一种耐高温碱性脂肪酶及其制备方法和应用

一种耐高温碱性脂肪酶及其制备方法和应用
一、技术领域：
1.本发明属于生物制品以及生物制品制备方法和应用技术领域，具体涉及一种耐高温碱性脂肪酶及其制备方法和应用。
二、

背景技术：

2.脂肪酶可以催化甘油三酯水解为甘油和脂肪酸，具有反应高效、无需辅酶参与、副反应少等优点，广泛应用于食品生产、生物柴油、皮革纺织、香料化合物、日化洗涤和医疗制药等领域。近年来，国际酶市场对脂肪酶的应用需求仅次于蛋白酶和糖酶。预计到2025年，全球的脂肪酶市场产值可达7.977亿美元。相较于国外，我国关于脂肪酶的相关研究时间较短，导致当前实验室研究的脂肪酶种类较多，但工业化生产种类有限。此外，天然脂肪酶的最适温度一般在30～50℃，而在某些应用环境中，环境温度能够达到60℃以上，绝大多数天然脂肪酶难以发挥较好的活性，导致应用效率低下。因此，本领域技术人员致力于开发能够耐受高温环境的脂肪酶。
3.蚜虫莫氏黑粉菌(moesziomyces aphidis,m.aphidis)是一种能够在含植物油为碳源的培养基中进行生长繁殖，大量合成甘露糖赤藓糖醇脂的菌株，具有较好的工业化应用前景，但仍缺乏其合成脂肪酶的相关研究。如果能够挖掘其合成脂肪酶的能力，对推动其工业化生产应用具有重要意义。
4.作为中国的传统主食之一，馒头在工业化生产中常出现表皮皱缩、颜色发暗、结构不均匀等问题。因此，改良馒头品质一直是相关人员重要研究方向。在大健康背景下，使用食品添加剂改良馒头品质的控制越来越严格，国内外关注研究的重点逐渐转向新型酶制剂。有技术人员研究，部分脂肪酶在馒头制作中可以有效改善面团流变学特性、提升成品白度等，但与脂肪酶的种类和添加量密切相关。因此，挖掘新型可用于改良馒头品质的脂肪酶具有实际应用价值。
三、

技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是：根据脂肪酶现有技术的发展情况及其存在的技术问题，本发明提供一种耐高温碱性脂肪酶及其制备方法和应用。本发明技术方案，利用蚜虫莫氏黑粉菌发酵合成脂肪酶，进一步利用离心、冻干或利用离心、盐析、透析和冻干制备得到耐高温碱性脂肪酶。
6.为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：
7.本发明提供一种耐高温碱性脂肪酶，所述耐高温碱性脂肪酶来自蚜虫莫氏黑粉菌(moesziomyces aphidis)，菌株保藏编号为dsm 70725。
8.另外，提供一种上述耐高温碱性脂肪酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
9.a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌置于活化培养基中进行培养，培养时间为30～48h；
10.b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为36～60h；
11.c、将步骤b培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为5～10天；
12.d、将步骤c所得发酵液进行分离或分离纯化，得到耐高温碱性脂肪酶。
13.根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，步骤a中所述活化培养基的配制为：酵母浸粉2.5～3.5g、麦芽浸粉2.5～3.5g、葡萄糖8.0～20.0g、蛋白胨4.0～10.0g和去离子水1l；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后备用；
14.步骤b中所述种子培养基的配制为：nano
3 1.0～4.0g、mgso4·
7h2o 0.2～0.4g、kh2po
4 0.2～0.4g、酵母浸粉1.0～3.0g、葡萄糖30.0～80.0g和去离子水1l；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后备用；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的1～5％；
15.步骤c中所述发酵培养基的配制为：kh2po
4 0.2～0.4g、nano
3 1.0～4.0g、酵母浸粉1.0～3.0g、表面活性剂1.0～4.0ml、碳源30.0～80.0g、硫酸盐0.1～0.5g、诱导剂10.0～40.0ml和去离子水1l；所述发酵培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后备用；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的1～5％。
16.根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，所述表面活性剂为吐温-80、吐温-20、咪唑啉、十二烷基硫酸钠、表面活性剂tx-100和阿拉伯胶中的任一种；
17.所述碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉和糊精中的任一种；
18.所述硫酸盐为caso4、mnso4、znso4、cuso4、feso4和mgso4中的任一种；
19.所述诱导剂为大豆油、花生油、玉米油、橄榄油、葵花油和芝麻油中的任一种。
20.根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，步骤a中所述活化培养基的配制为：酵母浸粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、葡萄糖10.0g、蛋白胨5g和去离子水1l；
21.步骤b中所述种子培养基的配制为：nano
3 3.0g、mgso4·
7h2o 0.3g、kh2po
4 0.3g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40.0g和去离子水1l；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2％；
22.步骤c中所述发酵培养基的配制为：mgso4·
7h2o 0.4g、kh2po
4 0.3g、nano
3 3.1g、酵母浸粉2.24g、吐温-80 3.0ml、葡萄糖50g、花生油20.0ml和去离子水1l；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2％。
23.根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，步骤d中所述分离的具体过程为：将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，去除沉淀，所得上清液为耐高温碱性脂肪酶溶液，冷冻干燥后得到耐高温碱性脂肪酶。
24.根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，步骤d中所述分离纯化的具体过程为：
25.(1)将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，取出沉淀，获得上清液为粗脂肪酶；
26.(2)将所得粗脂肪酶中加入硫酸铵，每升粗脂肪酶中加入200g硫酸铵，然后在4℃下盐析8～12h，离心除去沉淀；接着继续加入硫酸铵，每升粗脂肪酶中继续加入300g硫酸铵，在4℃继续盐析12h，离心获得沉淀蛋白；将所得沉淀蛋白采用tris-hcl缓冲液进行溶解，溶解后转移至透析袋(mw8000-140000da)中，tris-hcl缓冲液中4℃透析24h，每6～8h更换缓冲液，最后进行冻干得到耐高温碱性脂肪酶。
27.本发明制备所得耐高温碱性脂肪酶在催化酯水解中的应用，所述应用中，水解的
温度为60～80℃，ph为7.0～10.0，甘油三酯水解位点无特异性。
28.根据上述的耐高温碱性脂肪酶在催化酯水解中的应用，水解的温度为65～75℃，ph为7.5～8.5。
29.本发明制备所得耐高温碱性脂肪酶在改善馒头品质中的应用，所述耐高温碱性脂肪酶的加入量为5.0～30.0mg/kg面粉(优选为15.0～20.0mg/kg面粉)。
30.本发明的积极有益效果：
31.1、利用本发明技术方案分批发酵生产和制备脂肪酶，最适催化反应温度为70℃，最适反应ph为8.0，-20℃～70℃处理5h或ph5.0～10.0的缓冲液处理1h后，仍保留有80％以上的酶活性，具备良好的热稳定性和ph稳定性。因此，本发明制备的耐高温碱性脂肪酶可广泛应用于工业生产中，尤其是对补充工业化生产的耐高温碱性脂肪酶种类具有重要意义。
32.2、本发明技术方案中，所用的moesziomyces aphidis dsmz 70725菌株具有良好的工业化生产应用前景，其发酵产酶条件温和，培养基来源广泛，发酵生产成本低，具有可持续发展的特点，对实际生产具有很好的推动作用。
33.3、本发明制备所得耐高温碱性脂肪酶在催化酯水解反应中的应用，具有较高的催化效率，在食品、医药、皮革和洗涤剂等多个领域具有应用价值。
34.4、本发明制备所得耐高温碱性脂肪酶在改良馒头品质中的应用，具有较高的催化效率，在食品、医药、皮革和洗涤剂等多个领域具有应用价值。
四、附图说明
35.图1不同初始ph对本发明脂肪酶制备的影响。
36.图2不同培养温度对本发明脂肪酶制备的影响。
37.图3本发明实施例1制备所得脂肪酶的最适反应温度及热稳定性。
38.图4ph对本发明实施例1制备所得脂肪酶的影响及其稳定性。
39.图5金属离子对本发明实施例1制备所得脂肪酶的影响。
40.图6表面活性剂及抑制剂对本发明实施例1制备所得脂肪酶活性的影响。
41.图7本发明实施例1制备所得粗脂肪酶的盐析曲线。
42.图8本发明实施例2制备所得脂肪酶的最适反应温度。
43.图9本发明实施例2制备所得脂肪酶的最适反应ph及ph稳定性。
44.图10金属离子对本发明实施例2制备所得脂肪酶活性的影响。
45.图11表面活性剂及抑制剂对本发明实施例2制备所得脂肪酶活力的影响。
46.由图11可知，吐温-20、吐温-80、曲拉通-100、咪唑啉浓度均为0.05％(v/v)，sds、edta、阿拉伯胶浓度均为1mm。
47.图12本发明实施例2制备所得脂肪酶水解三油酸甘油酯反应产物的薄层色谱图。
48.图12中，a：三油酸甘油酯标准品；b：1，3-二油酸甘油酯标准品；c：1,2-二油酸甘油酯标注品；d：三油酸甘油酯的水解产物。。
49.图13本发明实施例2制备所得脂肪酶对馒头比容的影响。
50.图14本发明实施例2制备所得脂肪酶在馒头中应用效果图(馒头外观和切片图)。
51.图14中，(a)(c)为空白对照；(b)(d)为添加20mg/kg本发明制备所得脂肪酶制作的馒头。
五、具体实施方式：
52.以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明技术方案保护的范围。
53.本发明实施例中，采用的酶活测定方法为：以4-硝基苯磷酸二钠(p-npp)为底物，在2.00ml离心管中加入600.0μl底物溶液，以及25.0μl稀释后的脂肪酶溶液，对照组加入等量tris-hcl缓冲液，反应条件为70℃、10min，反应终止剂为500.0μl无水乙醇，离心测定od410 nm，并计算酶活。其中，绘制的脂肪酶活标准曲线方程为：y＝0.0054x+0.0006，相关系数r2＝0.9992。
54.实施例1：
55.本发明耐高温碱性脂肪酶的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
56.a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌(moesziomyces aphidis，菌株保藏编号为dsm 70725)置于活化培养基中进行培养，培养时间为36h；
57.所述活化培养基的配制为：酵母浸粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、葡萄糖10.0g、蛋白胨5g和去离子水1l，初始ph未调节；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后进行使用；
58.b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为48h；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2％；
59.所述种子培养基的配制为：nano
3 3.0g、mgso4·
7h2o 0.3g、kh2po
4 0.3g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40.0g和去离子水1l，初始ph未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
60.c、将步骤b培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为7天，所述培养发酵过程中装液量为30ml，培养温度为25.8℃；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2％；
61.所述发酵培养基的配制为：mgso4·
7h2o 0.4g、kh2po
4 0.3g、nano
3 3.1g、酵母浸粉2.24g、吐温-80 3.0ml、葡萄糖50g、花生油20.0ml和去离子水1l；初始ph未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
62.d、将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，去除沉淀，所得上清液为耐高温碱性脂肪酶溶液(测定脂肪酶溶液酶活达83.14
±
1.09u/ml)，冷冻干燥后得到耐高温碱性脂肪酶。
63.实施例2：
64.本发明耐高温碱性脂肪酶的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
65.a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌置于活化培养基中进行培养，培养时间为36h；
66.所述活化培养基的配制为：酵母浸粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、葡萄糖10.0g、蛋白胨5g和去离子水1l，初始ph未调节；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后进行使用；
67.b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为48h；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2％；
68.所述种子培养基的配制为：nano
3 3.0g、mgso4·
7h2o 0.3g、kh2po
4 0.3g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40.0g和去离子水1l，初始ph未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
69.c、将步骤b培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为7天，所述培养发酵过程中装液量为30ml，培养温度为25.8℃；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2％；
70.所述发酵培养基的配制为：mgso4·
7h2o 0.4g、kh2po
4 0.3g、nano
3 3.1g、酵母浸粉2.24g、吐温-80 3.0ml、葡萄糖50g、花生油20.0ml和去离子水1l；初始ph未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
71.d、将发酵后的发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，取出沉淀，获得上清液为粗脂肪酶液；
72.将所得粗脂肪酶液中加入硫酸铵，每升粗脂肪酶液中加入200g硫酸铵，然后在4℃下盐析12h，离心除去沉淀；接着继续加入硫酸铵，每升粗脂肪酶液中继续加入300g硫酸铵，在4℃继续盐析12h，离心获得沉淀蛋白；将所得沉淀蛋白采用tris-hcl缓冲液进行溶解，溶解后转移至透析袋(mw8000-140000da)中，tris-hcl缓冲液中4℃透析24h，每6h更换缓冲液，最后进行冻干得到耐高温碱性脂肪酶。
73.实施例3：
74.本发明耐高温碱性脂肪酶的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
75.a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌(moesziomyces aphidis，菌株保藏编号为dsm 70725)置于活化培养基中进行培养，培养时间为32h；
76.所述活化培养基的配制为：酵母浸粉2.8g、麦芽浸粉3.2g、葡萄糖15.0g、蛋白胨6g和去离子水1l，初始ph未调节；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后进行使用；
77.b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为42h；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2.5％；
78.所述种子培养基的配制为：nano
3 2.7g、mgso4·
7h2o 0.28g、kh2po
4 0.28g、酵母浸粉1.2g、葡萄糖38.0g和去离子水1l，初始ph未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
79.c、将步骤c培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为8天，所述培养发酵过程中装液量为30ml，培养温度为25.0℃；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2.5％；
80.所述发酵培养基的配制为：mgso4·
7h2o 0.3g、kh2po
4 0.2g、nano
3 1.0g、酵母浸粉1.0g、吐温-80 2.0ml、葡萄糖40g、花生油30.0ml和去离子水1l；初始ph未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
81.d、将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，去除沉淀，所得上清液为耐高温碱性脂肪酶溶液，冷冻干燥后得到耐高温碱性脂肪酶。
82.实施例4：
83.本发明耐高温碱性脂肪酶的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
84.a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌(蚜虫莫氏黑粉菌(moesziomyces aphidis)，菌株保藏编号为dsm 70725)置于活化培养基中进行培养，培养时间为40h；
85.所述活化培养基的配制为：酵母浸粉3.2g、麦芽浸粉2.8g、葡萄糖9.0g、蛋白胨4.5g和去离子水1l，初始ph未调节；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭
菌后进行使用；
86.b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为50h；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2.5％；
87.所述种子培养基的配制为：nano
3 3.2g、mgso4·
7h2o 0.32g、kh2po
4 0.32g、酵母浸粉1.5g、葡萄糖45.0g和去离子水1l，初始ph未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
88.c、将步骤c培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为7天，所述培养发酵过程中装液量为50ml，培养温度为20.0℃、25.0℃、30.0℃、35.0℃、40.0℃或45.0℃；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2.0％；
89.所述发酵培养基的配制为：mgso4·
7h2o 0.3g、kh2po
4 0.3g、nano
3 3.0g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40g和去离子水1l；初始ph调节为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
90.d、将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，去除沉淀，所得上清液为耐高温碱性脂肪酶溶液，冷冻干燥后得到耐高温碱性脂肪酶。
91.不同培养温度对本发明脂肪酶制备的影响：
92.培养温度分别为20.0℃、25.0℃、30.0℃、35.0℃、40.0℃或45.0℃时，摇瓶发酵培养7天，测定脂肪酶活，结果见附图2。由图2可知，在20～45℃温度范围内，发酵液脂肪酶活呈现为先增加后降低的趋势，其中，25℃条件下所得发酵液中的脂肪酶活最高，为49.99
±
0.05u/ml，40.0℃或45.0℃温度下的脂肪酶活＜5u/ml。
93.不同初始ph值对本发明脂肪酶制备方法的影响：
94.初始ph分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0时，摇瓶发酵培养7天，测定发酵液脂肪酶见附图1。由图1可知，发酵液初始ph值在4.0～9.0范围内，对脂肪酶活并没有显著性影响。
95.响应面优化产酶发酵条件：
96.利用plackett-burman试验对葡萄糖添加量(a)、nano3添加量(b)、酵母浸粉添加量(d)、mgso4添加量(e)、花生油添加量(g)、吐温-80添加量(h)、装液量(j)、温度(k)共8个因素，分别设计高、低两个水平，另设3个虚拟空白项考察试验误差，脂肪酶活为响应值，试验设计水平和响应值分别见表1和表2。
97.表1pb试验设计因素水平
[0098][0099]
表2pb试验设计方案及实验响应值(n＝12)
[0100][0101]
对pb试验结果进行处理分析，结果见表3。由此可以看出，葡萄糖添加量、吐温-80添加量、装液量添加量对发酵产脂肪酶具有负效应，nano3添加量、酵母浸粉添加量、mgso4添加量、花生油添加量、温度对发酵产脂肪酶具有正效应。8个因素对脂肪酶活的影响顺序为：nano3添加量》温度》酵母浸粉添加量》装液量》葡萄糖添加量》吐温-80添加量》花生油添加
4.26c2。r2＝0.9973，r
2adj
＝0.9938。
[0109]
表5响应面设计因素及水平
[0110][0111]
表6响应面设计结果
[0112][0113][0114]
回归模型分析可知，模型的决定系数r2＝0.9973，变异系数c.v.％＝1.91，说明拟合较好，试验结果可信。其中，酵母浸粉添加量和nano3添加量、酵母浸粉添加量和温度的交互作用对脂肪酶活有显著影响，而nano3添加量和温度对脂肪酶活的交互作用不显著。进一步利用软件计算分析，预测脂肪酶活最高值为81.90u/ml，此时nano3添加量为3.1g/l，培养温度为25.8℃，酵母浸粉添加量为2.24g/l。
[0115]
响应面拟合模型验证脂肪酶制备实验：
[0116]
根据响应面模型结果对模型进行验证实验，测定脂肪酶活为83.14
±
1.09u/ml，与模型预测值相差小于1.50％，说明响应面优化法能显著提高m.aphidis合成脂肪酶活，所得模型真实有效。
[0117]
后续测试中表征耐高温碱性脂肪酶的酶学性质，其中温度和ph对脂肪酶活性的测定分别以最佳酶活为对照(100％)，温度和ph对脂肪酶稳定性以及金属离子、表面活性剂和抑制剂、有机溶剂对脂肪酶的影响，均以未处理的酶液为对照(100％)，计算各处理条件下的相对酶活，公式为：
[0118]
相对酶活(％)＝各处理条件下的酶活(u/ml)/未处理条件下酶活(u/ml)。
[0119]
本发明实施例1制备所得脂肪酶的最适反应温度及热稳定性：
[0120]
测定实施例1所得脂肪酶的最适反应温度结果见附图3(a)。40℃～90℃时，脂肪酶活力呈现先增大后减小的趋势，在70℃时酶活最高，当温度》70℃时粗脂肪酶仍然具有70％以上的活性，表明所得脂肪酶在一定时间内具有耐高温特性。测定所得脂肪酶的热稳定性结果见附图3(b)。所得脂肪酶在-20℃～70℃条件下处理1～5h具有良好的稳定性，相对酶活均高于80％。90℃处理1h后，相对酶活接近0，时间延长后完全失活，表明其不能长时间耐受90℃及以上的高温。
[0121]
本发明实施例1所得脂肪酶的最适反应ph及ph稳定性：
[0122]
测定实施例1所得脂肪酶最适ph和ph稳定性测定结果见附图4。脂肪酶在缓冲液ph为8时表现出最大活性，在ph5～6时的脂肪酶活显著降低，在ph》8环境下相对酶活较高，且脂肪酶在ph 5～10范围处理1h后，相对酶活保持在80％以上，表明m.aphidis所产脂肪酶更适合应用于碱性环境中，且具有一定的耐酸碱特性。
[0123]
金属离子对本发明实施例1所得脂肪酶活性的影响：
[0124]
测定不同种类和浓度的金属离子对实施例1所得脂肪酶活性的影响，结果见附图5。与对照组相比，0.1mm、0.5mm、10mm的mn
2+
、mg
2+
以及10mm ca
2+
溶液中的脂肪酶相对酶活均在90％以上，具有较好的催化活性。m.aphidis合成脂肪酶的相对酶活随着ca
2+
浓度的升高而逐渐增大，随着fe
2+
、fe
3+
、zn
2+
浓度的升高而逐渐降低，其中zn
2+
存在条件下脂肪酶活抑制程度最大，加入10mm的zn
2+
时，相对酶活仅为3.81
±
0.33％。不同浓度的cu
2+
对脂肪酶的相对酶活具有显著的抑制作用。
[0125]
表面活性剂及抑制剂对本发明实施例1所得脂肪酶活性的影响
[0126]
测定不同表面活性剂和抑制剂对实施例1所得脂肪酶活性的影响，结果见附图6。由图6可以看出，吐温-20、吐温-80、曲拉通-100和sds都能够增大脂肪酶活，其中曲拉通-100的促进作用最显著，相对酶活达152.36
±
1.66％。吐温-20、吐温-80和sds条件下的相对酶活并无显著性差异，说明这3种表面活性剂对脂肪酶酶活促进作用效果接近。抑制剂edta对酶活无显著的促进或抑制作用。阿拉伯胶和咪唑啉存在条件下，脂肪酶相对酶活受到显著抑制，其中咪唑啉对脂肪酶活抑制作用最强，相对酶活仅为39.15
±
1.95％。
[0127]
有机溶剂对本发明实施例1所得脂肪酶活性的影响：
[0128]
从表7可以看出，甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、dmso等亲水性有机溶剂对脂肪酶表现出一定的激活作用，其中，30％异丙醇可以将脂肪酶的相对酶活提高约30％。在疏水性有机溶剂中，苯、甲苯、乙醚、正己烷能够显著提高脂肪酶催化活性，而氯仿中孵育1h后的相对酶活下降了约46％，呈现出明显的抑制作用。
[0129]
表7有机溶剂对实施例1所得脂肪酶活性的影响
[0130][0131]
本发明实施例1制备所得脂肪酶溶液的盐析曲线：
[0132]
本发明实施例1制备所得粗脂肪酶经过盐析，测定沉淀物质的蛋白含量、脂肪酶活和上清液的脂肪酶活，结果见附图7。当硫酸铵比例在20～60％时，沉淀的酶活和沉淀蛋白含量随着硫酸铵比例的增加逐渐增大，而上清液的酶活随之逐渐下降。当硫酸铵比例在60～90％时，沉淀和上清酶活以及沉淀蛋白含量基本保持不变。当硫酸铵比例为20％时，上清酶活含量较高，沉淀中含有部分蛋白，但酶活较低。当硫酸铵比例高于60％时，沉淀酶活和蛋白含量基本保持不变。
[0133]
本发明实施例2耐高温碱性脂肪酶的制备过程中，分别利用酸铵分级盐析、透析袋除盐处理粗脂肪酶制备得到纯化脂肪酶，测定各步骤获得样品的蛋白含量、脂肪酶活，计算出总蛋白、总酶活、回收率等纯化参数，结果见表8。由表8可以看出，随着分离纯化步骤的进行，比酶活和纯化倍数逐渐增加。将纯化脂肪酶冻干得到耐高温碱性脂肪酶。
[0134]
表8离心所得脂肪酶溶液制备耐高温碱性脂肪酶参数表
[0135][0136]
以下实验中，表征耐高温碱性脂肪酶的酶学性质，其中，温度和ph对脂肪酶活性的测定分别以最佳酶活为对照(100％)，温度和ph对脂肪酶稳定性以及其它酶学性质评价均以未处理的酶液为对照(100％)，计算各处理条件下的相对酶活，公式为：
[0137]
相对酶活(％)＝各处理条件下的酶活(u/ml)/未处理条件下酶活(u/ml)。
[0138]
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶的最适反应温度及热稳定性：
[0139]
测定脂肪酶的最适反应温度，结果见附图8。当温度在40℃～70℃时，酶活大小与
温度高低呈正相关，70℃时纯化脂肪酶表现出最大的催化活性，表明纯化脂肪酶最适反应温度为70℃。80℃、90℃时相对酶活在40％左右。将脂肪酶在不同温度下孵育1、2、3、4、5h后，结果见表9。由表9可以看出，不同温度处理时间对脂肪酶活力大小影响较大。当50℃、70℃孵育时间超过2h，相对酶活损失一半。90℃孵育时间超过2h，脂肪酶完全失活。
[0140]
表9本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶的热稳定性
[0141][0142]
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶的最适反应ph及ph稳定性：
[0143]
将底物与不同ph缓冲液混合，测定脂肪酶活力，计算相对酶活，结果见附图9。缓冲液ph为8.0时纯化脂肪酶活力最大。在ph 5.0～6.0范围内，测定的纯化脂肪酶活力极低。当ph＝9.0时，相对酶活为58.64％。用不同ph(5.0～10.0)缓冲液在4℃下处理粗酶液1h，计算剩余酶活。结果见附图9。纯化脂肪酶在ph 5.0～10.0范围内的稳定性较粗脂肪酶差，酶活明显被抑制，同时在弱碱环境中仍然具有一定的催化活性。
[0144]
金属离子对本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶活性的影响：
[0145]
将脂肪酶与不同种类和浓度的金属离子混合，4℃孵育1h，测定酶活，结果见附图10。cu
2+
、mg
2+
以及0.1mm ca
2+
、mn
2+
、fe
2+
、fe
3+
溶液对纯化脂肪酶活影响较小，相对酶活均在80％以上。脂肪酶在0.5mm、10mm的mn
2+
、fe
3+
、zn
2+
条件下酶活影响较大，相对酶活保持在0.2％～48％。其中zn
2+
对脂肪酶的抑制作用最为显著。
[0146]
表面活性剂及抑制剂对本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶活性的影响：
[0147]
将脂肪酶与不同表面活性剂及抑制剂混合，4℃条件下孵育1h，测定脂肪酶活，结果见附图11。吐温-20、吐温-80、曲拉通-100或sds存在下，脂肪酶活均在90％以上。而edta、咪唑啉和阿拉伯胶对酶活略有抑制，但相对酶活均在85％以上。
[0148]
有机溶剂对本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶活性的影响：
[0149]
将脂肪酶与不同有机溶剂混合，4℃孵育1h，结果见表10。脂肪酶在亲水性有机溶剂中可以保持很好的催化活性(相对酶活》80％)。在疏水性有机溶剂中，苯、甲苯、乙醚以及正己烷对脂肪酶活力影响不大，但在氯仿中孵育1h后，脂肪酶活损失超过50％。
[0150]
表10有机溶剂对本发明实施例2制备所得纯化脂肪酶活性的影响
[0151][0152]
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶催化酯水解反应：
[0153]
薄层色谱分析所述脂肪酶作用三油酸甘油酯的水解产物，结果见附图12，水解反应产物中同时出现了1,3-二油酸甘油酯和1,2-二油酸甘油酯，并且含量相近，说明m.aphidis合成脂肪酶无明显的位置特异性，水解甘油三酯的催化效率较高。
[0154]
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶改善馒头比容：
[0155]
脂肪酶ma对馒头比容和高径比的影响见附图13。由图13可以看出，添加脂肪酶可以使馒头比容显著性增大，高径比显著性减小。当添加量为20mg/kg时，馒头比容和高径比数值变化幅度最大。由显著性分析可知，添加量为15mg/kg时的比容和高径比与添加量为20mg/kg的数据并无显著性差异。当脂肪酶ma添加量为15mg/kg时，其中比容从原来的2.11ml/g增加到2.57ml/g；高径比由原来的0.74降低到0.69。
[0156]
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶改善馒头质构：
[0157]
脂肪酶ma对馒头质构的影响见表11。可以看出，馒头的硬度、胶着性和咀嚼性随着脂肪酶ma添加量的增多变化趋势表现为先减小后增大。脂肪酶ma可以显著降低馒头硬度，改善馒头口感，并在添加量为20mg/kg时，馒头硬度得到最大程度改善。
[0158]
表11本发明制备耐高温碱性脂肪酶ma对馒头质构的影响
[0159][0160]
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶对馒头色泽的改善：
[0161]
脂肪酶对馒头皮和馒头芯色泽的影响分别见表12。发现脂肪酶添加量为15mg/kg时，可以使馒头皮亮度值l*由82.38
±
0.35提升至84.67
±
0.27，馒头芯的亮度值l*由78.82
±
0.11提升至80.57
±
0.19。同时，脂肪酶添加量为20mg/kg时，馒头皮和馒头芯的亮度值与15mg/kg的亮度值并无显著性差异。总的来看，所述脂肪酶可以显著增大馒头成品白度。
[0162]
表12本发明制备所得脂肪酶对馒头皮和馒头芯色泽的影响
[0163][0164]
本发明实施例2制备所得脂肪酶对馒头外观和结构的改善：
[0165]
分别制作未添加脂肪酶和添加量为20mg/kg的馒头，对比馒头外观和结构，结果见附图14。由图14可以看出，添加脂肪酶的馒头表面更加光滑白净，内部结构更加良好。