一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用，本发明构建的毕赤酵母工程菌能高效表达来源于圆弧青霉的碱性脂肪酶基因，摇瓶发酵酶活可达1630U/mL；本发明的重组碱性脂肪酶的最适作用pH为8.5，最适温度为35℃。本发明所述的含有碱性脂肪酶的洗涤剂组合物去污力强，对环境的污染小，具有很高的推广应用价值。
【专利说明】一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用
[0001]【技术领域】
本发明属于微生物工程【技术领域】，具体涉及一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(Lipase)，即三酰基甘油酰基水解酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶的基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链，其催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。
[0003]脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、PH和热稳定性等方面存在不同。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围、高稳定性和活性，对底物的特异性，因此对微生物脂肪酶的开发具有重要的意义。
[0004]碱性脂肪酶是指在碱性条件下水解的脂肪酶，它能水解天然油脂，产生脂肪酸和甘油，是一种专门在异相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。碱性脂肪酶是一种新型洗涤剂用酶，主要用途是作为洗涤剂的新酶种。它的特性是能分解衣物油污成甘油二酯、甘油单酯及脂肪酸等较易溶于 水的物质，从而显著提高洗涤剂的效果，尤其是去除黄斑的效果。此外，碱性脂肪酶还可应用于纺织、食品、纤维及造纸工业领域。因此，碱性脂肪酶具有更广的应用价值，成为目前研究的热点之一。
【发明内容】
[0005]本发明为解决现有技术问题，提供了一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用。本发明通过构建含有圆弧青霉eye I opium")的脂肪酶基因的表达质粒,转化入毕赤酵母中，从而获得高效重组表达该碱性脂肪酶的毕赤酵母工程菌株，从而弥补现有技术的不足。
[0006]本发明一方面提供了一种工程菌，其携带有表达脂肪酶的重组质粒。
[0007]所述工程菌为毕赤酵母ALip {Pichia pastor is ALip)。
[0008]所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0009]所述脂肪酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。
[0010]本发明另一方面提供了上述工程菌在生产脂肪酶中的应用。
[0011]本发明构建的毕赤酵母工程菌能高效表达来源于圆弧青霉的碱性脂肪酶基因，摇瓶发酵酶活可达1630U/mL ;本发明的重组碱性脂肪酶的最适作用pH为8.5，最适温度为35°C。本发明所述的含有碱性脂肪酶的洗涤剂组合物去污力强，对国际污布EMPA116及EMPA117上的去污效果要好于竞争产品，且对环境的污染小，具有很高的推广应用价值。【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为毕赤酵母工程菌ALip发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中泳道I为毕赤酵母工程菌ALip发酵上清液，泳道2为对照组，箭头所指处的条带即为本发明的重组脂肪酶。
【具体实施方式】
[0013]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
[0014]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale etal.，2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
[0015]下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
[0016]实施例1碱性脂肪酶基因的克隆
将圆弧青霉eye I opium)过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm 离心 5 min，弃上清；加入 400 ii I 抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后，加入200 u I 10M NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm离心lOmin，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，_20°C放置30min ； 13000 rpm离心lOmin，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存 。利用OMEGA公司的E.Z.N.A.Fungal RNA Kit制备草酸青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。
[0017]以提取的圆弧青霉基因组总DNA为模板，设计引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为950C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 个循环；72°C，7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
[0018]将回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体，获得克隆载体命名pT-ALip，送至北京华大基因研究中心进行测序分析，获得的核苷酸序列为SEQ ID N0:2，其编码氨基酸序列为为SEQ ID NO:1。通过NCBI Blast比对分析，该序列与圆弧青霉的碱性脂肪酶基因的序列相似性为90%，为一新的等位基因。
[0019]实施例2表达载体的构建
以质粒pT- ALip为模板，利用引物进行PCR扩增，PCR扩增条件是94°C 5min ；94°C30S ；55°C 30S，72°C 2min 30个循环；72°C lOmin。凝胶回收扩增产物，进行XbaI和Kpn I双酶切；对表达质粒PPIC9K也进行XbaI和Kpn I双酶切；用T4连接酶把双酶切产物和表达载体4°C连接过夜；把连接产物导入大肠杆菌DH5 a。获得相应的阳性克隆表达质粒命名为 pPIC-ALip。
[0020]实施例3毕赤酵母工程菌的构建表达质粒pPIC- ALip用Sac I酶切电泳鉴定；乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3 y g/UL浓度稀释质粒片段保存备用。
[0021]制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，重悬于I mL预冷的电泳缓冲液中(配方:lmM MgCl2, IOmM HEPES, 250mM 蔗糖，pH 7.8)。在 80 y L 感受态细胞中加入 5 y L 线性化重组质粒pPIC- ALip ;电转化(条件为1500V、200Q、25iiF);最后涂布于MM平板(MM培养基组分:1.34%YNB，4X 10_5%生物素，0.5%甲醇)，挑选其中一株重组菌株命名为毕赤酵母 ALip {Pichia pas toris ALip
[0022]实施例4发酵和酶学性质测定
将上述毕赤酵母工程菌ALip接种于5ml BMGY ( I %酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 %YNB, 4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基(I %酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，0.5%甲醇)，每12小时补加50 ii L甲醇，诱导培养5天，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，箭头所指31kDa处有一明显的蛋白条带，分子量大小与预测一致，说明本发明构建的毕赤酵母工程菌株能有效重组表达碱性脂肪酶。
[0023]脂肪酶活力单位
Ig固体酶粉(或Iml液体酶),在一定温度和pH条件下，Imin水解底物产生I U mo I的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
[0024]酶活测定方法:
取两个100ml三角瓶，分别于 空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加入底物溶液4.0Oml和磷酸缓冲液5.00ml，再于A瓶中假如95%乙醇15.00ml，于40°C ±0.2°C水浴中预热5min，然后于A、B瓶中各加待测酶液1.0Oml，立即混匀计时，准确反应15min后，于B瓶中立即补加95%乙醇15.0Oml终止反应，取出；于空白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保存30s，不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
[0025]脂肪酶的酶活力按下列公式计算:
【权利要求】
1.一种工程菌，其携带有表达脂肪酶的重组质粒。
2.如权利要求1所述工程菌，其特征在于，所述工程菌为毕赤酵母ALip{Pichiapas toris ALip)。
3.如权利要求1或2所述工程菌，其特征在于，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQID NO:1o
4.如权利要求1或2所述工程菌，其特征在于，所述脂肪酶的编码核苷酸序列为SEQIDNO: 2。
5.权利要求1或2所述的工程菌在生产脂肪酶中的应用。
【文档编号】C12R1/84GK103667091SQ201310654578
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】李佩佩, 张青, 王华明, 黄亦钧 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司