一种野生奥德蘑种类的鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种野生奥德蘑鉴定方法，包括：（1）野外采集；（2）外部形态鉴定；（3）微观结构鉴定；（4）分子序列鉴定；（5）综合鉴定：综合外部形态特征、微观结构和分子序列比对的种类，综合比较，准确确定野生奥德蘑的种类。本发明与常规形态学鉴定相比，具有鉴定准确性高、定位准确的优点，在我国奥德蘑品种的鉴定中具有代表性。
【专利说明】一种野生奥德蘑种类的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于野生奥德蘑的鉴定领域，特别涉及一种野生奥德蘑种类的鉴定方法。【背景技术】
[0002]我国蘑菇鉴定从20世纪初就已有，但一直处于传统的外部形态特征阶段，较为原始，且鉴定不准确 ，很多情况下不能定位到种的水平。随着显微镜在蘑菇鉴定中的应用，微观结构观察已应用于蘑菇的鉴定中。外部形态和微观结构的结合，使蘑菇鉴定准确度大为提高。但很多情况下并不能准确区分开属内种间的差异，特别是两个较为相似的属内种类。20世纪后期，随着分子水平的发展，分子序列逐渐在鉴定中有所应用，特别是蘑菇基因中较为保守的ITS序列逐渐在蘑菇鉴定中得到重视。蘑菇中，奥德蘑种类是一个大的类群，而中国的奥德蘑种类占世界的很大一部分。而中国奥德蘑种类的鉴定一直为传统的形态学鉴定，而中国为全球生物多样性最丰富的国家之一，中国发现的野生奥德蘑种类逐年增加，同时，奥德蘑种类的人工栽培等近年逐渐在市场中受到重视，如长根奥德蘑等已在市场中出现，并深受好评，因此发现并鉴定从而进行奥德蘑的开发利用势在必行。而鉴定不准确的现状制约了奥德蘑种类应用的发展。因此探索并发现新的鉴定奥德蘑种类的方法迫在眉睫。
[0003]面对这种形势，需要我们进一步加快野生奥德蘑种类鉴定技术的研究，在传统鉴定研究中引进更为有效准确的野生奥德蘑种类鉴定技术和方法。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种野生奥德蘑种类的鉴定方法，通过采用外部形态特征、显微结构和分子序列相结合的新方法对野生奥德蘑种类进行鉴定。
[0005]本发明的一种野生奥德蘑鉴定方法，包括下列步骤:
[0006](I)野外采集
[0007]先对从野外采集的野生奥德蘑子实体进行拍照，拍摄清楚菌盖、菌柄、菌环和菌褶等部位以及子实体周围的生境；照片拍摄后采集奥德蘑野生子实体，测量并记录其外部形态特征，并进行菌种分离；
[0008](2)外部形态鉴定
[0009]将步骤(1)采集到的野生奥德蘑子实体的外部形态特征和现有的奥德蘑子实体的外部形态特征进行比对，找出相似种类；
[0010](3)微观结构鉴定
[0011]将步骤(1)得到的奥德蘑野生子实体进行显微结构观察，然后将野生奥德蘑与步骤(2)得到的相似种类的奥德蘑的显微结构进行比对，找到显微结构相似的种类；
[0012](4)分子序列鉴定
[0013]I) DNA提取:提取总DNA，测定浓度后调节至IOOng/μ L备用；
[0014]2)PCR扩增:选用真菌通用引物ITSl和ITS4扩增奥德蘑核糖体RNA部分18S、ITSU5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反应体系总量20 μ L，包含有Taq酶5U、Mg2+L 5mmol/L、dNTP 各 200 μ mol/L、引物各 1.0X 10-5 μ mol、模版 DNAlOOng ；PCR 反应程序94°C预变性 5min，30 个循环中 94°C 50s、51°C 50s,72°C lmin，最后 72°C延伸 lOmin。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统观察后，用回收试剂盒回收扩增片段；
[0015]3)PCR测序:经ITS扩增片段进行双向测序，测序结果经过比对拼接后确定最终序列；
[0016]4) ITS序列分析:将测序好的序列在Genebank中进行Blast比对；
[0017](5)综合鉴定:综合外部形态特征、微观结构和分子序列比对的种类，综合比较，准确确定野生奥德蘑的种类。
[0018]将步骤(1)中所采集到的奥德蘑野生子实体放入固定的器具中以免损坏。
[0019]步骤(1)中所示的测量并记录其外部形态特征包括:测量菌盖直径、菌柄长度和直径，与比色卡进行比对并记录菌盖、菌柄、菌褶颜色及形状，记录其味道和气味。
[0020]步骤(3)中所述的显微结构观察的具体操作为:选取步骤(1)得到的奥德蘑野生子实体的菌褶少许，放入事先配置好的滴定有5%K0H溶液的载玻片上，待菌褶充分溶解还原后，盖上盖玻片，置于放大400倍的显微镜下观察，观察孢子、担子、囊状体、菌丝等显微结构的特征，并测量其大小，同时进行显微照片拍摄。
[0021]步骤(4)中所述的提 取总DNA的方法为采用改良的CTAB法提取总DNA，包括:
[0022]I)将_20°C冷冻干燥的野生奥德蘑子实体0.1g研磨成粉末，加入65°C预热的2XCTAB抽提液，65°C保温45min以上，间或轻摇混匀；
[0023]2) 12000rpm, 4°C离心 20min,取上清液；
[0024]3 )加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液，其中酚、氯仿和异戊醇的体积比为
25:24:1，轻轻混匀lOmin, 12000rpm, 4°C离心lOmin,取上清液移入新离心管中；
[0025]4)加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，其中的氯仿、异戊醇的体积比为24:1，轻轻混匀lOmin, 12000rpm,4°C离心lOmin,取上清液移入新离心管中；
[0026]5)加入2/3体积的_20°C预冷的异丙醇,轻轻摇动5min,8000rpm,4°C离心lOmin,去上清;
[0027]6)将沉淀依次用体积百分数为75%的乙醇、lOmmol/L醋酸钾各洗涤2~3次，每次8000rpm,室温离心5min ；
[0028]7)加入预冷的体积百分数为95%的乙醇,轻轻上下颠倒,8000rpm室温离心IOmin,
弃乙醇，真空抽干或自然晾干；
[0029]8)加入IOOuL 10 X TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
[0030]9)加入 IuL 10mg/mL RNaseA37°C水浴，lhr,去除 RNA，即得 DNA 提取物，于 _20°C冰箱贮藏备用。
[0031]步骤(4)中所述的真菌通用引物ITSl 为:5，-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’，ITS4 为 5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，。
[0032]步骤(4)中所述的ITS序列分析中，有相同的序列，则比对的两种奥德蘑种类相同。
[0033]步骤(4)中所述的ITS序列分析中，序列相似度低于98%或找不到对应的序列，则为两个不同的奥德蘑种类。
[0034]有益效果:[0035]本发明鉴定方法与常规形态学鉴定相比，具有检测准确性高、定位准确的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1、奥德蘑野生子实体的照片；
[0037]图2、奥德蘑野生子实体的照片；
[0038]图3、奥德蘑孢子的显微照片；
[0039]图4、奥德蘑囊状体的显微照片。
【具体实施方式】
[0040]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0041]实施例1
[0042]1、野外采集
[0043]野外发现奥德蘑野生子实体后，先对其从进行拍照，拍摄清楚菌盖直径(7.0~
16.0cm),初半球形，后凸面镜形至近平展，表面光滑，湿时粘，无条纹，粉白色至粉黄色(442~5八2);菌褶宽0.4~0.6cm，稀疏，稍弯生至离生，不等长，具小菌褶，粉白色(3A2~4A2);菌柄长(9.0~22.0cm)、粗(0.5~1.5cm),中生至偏生，具菌环，初中位，后上位，基部稍膨大，非假根状，菌 柄中部具瘤状凸起，上部近亮白色，下部浅褐色至深褐色(5B3-5C4)，密披浅褐色至褐色鳞片；菌肉白色，薄，味淡。
[0044]2、外部结构鉴定
[0045]首先收集世界上查找世界上所有发表和报道的奥德蘑种类134个记录；
[0046]2)根据采集到的奥德蘑子实体外部形态:菌盖7.0~16.0cm,凸面镜形,表面光滑，湿时粘，粉白色至粉黄色。菌褶宽0.4~0.6cm,稍弯生至离生，粉白色；菌柄0.5~
1.5X9.0~22.0cm,中生至偏生，具菌环，上部近亮白色，下部浅褐色至深褐色，密披浅褐色至褐色鳞片。
[0047]初步确定属于膨蝴菌科Physalacriceae奥德薦属Oudemansiella Speg.。
[0048](3)微观结构鉴定
[0049]取奥德蘑菌褶少许，放入事先滴定好5%K0H溶液的载玻片上，待菌褶充分溶解还原后，盖上盖玻片，放于放大400倍的显微镜下观察，观察并发现担子17.2~19.6X14.7~17.0 μ m，四孢；担孢子17.2~19.6X14.7~17.0 μ m，卵圆形至宽椭圆形，光滑，无色；侧生囊状体和褶缘囊状体78.0~122.5X 14.7~51.5 μ m，长棒形。菌盖皮层菌丝为粘子实层-栅栏型排列，菌丝直径9.8~29.4 μ m ;具淡黄色色素菌丝，菌丝直径8.5μπι。菌柄皮层菌丝近平行排列，菌丝直径3.7~7.4 μ m，具黄褐色色素。子实体菌丝未发现锁状联合。观察时进行显微照片拍摄。
[0050]显微结构观察后进行野生奥德蘑种类与经过外部形态特征比对后相似的奥德蘑种类的显微结构进行比对，找到显微结构相似的种类，经进一步鉴定，属于奥德蘑属Oudemansiella Speg.中的小奥德蘑组Section Oudemansiella,与拟粘小奥德蘑基本相同。
[0051](4)分子序列鉴定
[0052]I )DNA提取:取野生子实体0.1g,采用改良的CTAB法提取总DNA，提取后的DNA测定浓度后调节至IOOng/ μ L备用；
[0053]2) PCR 扩增:选用真菌通用引物 ITSl (5，-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’)和ITS4 (5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)扩增奥德蘑核糖体 RNA 部分 18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反应体系总量20 μ L，包含有Taq酶5U、Mg2+L 5mmol/L、dNTP各 200 μ mol/L、引物各 1.0X 10-5 μ mol、模版 DNAlOOng ；PCR 反应程序 94°C预变性 5min, 30个循环中94°C 50s、51°C 50s,72°C lmin，最后72°C延伸lOmin。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统观察后，用回收试剂盒回收扩增片段。
[0054]3)PCR测序:ITS扩增片段经回收后送公司进行双向测序，测序结果经过比对拼接后确定最终序列。测定的野生奥德蘑子实体ITS序列如下。
[0055]TAATCAGTTACAGTTGTCTCAGTCAAGAAGACGGTTCGAAGCGGTCGCAAAAACCTTTCACAGAGTCGCATAGGTATCTCTCCAGAGGAGAGAACACAAAGGGAGCCGTGAGGCAAACCCTTCAAACACCCGAGCTCTGCCAACACTCTGAACCAAGCTAGCTTAGATATTATCACAGCTTAGCGTAGCCCAAGTAATGGTTCGTACTGCTAATGCATTTCAGAGGAGCTGAACCCATTGAAAGGTCCGGCAGGCCTCCACCATCCAACACCATTCGAACTCGAAAAACAAGTAAGAAGGGTTGAGAGTTTACTGACACTCAAACAGGCATGCCCTTCGGAATACCAAAGGGCGCAAGGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTATTAAGTTGTTTTAGAGGACGGTGAAGTCCCATAAACGAAGACATTCTAAACATGCAAGAGATGATATGAAGCATAGACCCGGAGGAAACGAAAGGAGGCGAACCTCACCTTCAACCCCAACCAGATCTACAAAAGGTGCACAGGTGGACAAAGAAGAGGCGAGCGACTTCAAAACGTGCACATACTCAAGAGTCAGCAACAGAAGTGAAGCCACAAGCGT。
[0056]ITS 序列大小:690bp。
·[0057]ITS序列分析:将测序好的序列在Genebank中进行Blast，并未发现相同或相似的奥德蘑ITS序列。
[0058]鉴定结果:结合外部形态特征、微观结构和分子序列比对的种类，综合比较，采集到的野生奥德蘑子实体为拟粘小奥德蘑Oudemansiella submucida Corner,属于奥德蘑属Oudemansiella Speg.,膨王胡菌科 Physalacriceae0
【权利要求】
1.一种野生奥德蘑鉴定方法，包括下列步骤: (1)野外采集 先对从野外采集的野生奥德蘑子实体进行拍照，拍摄清楚菌盖、菌柄、菌环和菌褶以及子实体周围的生境；照片拍摄后采集奥德蘑野生子实体，测量并记录其外部形态特征，并进行菌种分离； (2)外部形态鉴定 将步骤(1)采集到的野生奥德蘑子实体的外部形态特征和现有的奥德蘑子实体的外部形态特征进行比对，找出相似种类； (3)微观结构鉴定 将步骤(1)得到的奥德蘑野生子实体进行显微结构观察，然后将野生奥德蘑与步骤(2)得到的相似种类的奥德蘑的显微结构进行比对，找到显微结构相似的种类； (4)分子序列鉴定 1)DNA提取:提取总DNA，测定浓度后调节至IOOng/μ L备用； 2)PCR扩增:选用真菌通用引物ITSl和ITS4扩增奥德蘑核糖体RNA部分18S、ITSU5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反应体系总量20 μ L，包含有Taq酶5U、Mg2+ 1.5mmol/L、dNTP 各 200μ mol/L、引物各 1.0X 10-5 μ mol、模版 DNAlOOng ；PCR 反应程序 94°C 预变性5min，30 个循环中 94°C 5 0s、51°C 50s,72°C lmin，最后 72°C延伸 IOmin ; 3)PCR测序:经ITS扩增片段进行双向测序，测序结果经过比对拼接后确定最终序列； 4)ITS序列分析:将测序好的序列在Genebank中进行Blast比对； (5)综合鉴定:综合外部形态特征、微观结构和分子序列比对的种类，综合比较，准确确定野生奥德蘑的种类。
2.根据权利要求1所述的一种野生奥德蘑鉴定方法，其特征在于:将步骤(1)中所采集到的奥德蘑野生子实体放入固定的器具中以免损坏。
3.根据权利要求1所述的一种野生奥德蘑鉴定方法，其特征在于:步骤(1)中所示的测量并记录其外部形态特征包括:测量菌盖直径、菌柄长度和直径，与比色卡进行比对并记录菌盖、菌柄、菌褶颜色及形状，记录其味道和气味。
4.根据权利要求1所述的一种野生奥德蘑鉴定方法，其特征在于:步骤(3)中所述的显微结构观察的具体操作为:选取步骤(1)得到的奥德蘑野生子实体的菌褶少许，放入事先配置好的滴定有5%K0H溶液的载玻片上，待菌褶充分溶解还原后，盖上盖玻片，置于放大400倍的显微镜下观察，观察孢子、担子、囊状体、菌丝等显微结构的特征，并测量其大小，同时进行显微照片拍摄。
5.根据权利要求1所述的一种野生奥德蘑鉴定方法，其特征在于:步骤(4)中所述的提取总DNA的方法为采用改良的CTAB法提取总DNA，包括: 1)将_20°C冷冻干燥的野生奥德蘑子实体0.1g研磨成粉末，加入65°C预热的2XCTAB抽提液，65°C保温45min以上，间或轻摇混匀； 2)12000rpm, 4°C离心 20min,取上清液； 3)加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液，其中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1，轻轻混匀lOmin，12000rpm，4°C离心lOmin，取上清液移入新离心管中； 4)加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，其中的氯仿、异戊醇的体积比为24:1，轻轻混匀lOmin, 12000rpm,4°C离心lOmin,取上清液移入新离心管中； 5)加入2/3体积的_20°C预冷的异丙醇,轻轻摇动5min,8000rpm,4°C离心IOmin,去上清； 6)将沉淀依次用体积百分数为75%的乙醇、lOmmol/L醋酸钾各洗涤2~3次，每次8000rpm,室温离心 5min ； 7)加入预冷的体积百分数为95%的乙醇,轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心IOmin,弃乙醇，真空抽干或自然晾干； 8)加入IOOuL10XTE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解； 9)加入IuL 10mg/mL RNaseA 37°C水浴，Ihr，去除 RNA,即得 DNA 提取物。
6.根据权利要求1所述的一种野生奥德蘑鉴定方法，其特征在于:步骤(4)中所述的真菌通用引物 ITSl 为:5，-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G_3’，ITS4 为 5，-TCC TCC GCT TATTGA TAT GC-3，。
7.根据权利要求1所述的一种野生奥德蘑鉴定方法，其特征在于:步骤(4)中所述的ITS序列分析中，有相同的序列，则比对的两种奥德蘑种类相同。
8.根据权利要求1所述的一种野生奥德蘑鉴定方法，其特征在于:步骤(4)中所述的ITS序列分析中，序列相似 度低于98%或找不到对应的序列，则为两个不同的奥德蘑种类。
【文档编号】C12Q1/68GK103667478SQ201310654406
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】李传华, 黄建春, 谭琦, 尚晓冬, 张劲松, 鲍大鹏 申请人:上海市农业科学院