的所有修饰方式都是合适的，例如生物素化、纤维素结合结构域等。可检测的标记也可以添加到ace2-fc杂合构建体中，以实现在
定量测定中的原位检测和/或定量。合适的标记包括发光标记、放射性同位素标记、酶标记等。
[0073]
iii.抗原结合片段和抗体
[0074]
与sars-cov-2刺突蛋白结合的抗原结合片段(fab片段)和抗体——特别是与刺突rbd结合的抗体——可以干扰sars-cov-2进入宿主细胞。本文披露的抗体和fab片段可以结合sars-cov-2刺突，包括可以结合刺突rbd的几种。
[0075]
为了说明本文披露的抗刺突抗体和fab片段，描述了具有结构为a—v
h cdr1—b—v
h cdr2—c—v
h cdr3—d的重链可变区(vh)的示例性fab片段。这些示例性抗刺突fab片段还具有结构为seq id no:131—v
l cdr3—e的轻链可变区(v
l
)。各种此类fab片段的vh和v
l
的氨基酸序列列于下表1。这些fab片段中的某些片段的结合亲和力已通过表面等离子体共振(spr)得到证实。
[0076]
[0077][0078]
某些抗刺突fab片段与刺突rbd特异性结合。各种此类fab片段的vh和v
l
的氨基酸序列列于下表2。这些fab片段中的某些片段对刺突蛋白三聚体和/或rbd肽的结合亲和力已通过表面等离子体共振(spr)得到证实。
[0079][0080]
尽管表1和2中列出了特定的实施例，但技术人员理解，抗体或fab片段的亲和力由互补决定区(cdr)决定，并且可以对可变结构域的非cdr部分进行大量改变和调整，而不会实质性地改变这些抗体或fab片段在中和sars-cov-2感染性中的有用性。因此，许多超出上述例示的那些的序列同样可用于治疗covid-19疾病。特别合适的序列将保留与seq id no:127的至少70％同一性(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)、与seq id no:128的至少70％同一性(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)、与seq id no:129的至少70％同一性(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)、与seq id no:130的至少70％同一性(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)、以及与seq id no:132的至少70％同一性(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)。类似地，特别合适的序列将保留与seq id no:131的至少70％同一性(例如，至少75％、至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)，但此类序列将保留与seq id no:131序列内的轻链cdr1和cdr2的100％同一性。
[0081]
在一些实施例中，与刺突蛋白(例如刺突rbd)结合的fab片段和抗体可以另外地或可替代地与经修饰的和/或突变的刺突蛋白结合。可以在sars-cov-2变体上发现经修饰的和/或突变的刺突蛋白。可以通过含有点突变、插入、缺失和/或倒位，使经修饰的刺突蛋白不同于野生型或天然存在的刺突蛋白。在实施例中，一个或多个点突变选自由以下组成的组：s13i、l18f、t20n、p26s、d80a、d138y、w152c、r190s、d215g、l242h、k417n、k417t、e484k、l452r、n501y、a570d、d614g、h655y、p681h、t716i、s982a、d1118h、t1027i及其组合。特定的多重突变包括但不限于下表3中列出的那些：
[0082][0083][0084]
iv.多核苷酸和载体
[0085]
当代分子生物学家知道如何制造表达本文所述蛋白质的核苷酸，以及如何在细胞中表达此类核苷酸以获得相关蛋白质。本文提供的进一步实施例包括编码包含ace2诱饵肽的多肽的多核苷酸，其中ace2诱饵肽是seq id no:135的多肽或其变体。例如，编码野生型人ace2的多核苷酸在本文中呈现为seq id no:168。普通分子生物学家知道如何改变seq id no:168的序列以编码seq id no:136-144、147-159、和201-212及其适当的变体(例如，与seq id no:136-144中任一者具有至少70％同一性(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)的变体)。编码seq id no:206-212的多核苷酸的非限制性实例在本文中分别提供为seq id no:213-219。编码合适的fc结构域的多核苷酸的非限制性实例在本文中提供为seq id no:169和170。在特定实施例中，多核苷酸编码ace2诱饵多肽，其中位置27处的苏氨酸被酪氨酸替换(t27y)，位置34处的组氨酸被丙氨酸替换(h34a)，并且位置374处的组氨酸被天冬酰胺替换(h374n)。在特定实施例中，多核苷酸由seq id no:216表征。在进一步的实施例中，ace2诱饵肽或其变体与igfc融合或以其他方式连接以形成融合多肽。在特定实施例中，igfc选自由以下组成的组：igafc、igdfc、igefc、iggfc、和igmfc。在igfc是iggfc的情况下，fc可以是igg1fc、igg2fc、igg3fc、或igg4fc。
[0086]
类似地，编码fab重链和轻链的合适多核苷酸的实例在本文中呈现为seq id no:171和172。普通分子生物学家知道如何改变seq id no:171和172的序列以编码具有本文披露的抗刺突和抗rbd抗体的相关cdr的fab片段。类似地，如果用户希望在完整免疫球蛋白的
背景下表达这些fab片段，普通分子生物学家知道如何进一步改变seq id no:171和172以编码fc结构域或其他此类扩展结构。在实施例中，多核苷酸编码包含与seq id no:127-130中的每一个具有至少85％序列同一性的重可变(vh)链和与seq id no:131和132中的每一个具有至少85％同一性的轻可变(v
l
)链的fab片段，其中vh链和v
l
链中的每一个具有三个互补决定区(cdr)。在进一步的实施例中，多核苷酸编码fab片段和可结晶片段(fc)结构域。
[0087]
在某些实施例中，上述多核苷酸可以在支持细胞系中表达。哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或293t细胞特别适合这些目的。上述蛋白质通常是可溶的，因此会从生产细胞中排出，除非它们被修饰为在细胞内保留。以这种方式产生的蛋白质可以从培养基中纯化。如果需要，可以用(例如)聚组氨酸标签或其他此类商业上常见的标签来标记蛋白质以促进纯化。然后可以如下所述将以此方式产生和纯化的蛋白质施用于有需要的受试者。
[0088]
另外地或可替代地，上述多核苷酸可以掺入载体(例如，转染载体或病毒转导载体)中。然后可以将此类载体转染或转导到受试者自身的细胞中。这样，受试者自身的细胞(例如，受试者的呼吸道黏膜)将产生ace2嵌合体和/或抗刺突抗体，以保护这些组织免受sars-cov-2感染。包含上述多核苷酸的载体的非限制性实例在本文中作为seq id no:220-233提供。
[0089]
v.治疗方法
[0090]
上述蛋白质、多核苷酸和载体可用于治疗和/或预防covid-19疾病和/或sars-cov-2或其变体感染。为了治疗和/或预防这种感染和疾病，上述蛋白质、多核苷酸和载体必须以治疗有效量施用于有需要的受试者。受试者可以是有症状的或无症状的。
[0091]
在要转染蛋白质的情况下，可以使用任何合适的施用途径，包括但不限于静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射和吸入(例如气溶胶吸入)。在特定实施例中，包含ace2诱饵肽的fab片段或多肽通过吸入(例如气溶胶吸入)施用于受试者的呼吸道黏膜。在一些实施例中，将包含ace2诱饵肽的fab片段或多肽提供给受试者的呼吸道黏膜。这些蛋白质的治疗有效量包括但不限于1μg蛋白质/kg受试者体重、5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、500μg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg、和1mg/kg或更高。
[0092]
在要转染多核苷酸的情况下，可以施用任何合适的量，包括(但不限于)10ng、50ng、100ng、500ng、1μg、5μg、10μg、50μg、100μg、500μg、1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、和500mg或更高。为了用如本文所述的多核苷酸转染受试者细胞，从受试者中提取细胞，根据已知技术转染它们，然后将转染的细胞输回受试者中将是有用的。特别合适的细胞在全身循环，例如循环淋巴细胞。
[0093]
在要转导多核苷酸的情况下，可以将病毒载体直接施用于受试者，或者可以提取细胞用于转导和再输注。病毒载体可以通过任何合适的施用途径施用于受试者，包括但不限于静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射和吸入(例如气溶胶吸入)。在特定实施例中，病毒载体通过吸入(例如气溶胶吸入)施用。在另一个实施例中，将病毒载体提供给受试者的呼吸道黏膜。
[0094]
治疗有效的病毒量包括但不限于1
×
107个病毒颗粒(vp)、5
×
107个vp、1
×
108个vp、5
×
108个vp、1
×
109个vp、5
×
109个vp、1
×
10
10
个vp、或多于1
×
10
10
个vp。由于腺病毒的载货量大，腺病毒载体特别适合此目的。合适的腺病毒载体包括在wo 98/17783、wo 02/
27007、wo 09/6479、和wo 14/31178中披露的那些，其中每一个通过引用以其全文并入本文。施用这些腺病毒载体的合适方法在wo 16/112188中披露，其通过引用以其全文并入本文。
[0095]
可替代地和/或另外地，可以将蛋白质或多肽(例如与sars-cov-2刺突蛋白结合的ace2诱饵肽或fab片段)的施用与蛋白质或编码刺激对病毒感染(例如sars-cov-2感染)的免疫反应的蛋白质的多核苷酸组合。在适当的情况下，此类治疗包括施用“il-15激动剂”(例如，nai)、免疫刺激细胞因子或其类似物、检查点抑制剂、ox40配体和/或细胞裂解物，以提供damps和pamps来源。多核苷酸可以是病毒载体，例如来自非病原性病毒。在一些实施例中，nai以约5μg/kg/天至约15μg/kg/天的剂量施用。在特定实施例中，nai以约5μg/kg/天、约6μg/kg/天、约7μg/kg/天、约8μg/kg/天、约9μg/kg/天、约10μg/kg/天、约11μg/kg/天、约12μg/kg/天、约13μg/kg/天、约14μg/kg/天、或约15μg/kg/天的剂量施用。在特殊实施例中，nai以约10μg/kg/天施用。
[0096]
在仍进一步的实施例中，施用调节ace和ace2信号传导中的至少一种的另外的药剂。调节ace或ace2信号传导中的至少一种的药剂可以是ace抑制剂或增加ace2表达的化合物。在一些实施例中，化合物可以是ace抑制剂，其选自但不限于由以下组成的组：苯那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、依那普利(enalapril)、培哚普利(perindopril)、莫昔普利(moexipril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)和群多普利(trandolapril)。在一些实施例中，化合物是选自但不限于坎地沙坦(candesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、缬沙坦(valsartan)和氯沙坦(losartan)的血管紧张素受体拮抗剂。另外地或可替代地，另外的药剂可以是bdkrb1/2、agtr1、mas1或肾素的抑制剂。
[0097]
在另一个实施例中，对患有、诊断为患有或疑似患有sars-cov-2的受试者的治疗包括施用il-15激动剂作为唯一治疗剂。可替代地，il-15激动剂与另一种活性剂(例如调节ace或ace2信号传导中的至少一种的药剂)组合施用。在另一个实施例中，对感染、诊断为感染或疑似感染covid-19的受试者的治疗包括il-15激动剂作为唯一治疗剂或与另一种活性剂(例如调节ace或ace2信号传导中的至少一种的药剂)组合。在进一步的实施例中，用于治疗sars-cov-2和/或covid-19感染的il-15激动剂是nai。在一些实施例中，nai以约5μg/kg/天至约15μg/kg/天的剂量施用。在特定实施例中，nai以约5μg/kg/天、约6μg/kg/天、约7μg/kg/天、约8μg/kg/天、约9μg/kg/天、约10μg/kg/天、约11μg/kg/天、约12μg/kg/天、约13μg/kg/天、约14μg/kg/天、和约15μg/kg/天的剂量施用。在特殊实施例中，nai以约10μg/kg/天施用。
[0098]
关于非病原性病毒，应该理解所有适合基因疗法的病毒都被认为适合在本文使用。然而，特别优选的病毒是那些已经在疗法中建立的病毒，包括腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒等。在其他适当的选择中，腺病毒是特别优选的。应该特别理解的是，这些病毒适用于两种有效载荷的递送，即对病毒进入/复制至关重要的宿主蛋白的核酸序列和抗原性病毒蛋白的核酸序列。
[0099]
此外，通常进一步优选的是，病毒是复制缺陷型且非免疫原性病毒。例如，适合的病毒包括经遗传修饰的甲病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒等。然而，腺病毒是特别优选的。例如，经遗传修饰的复制缺陷型腺病毒是优选的，其不仅适用于多次接种，而
且适用于对腺病毒具有预先存在的免疫力的个体中的接种(参见例如，wo 2009/006479和wo 2014/031178，这些专利通过引用以其全文并入)。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括复制缺陷型腺病毒5载体。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体在e2b区域中包含缺失。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体进一步在el区域中包含缺失。在这方面，应该注意的是，在经遗传修饰的复制缺陷型腺病毒中缺失e2b基因和其他晚期蛋白以降低免疫原性。而且，由于这些特定的缺失，此类经遗传修饰的病毒是复制缺陷的，并允许用于相对较大的重组货物。
[0100]
实例
[0101]
提供以下实例来进一步说明本文所披露的本发明，但当然不应将以下实例解释为以任何方式限制其范围。
[0102]
实例1：本文呈现的所选示例性构建体使用maxcyte电穿孔在cho-s中表达。将3.2
×
108个细胞在maxcyte电穿孔缓冲液中进行电穿孔，并在具有cd cho efficient feed的cd opti cho培养基中在32℃和3％co2下培养14天。按照已知的分离程序分离ace2-fc杂合构建体。ace2-fc igg杂合蛋白具有seq id no:234的氨基酸序列，而ace2-fc igg r273q杂合蛋白(缺乏ace2活性)具有氨基酸序列seq id no:235。ace2-fc iga杂合蛋白具有seq id no:236的氨基酸序列，而ace2-fc iga r273q杂合蛋白(缺乏ace2活性)具有氨基酸序列seq id no:237。
[0103]
igg-fc杂合构建体的小规模maxcyte生产的产量和相对纯度在理想范围内。表4提供了尺寸排阻色谱法的数值结果。
[0104][0105]
ace2-igafc表达与ace2-igg1fc表达一样高效，其中突变形式(r273q)相对于非突变形式没有明显差异。传统的igg纯化工艺通常对iga无效，因此使用离子交换色谱和对iga有选择性的亲和介质分离杂合构建体。测试了纯化的ace2-fc杂合构建体对2019-n-cov刺突蛋白的结合和亲合力。表5列出了示例性测试结果。
[0106]
[0107][0108]
在将经修饰的ace2-fc杂合构建体用于诊断测试的情况下，可以选择多种测试形式。一个示例性系统使用固定在msd链霉亲和素板上的生物素标记的ace2-fc杂合构建体和另一种用于检测的经修饰的ace2-fc杂合构建体(磺基标签msd标记)。如所示，ace2-fc杂合构建体具有高灵敏度和特异性。
[0109]
实例2：为了确认本文披露的各种抗刺突抗体对sars-cov-2刺突的亲和力，通过表面等离子体共振(spr)对kd进行了测定。所有spr实验均在pioneer fe(赛多利斯公司(sartorius corporation))上进行，并通过qdat分析软件对数据进行了分析。在涂有抗人igg fc的spr传感器上捕获抗体。使用50nm rbd-sd1或20nm sc-s-pp-t4f样品进行了一步法动力学测定(onestep kinetic assay)。具有结合刺突三聚体和/或rbd肽的能力的mab如上表1和2所示。
[0110]
实例3：为了研究抗体的表位，使用sc-s-pp-t4f、rbd-sd1、和rbd作为分析物。这些不同的构建体展示于图1和2中。所有表位分析均在octet red96e(赛多利斯公司)上进行。在抗人类捕获(ahc)生物传感器上捕获抗体。从20nm sc-s-pp-t4f开始的2
×
稀释系列以及从100nm rbs-sd1和rbd开始的另一个系列用于动力学测定循环。以下表3总结了使用选择的几个mab进行的这些表位测定试验。图3和4示出了其中一些试验的spr图。n-612-004和n-612-017各自以1:1的结合模式结合切割的刺突肽，这在结合rdb-sd1时观察到，表明切割的刺突仅含有s1结构域。所计算的k
off
如下：n-612-004对切割刺突为9.8
×
10-4
，n-612-004对rbd-s1为3.4
×
10-4
，n-612-017对切割刺突为3.9
×
10-3
，且n-612-017对rbd-s1为1.9
×
10-3
。
[0111]
实例4：ni-nta生物传感器涂有his标记的rbd-sd1，并用抗rbd-sd1抗体淬灭。淬灭后立即将传感器与ace2-igg1fc溶液一起孵育，以测定哪种抗体阻断了ace2-iggfc与传感器上的rbd-sd1结合。在图5中，n-612-004同时结合s和s-rbd-sd1，而n-612-002仅结合s。换言之，n-612-002结合rbd或刺突，但不干扰ace2的结合。空间位阻可能解释了低n-612-002结合。重叠的n-612-002和n-612-004线在缓冲液线下方可辨别地延伸，表明ace2/rbd结合受到某种阻碍。值得注意的是，mab n-612-017能够在这些体外条件下几乎完全阻止刺突与ace2的结合。
[0112][0113]
实例5：使用pioneer fe仪器测量igg1与重组刺突三聚体胞外结构域或rbd-sd1蛋白之间的结合亲和力。图6和7中的两种抗刺突igg1对rbd-sd1肽的spr亲和力曲线示出了kd测定。图8-12中的所选一系列抗刺突igg1对sc-s-pp-t4f的spr亲和力曲线示出了kd测定。刺突结合数据的是亲合力增强的数据，产生平缓的解离曲线。
[0114]
实例6：在pioneer fe仪器上测量scfv与重组刺突三聚体胞外结构域或rbd-sd1蛋白之间的结合亲和力。简而言之，将生物素化的抗flag m2抗体固定在涂有中性抗生物素蛋白的pch生物传感器(分子仪器公司(molecular devices)/fortebio公司(fortebio))上。用传感器上的抗flag m2捕获三重flag标记的scfv，并使用一步法注射用重组分析物蛋白测量结合亲和力。刺突三聚体的亲合力效应导致未拟合的平缓解离曲线。图13和14中的两种抗刺突scfv对rbd-sd1肽的spr亲和力曲线示出了kd测定。图15和16中的抗刺突scfv对sars-cov-2刺突三聚体的spr亲和力曲线示出了kd测定。
[0115]
实例7：rbd结构可以比作人的脚，具有“脚跟”、“足弓”和“脚趾”区域。结合界面的仔细分析揭示了“足弓”部分与ace2α-螺旋之间的口袋结构。水可以从这个口袋结构中置换出来，以增加rbd与ace2α-螺旋之间的结合强度。这种α-螺旋的突变体可用作ace2/rbd结合的竞争性抑制剂，或用作从细胞表面ace2隔离rbd的分子阱。图17和表7展示了ace2-igg1fc突变研究，证实“脚跟”是对于与rbd结合亲和力最重要的元件。虽然示出h34a突变型ace2α-螺旋与rbd结合的kd为9.4nm，且示出t27y突变型ace2α-螺旋与rbd结合的kd为3.8nm，但双突变h34a和t27y的存在产生协同效应并将结合亲和力增加到约1nm。
[0116]
[0117][0118]
图18a和18b展示了ace2-igg1fc突变体被成功表达和纯化。
[0119]
表8中的纯化总结示出了单个点突变h34a和t27y以及双突变体(h34a和t27y)的纯化。
[0120][0121]
实例8：测量了野生型ace2-igg1fc抗体、t27y和h34a单突变型以及t27y/h34a双突变型ace2-igg1fc抗体的结合亲和力。如实例3中在ahc生物传感器上捕获抗体。从200μm rbd-sp1开始的两倍稀释系列用于动力学测定循环。图19和20示出了其中一些试验的spr图。下表9总结了两种抗体的结合数据。
[0122][0123]
图21展示了如与野生型ace2-igg1fc和ace2-igg1fc单一突变体相比，ace2-igg1fc双突变(t27y/h34a)对rbd具有优异的结合亲和力。
[0124]
实例9：图22展示了活sars-cov-2中和数据。针对野生型和突变型ace2-igg1fc测试了对sars-cov-2的中和。野生型ace2-igg1fc及其酶失活突变(r273q)足以中和sars-cov-2。具有h34a和t27y突变的ace2-igg1fc(ace2 dbl)在中和sars-cov-2方面比野生型变体要好得多。具有h34a和t27y突变的ace2双突变体在中和sars-cov-2方面与抗体017一样好。表10报告了根据中和实验计算的各种中和抗体和ace2诱饵肽的ic50值。
[0125][0126]
还测试了ace2-igg1fc或ace2 iga与h34a和t27y的组合的中和能力，该组合表达为具有各种抗体的腺病毒疫苗。发现将抗体n-612-017与n-612-007(结合s2)或n-612-004
(结合sd1)任一者或两者组合在一起提高了中和，尽管单独n-612-004或n-612-007都没有很大的中和活性。最后，发现将n-612-017与n-612-014和/或n-612-056组合可显著提高中和。
[0127]
实例10：通过差示扫描荧光法(dsf)测量野生型、r273q突变型和t27y/h34a双突变型ace2诱饵肽的稳定性。将20μl的1mg/ml抗体与10μl的20x sypro橙混合。在cfx96实时系统(伯乐公司(biorad))中以0.5℃的增量从20℃至70℃对板进行扫描。野生型、r273q突变型和t27y/h34a双突变型ace2诱饵肽的dsf结果示出在图23中。
[0128]
实例11：制备了七种三突变型ace2诱饵肽。通过尺寸排阻色谱法测量每个三突变型ace2诱饵肽的大小。简而言之，在含有50mm磷酸钠、250mm氯化钠和ph为6.8的运行缓冲液中，在zenix-csec-300(赛分科技股份有限公司(sepax))(3μm、7.8x 300mm)上运行纯化的三突变型ace2诱饵肽。图24-30示出了每个三突变型ace2诱饵肽的大小。还测定了野生型ace2诱饵肽、r273q突变型ace2诱饵肽、t27y/h34a双突变型ace2诱饵肽和每个三突变型ace2诱饵肽的ace2活性。在75mm hepes、1m氯化钠和ph 7.4中，将1μg/ml每个样品与20μm底物(mca-tyr-val-ala-asp-pro-lys(dnp)-oh(r&d系统公司(r&d systems)))混合。将样品在室温下摇动(700rpm)孵育30分钟。分别在320nm和405nm的激发和发射波长下测量fret信号(顶部读数)。图31示出了野生型和突变型ace2诱饵肽的ace2活性。表11总结了三突变型ace2诱饵肽的结合数据。测量了各种三突变型ace2诱饵肽的稳定性，并将其与单和双ace2突变型诱饵肽进行了比较。如以上实例7所述进行dsf。图32示出了r273q、t27y/h34a、和t27y/h34a/r273q突变型ace2诱饵肽的稳定性。图33示出了三个三突变型ace2诱饵肽如与双突变型ace2诱饵肽相比的稳定性。图34示出了五种三突变型ace2诱饵肽的稳定性。
[0129][0130]
实例12：将野生型ace2诱饵肽与抗生物素蛋白在抗体的c末端融合。如实例7中述，通过dsf测量抗生物素蛋白标记的和未经标记的野生型ace2诱饵肽的稳定性。图35示出了抗生物素蛋白标记的和未经标记的野生型ace2诱饵肽的稳定性。
[0131]
实例13：使抗刺突抗体暴露于野生型和突变型刺突蛋白，并测量抗体对刺突蛋白的结合亲和力。除非另外指示，否则所有实验均使用由10mm hepes(ph 7.4)、150mm nacl、0.02％tween 20、0.1％bsa构成的运行缓冲液。对于nab对sars-cov-2rbd野生型和突变体以及s1变体的1:1结合亲和力测定，将nab固定在ahc传感器(赛多利斯公司)上，并对200、100、50、25、12.5、6.25、3.125nm的rbd(野生型或突变体)和s1浓度系列进行测试以测定kd。
图36示出了n-612-017或n-612-056与野生型或突变型刺突蛋白的结合。图37示出了n-612-004、n-612-014、n-612-017、和n-612-056与野生型刺突或uk变体刺突蛋白的结合。表12和13呈现了各种抗刺突抗体对野生型和突变型刺突蛋白的kd。
[0132][0133][0134]
实例14：使ace2诱饵肽暴露于野生型和突变型刺突蛋白，并测量ace2诱饵肽对刺突蛋白的结合亲和力。除非另外指示，否则所有实验均使用由10mm hepes(ph 7.4)、150mm nacl、0.02％tween 20、0.1％bsa构成的运行缓冲液。对于ace2诱饵肽对sars-cov-2rbd野生型和突变体的1:1结合亲和力测定，将ace2诱饵肽固定在ahc传感器(赛多利斯公司)上，并使用200、100、50、25、12.5、6.25、3.125nm的rbd(野生型或突变体)浓度系列来测定kd。野生型ace2-igg1fc和t27y/h34a/h374n三突变型ace2诱饵-igg1fc与野生型或突变型刺突蛋白的结合示于图38。表14呈现了ace2诱饵肽对野生型和突变型刺突蛋白的k
on
、k
off
、和kd。
[0135][0136]
本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请、和专利)均通过引用特此并入，引用的程度如同每个参考文献被单独地并且明确地指示通过引用并入并且以其全文在本文阐述。
[0137]
除非本文另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)，术语“一个/种(a和an)”和“该”和“至少一个”以及类似指称对象的使用应解释为包括单数和复数二者。除非本文另外指示或与上下文明显矛盾，术语“至少一个”之后是一个或多个项的列表的使用(例如，“a和b中的至少一个”)应理解为是指从所列项(a或b)中选择的一个项或所列项(a和b)中两个或更多个的任何组合。除非另外说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指示，否则本文数值范围的陈述仅意欲用作单独地提及在该范围内的每一独立值的简写方法，且每一独立值是并入说明书中，就如同在本文单独地陈述该值一般。除非本文另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。说明书中的任何语言都不应当解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
[0138]
本文描述了本发明的特定实施例，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述说明之后，那些特定实施例的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用此类变型，并且诸位发明人打算以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括如适用法律允许的所附权利要求书中陈述的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。