1.本发明涉及具有高抗微生物活性的合成融合蛋白的制备和用途。本发明的目的蛋白可用于各种领域：2.——在环境消毒中，本发明的目的蛋白可用于制备消毒液，该消毒液可用于诊所、医院和家庭领域，用于人流量大的环境，用于进气和排气系统或空调或atu处理单元的过滤器，用于制备食品的环境。一般来说，可用于所有需要采取抗微生物预防措施的领域。3.——在医学、兽医或化妆品领域中，单独使用或作为基质用于抗细菌、抗真菌、抗病毒制剂或对抗支原体感染和植原体感染，通过气雾剂，用于局部、皮肤或粘膜使用。作为漱口水、牙膏和护肤霜的成分使用。4.——在农业和植物制药领域中，根据本发明的蛋白可以出于相同的目的，用于对抗植物物种中的感染，既可以直接使用，也可以通过农杆菌渗入(agro-infiltration)技术使用。
背景技术：
：：5.许多细菌和许多病毒的攻击机制的相同之处在于目标生物结构，这些目标生物结构由具有结构功能的蛋白构成，位于质膜内部以赋予其机械抗性。在两个物种之间的生化反应相互作用结束时，获得的渗透最终通过裂解导致细胞壁的破坏。这种生化作用证明是共同的特征，其需要植物界中存在的一类酶的单一保守机制的作用：多聚半乳糖醛酸酶，其能够通过细菌和真菌典型的内切糖苷酶(纤维素酶)分裂纤维素两个杂环之间的键，对受侵染的植物组织具有裂解作用。[0006][0007]然而，在其他情况下，尤其是关于病毒攻击方面，生物结构的融合允许病毒的遗传物质传播到真核细胞中，该融合通过刺突(spikes)通过与膜受体结合使遗传物质引入而发生。这两种感染机制均需要与允许病原体进入植物真核细胞或植物细胞的不同特性的表面蛋白相互作用。[0008]多聚半乳糖醛酸酶(pg)是纤维素酶，它们是属于糖基化酶类的蛋白，可催化水解反应：pg在果实成熟过程中起着至关重要的作用。[0009]在成熟过程中，原果胶在果胶酯酶的作用下降解为果胶酸。随后，果胶酸(半乳糖醛酸的聚合物)被pg水解并溶解，从而软化果肉。植物有机体已经发展出一种基于多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(pgip)的防御系统，能够抑制果胶酯酶反应(jaillono,etal.nature,2007sep27.pmid17721507)。[0010]在各种类别的pgip中，有一种pgip具有降解活性，其由一系列重复的亮氨酸构成，这些亮氨酸形成所谓的“亮氨酸拉链(leucinezipper)”，该pgip识别果胶酯酶并通过在接触时释放过氧化氢来降解它们。释放的离子物质(h++o22-)，与复合体的外部结构紧密接触，开始氧化和还原，以转移和获取原子的外层电子，糖蛋白组分与上述两种离子物质接触。此类富含亮氨酸的重复序列(lrr)由2-45个长度为20-30个氨基酸的基序组成，通常为弓弧形或马蹄形[1]。[0011]lrr可以在真核生物病毒的蛋白中发现，这似乎为蛋白-蛋白相互作用的形成提供了结构框架[2,3]。[0012]lrr蛋白组的分析序列表明存在不同的lrr，产生许多亚家族。这种分类的意义在于，在植物门中不同亚家族的重复从来不会同时发生，而且很可能是独立进化的。然而，现在清楚的是所有主要的lrr类别都具有弯曲的马蹄形结构，在凹侧上具有平行的β片层，而在凸侧上主要为螺旋元件。[0013]已鉴定出至少6个以不同长度和重复共有序列为特征的lrr蛋白家族。[0014]lrr的11个残基的片段(lxxlxlxxn/cxl)，对应于β链和相邻的环区域，在lrr蛋白中是保守的，而重复的其余部分(此处定义为变量)可能非常不同。某些类别pgip的形状由氨基酸的线性序列与“环”中的两半形成，以形成马蹄状蛋白。[0015]凹面和相邻的环是lrr蛋白上最常见的蛋白相互作用表面。一些蛋白-配体lrr复合体的3d结构表明，lrr结构域的凹面是与α-螺旋相互作用的理想表面，从而支持了早期的结论，即细长和弯曲的lrr结构为实现多种蛋白-蛋白相互作用提供了出色的框架[2]。[0016]分子计算模型的预测表明，比之前提出的lxxlxlxxn/cxl更短的保守模型lxxlxl，足以使具有20-30个重复残基的蛋白具有独特的马蹄形曲率[5]。[0017]以上提到的具有防御功能的pgip亚家族分为两个类别：位于细胞质中的或锚定在细菌膜上的。后者具有肉豆蔻酸部分，允许其锚定在细胞膜上，并因此使其直接与真菌细菌和病毒典型的外源葡聚糖和/或肽-葡聚糖结构接触。这种接触触发了氧化还原反应，破坏这些结构的键，从而破坏侵染的微生物[6]。[0018]糖基转移酶是催化糖部分从活化的供体分子转移到特定受体分子，形成糖苷键的酶。基于底物和反应产物的立体化学，糖基转移酶可分为保留酶或反转酶[“酶促糖基转移的催化机制”，sinnott,ml(1990)catalyticmechanismsofenzymaticglycosyltransfer.chem.rev.90,1171-1202]。来自莲花(nelumbonucifera5e9u_a)的糖基转移酶(一种称为gtf1的还原酶)具有进行二糖、寡糖和多糖生物合成的通用功能。[0019]冠状病毒是在1960年代发现的一类病毒，最初被描述为能够引起普通感冒的病毒。[0020]sarscov-2具体为sars相关冠状病毒/sars-cov种的病毒，属于冠状病毒科，具有由约30kb的单链rna螺旋组成的病毒基因组。病毒体有四种结构蛋白，称为：蛋白s(刺突)、e(包膜)、m(膜)和n(核衣壳)；sars-cov-2刺突蛋白是负责冠状病毒进入宿主细胞的糖蛋白，由两个功能亚基s1和s2亚基组成。s1亚基由n端结构域(ntd)和受体结合结构域(rbd)组成。s1亚基的功能是与宿主细胞上的受体结合。s2亚基的功能是融合病毒与宿主细胞的膜。s1和s2亚基边界处的切割位点称为蛋白酶的s1/s2切割位点。[0021]这种糖-蛋白复合体开始与细胞受体融合，然后建立融合键，最终导致遗传物质传播至真核细胞内，随后发生病毒的衣壳破坏和逆转录。[0022]鉴于经济重要性，多年来已经开发了许多能够抵抗上述微生物攻击的产品。[0023]迫切需要新的方法来对抗这些类型的感染，这些感染在管理传播危险方面越来越成问题。目前能够在环境中遏制细菌和/或病毒负载传播的防菌产品中，使用的是腐蚀性很强的化学物质，例如：na+hclo-(次氯酸钠)、苯扎氯铵，或者使用戊二醛或某些物质(例如包含0.1％至0.5％活性游离氯的某些种类的酸)。[0024]然而，这些具有氧化还原活性的化学物质的寿命很短，因为它们与大气中的氧气o2结合，很快会变为惰性。[0025]例如次氯酸盐：[0026][0027]其惰性化反应如上。[0028]如果没有需要还原的生物结构，则会很快发生以上反应，因此必须重复各种类型的消毒过程，包括重复喷洒各种类型的表面。同样，任何需要高密度人群并可能发生区域传染的活动，如果具有用于空气分配的液压系统，则必须用每小时输送处理数千立方米的设备，再次进行有条理和全面系统的消毒。技术实现要素：[0029]本发明的主题是用于抵抗病原微生物(例如革兰氏阳性、支原体、植原体、微型真菌)和病毒(例如sars-cov-2，冠状病毒科)的攻击和增殖的生物学方法。[0030]事实上，本发明的主题为合成蛋白，该合成蛋白利用编码来自葡萄(vitisvinifera)的多聚半乳糖醛酸酶抑制剂和来自莲花(nelumbonucifera5e9u_a)的糖基转移酶(gtf1还原酶)活性亚基的基因序列来制备，令人惊讶地，由于其酶活性，该合成蛋白已被证明能通过在细菌/病毒的糖苷表面上产生粘附现象来增强还原作用。[0031]因此，本发明的主题是由具有seqidno.3的序列编码和具有seqidno.4的氨基酸序列的合成融合蛋白。[0032]seqidno.3的核苷酸序列和/或与seqidno.3具有至少90％，更优选95％序列同一性的序列；[0033]本发明还涉及具有seqidno.4的氨基酸序列的蛋白和/或具有与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的序列的蛋白。[0034]本发明还涉及由具有seqidno.3的序列编码和具有seqidno.4序列的合成融合蛋白用于医学领域。[0035]具体是在医学、兽医或化妆品领域中，单独使用或作为基质用于抗病毒、抗真菌、抗细菌制剂或对抗支原体感染和植原体感染，通过气雾剂，用于局部、皮肤或粘膜使用。作为漱口水、牙膏和护肤霜的成分使用。[0036]本发明还涉及制备和纯化由具有seqidno.3的序列编码和具有seqidno.4序列的合成融合蛋白的方法。[0037]所述方法包括以下基本步骤：[0038]i.在包括选择标记的表达载体中，插入包括以下至少一项的核酸：seqidno.3的序列，与seqidno.3具有至少90％序列同一性的序列和与seqidno.3具有至少95％同一性的序列；[0039]ii.使用所述载体转化适合使用所述载体的感受态细胞；[0040]iii.筛选所述载体转化的感受态细胞，并在培养基中增殖；[0041]iv.对第iii点的感受态细胞进行裂解；[0042]v.从第iv点获得的裂解物中筛选和纯化根据本发明的蛋白。[0043]本发明还涉及由具有seqidno.3的序列编码和具有seqidno.4序列的合成融合蛋白用于处理植物物种感染，优选地用于农业和植物制药领域；根据本发明的蛋白出于相同的目的，既可以直接使用，也可以通过农杆菌(a.tumefaciens)渗入技术使用。[0044]本发明还涉及用于处理植物病原体(优选为植原体和真菌)的方法，其中所述方法包括在植物或其部分上应用根据本发明的蛋白或包括该蛋白的组合物。[0045]由具有seqidno.3的序列编码和具有seqidno.4序列的合成融合蛋白用于处理环境和表面的用途也是本发明的目的。本发明的目的合成融合蛋白可用于制备消毒剂溶液，该消毒剂溶液可用于诊所、医院和家庭领域，用于人流量大的环境，用于进气和排气系统或空调或atu的过滤器，用于制备食物的环境。[0046]一般来说，可用于所有需要采取抗微生物预防措施的领域。[0047]本发明还涉及用于从环境或表面控制或消除病毒、革兰氏阳性细菌、支原体、植原体、微型孢子和卵孢子真菌，优选金黄色葡萄球菌(s.aureus)和sars-cov-2的方法，其中该方法包括在表面或其部分上应用根据本发明的蛋白或包括该蛋白的组合物。[0048]本发明还涉及破坏包括在病毒、革兰氏阳性细菌、支原体和微型孢子和卵孢子真菌中的糖蛋白的方法。[0049]本发明还涉及包括不同浓度的所述蛋白的组合物，该组合物构成抗微生物溶液，可以作为用于局部、皮肤或鼻腔粘液的抗细菌/抗真菌制剂的基质，用于人类和动物的环境消毒的各个领域。[0050]进一步的目的和优点将通过本发明的详细描述变得明显。附图说明[0051]图1：根据本发明的表达载体的实施例。椭圆形突出显示的是编码酶的限制性位置，用于插入pgip-gtf1目的序列。具体地，以在毕赤酵母(pichiapastoris)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)中表达的载体作为代表。[0052]图2：来自莲花(nelumbonucifera)的gtf1的结构。突出显示了融合蛋白中选择和插入的亚基。[0053]图3：图a的聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶(gelsdspage)显示在纯化柱上分离后纯化蛋白的存在。[0054]图b：免疫-反式印迹，抗组氨酸标签(his-tag)以突出显示融合蛋白正确克隆的存在和水平。通过免疫印迹技术的检测，突出显示的条带表明存在组氨酸尾与pgip+gtf1融合复合体结合。[0055]对于两图：1.蛋白电泳分子量标准(marker)；2.对照+白蛋白；3.电泳缓冲液阴性对照；4.超声处理的细胞沉淀；5.用组氨酸标签柱纯化的测试样品；6.marker。[0056]图4：pgip+gtf1的杀灭细菌/杀灭病毒的效力水平，表明在显微镜下观察到的48h和72h的效果。[0057]图a：在光学显微镜下的视图：金黄色葡萄球菌(s.aureus)与融合蛋白接触48h后不存在，与蛋白接触时释放的过氧化物气泡和生物结构。[0058]图b：在光学显微镜下的视图：由于生物识别作用和h2o2的释放，在72h时生物结构裂解。[0059]图c：在光学显微镜下的视图：在时间0点的金黄色葡萄球菌培养物。[0060]图5：免疫印迹试验，检测与pgip+gtf1ad接触1h、24h、48h后，与pgip+gtf1接触后的sarscov2刺突蛋白。[0061]图a不含蛋白酶抑制剂，[0062]图b含蛋白酶抑制剂。[0063]对于两图：m蛋白电泳分子量标准(marker)；1.sarscov2刺突蛋白；2.缓冲液；3.16μlseqidno.4的蛋白；4.10μlseqidno.4的pgip/gtf1蛋白；5.缓冲液；6.sars-cov2刺突蛋白；7.sars-cov2刺突蛋白+seqidno.4的pgip/gtf1蛋白；8.sars-cov2刺突蛋白；9.sars-cov2刺突蛋白+seqidno.4的pgip/gtf1蛋白；10.sars-cov2刺突蛋白；11.sars-cov2刺突蛋白+seqidno.4的pgip/gtf1蛋白。[0064]图6：a、b、c、d图显示了农杆菌粘附实验，其中在已被葡萄生单轴霉(viticulturalplasmopara)污染的葡萄叶表面上喷洒根据本发明的经纯化的分子量为62kda的pgip/gtf1蛋白(4ml，包含400μg蛋白，混合有0.0005％非离子叶面粘附剂)，分别在：[0065]图a：时间0点；[0066]图b：接触后10h；[0067]图c：接触后24h；[0068]图d：接触后48h。[0069]图7：根据本发明的pgip/gtf1融合蛋白的结构。[0070]图8：曲霉(aspergillus)，与400μg粗提物接触，图8a为接触48h后，图8b为接触72h后，与对照图8c进行比较。[0071]图9：pri201an的载体图谱，突出显示了两个多克隆位点mcs1和mcs2，由于cam35s病毒启动子和noster终止子的存在，这种类型的载体允许相同的pgip+gtf1基因的双重超表达。[0072]图10：a.叶组织上的灰霉病菌(b.cinerea)感染。b.通过经载体pri201an修饰的农杆菌渗入10h后阻断感染的效果，农杆菌在损伤处传播，开始合成pgip+gtf1。[0073]图11：细胞培养72h条件下进行细胞毒性试验的光学显微镜照片，图a：人卵巢癌a2780细胞，图b：双相间皮瘤msto-211h细胞。对于两组实验：对照(包含完全培养基)；对照+缓冲液；1nm蛋白溶液；2.5nm蛋白溶液；5nm蛋白溶液；10nm蛋白溶液；20nm蛋白溶液。具体实施方式[0074]本发明涉及合成的融合蛋白，称为pgip+gtf1或pgip/gtf1，由具有seqidno.3的序列编码和具有seqidno.4的氨基酸序列，该合成融合蛋白利用编码以下的基因序列来产生：[0075]——来自葡萄(vitisvinifera)的多聚半乳糖醛酸酶抑制剂，和[0076]——来自莲花(nelumbonucifera5e9u_a)的糖基转移酶(gtf1还原酶)活性亚基，[0077]由于其酶活性，该合成融合蛋白令人惊讶地能够通过在细菌/病毒糖苷表面上产生粘附现象来增强还原效果。[0078]因此，本发明的目的是用于抵抗病毒、革兰氏阳性细菌、支原体和微型孢子和卵孢子真菌的攻击和增殖的生物学方法。基因序列是经过多次配对研究后筛选的，比较并根据其内在特征进行选择；具体而言，pgip序列是根据wo2019/077477中描述的内容而选择的，而gtf1亚基是由发明人根据其高酶活性选择的。[0079]文献表明，根据本发明选择的gtf1糖基转移酶(还原酶)亚基也能够识别属于seca复合体(革兰氏阳性细菌的分泌复合体)的细菌蛋白(微生物学和免疫学的最新话题，章节：革兰氏阳性细菌中蛋白和糖的输出和组装，currenttopicsinmicrobiologyandimmunologychapt.proteinandsugarexportandassemblyingrampositivebacteriaed.springerpag45-67)，由于该亚基的识别作用以及结合至该seca复合体，并通过对其粘附的上述糖蛋白复合体进行裂解作用，所以该亚基的存在提高了整个融合蛋白复合体的效率。[0080]seqidno.1：来自葡萄(vitisvinifera)的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白pgip的序列。gagtctggtggagaattcgaattcgaattcatggagacttcaaaactttttcttctctcctcctctctcctcctagtcttactcgccactcgtccatgtccttctctctctgaacgttgcaacccaaaagacaaaaaagttctccttcaaatcaaaaaagccctagacaatccctacattctagcttcgtggaatcccaacaccgattgctgcggatggtactgcgtcgaatgtgacctcaccacccaccgcatcaactcgctcaccatcttctccggccagctatccggccagattcccgacgctgttggtgaccttccgttcctcgagaccctcatcttccgcaagctctctaacctcaccggtcagatcccgccggcgattgccaaactcaagcacctaaaaatggttcgccttagctggaccaacctctccggtcccgtgccggcgttcttcagcgagcttaagaacctcacgtacctcgacctctccttcaataacctatctggacccattcccggcagcctctctctcctccccaacctcggcgcactccatctcgaccggaaccacctcacaggcccaatccctgactccttcggaaaattcgccggctctaccccaggtctacacctctcacacaaccaactttccgggaaaatcccatattctttcagaggattcgaccccaatgtcatggacttatcgcgtaacaagcttgagggtgacctgtcaatattcttcaatgccaataagtcaacacagatcgttgacttctcacggaacttgttccagtttgatctttcgagagtggaattcccgaagagtttgacgtcgttggacctttcgcataacaagatcgccgggagcctgccggagatgatgacttctctggatttacagttcctgaacgtgagttacaatcgtttgtgtggtaagattccggtgggtgggaagttgcagagcttcgattacgactcctactttcacaatcggtgcttgtgtggtgctccactccagagctgcaagggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgagtctggtggaagttcttttgattttatggatggttatgataagcctgtgaaagggagaaaaatcaattggatgaaagccggcatattagaatcagacagg。[0081]seqidno.2：来自莲花(nelumbonucifera)的颗粒结合型淀粉合成酶gtf1的序列aagttcttttgattttattgatggttatgataagcctgtgaaagggagaaaaatcaattggatgaaagccggcatattagaatcagacagggtgttaactgtcagtccatactatgcagaagaacttgcttcaggcatagaaaaaggtgtggaactagataacataattcggaagactggcattactggtattgtgaatggcacagatgttcaggagtggaacccaaccacagacaaatatatcagtgttaaatatgatgctacaactgttatggatgcaaagcctcttctaaaggaagcacttcaatctgaagttgggttgcctgtggaccgaaatatccctgtaataggctttattggtagactcgaagagcagaaaggttcagatattcttgcagcatcaattcccaaattcattggagagaatgttcagataattgtcctcgggaccggtaaaaaggcctttgagaagcaacttgagcaactagagatcaaatatcctgacaaagccagaggagttgcaaaattcaatgttcctcttgcccatatgatcatagctggagctgactttctgctgatcccaagtagatttgaaccatgtggtcttattcagttaca。[0082]seqidno.3：根据本发明的pgip+gtf1融合蛋白的核苷酸序列gagtctggtggagaattcgaattcgaattcatggagacttcaaaactttttcttctctcctcctctctcctcctagtcttactcgccactcgtccatgtccttctctctctgaacgttgcaacccaaaagacaaaaaagttctccttcaaatcaaaaaagccctagacaatccctacattctagcttcgtggaatcccaacaccgattgctgcggatggtactgcgtcgaatgtgacctcaccacccaccgcatcaactcgctcaccatcttctccggccagctatccggccagattcccgacgctgttggtgaccttccgttcctcgagaccctcatcttccgcaagctctctaacctcaccggtcagatcccgccggcgattgccaaactcaagcacctaaaaatggttcgccttagctggaccaacctctccggtcccgtgccggcgttcttcagcgagcttaagaacctcacgtacctcgacctctccttcaataacctatctggacccattcccggcagcctctctctcctccccaacctcggcgcactccatctcgaccggaaccacctcacaggcccaatccctgactccttcggaaaattcgccggctctaccccaggtctacacctctcacacaaccaactttccgggaaaatcccatattctttcagaggattcgaccccaatgtcatggacttatcgcgtaacaagcttgagggtgacctgtcaatattcttcaatgccaataagtcaacacagatcgttgacttctcacggaacttgttccagtttgatctttcgagagtggaattcccgaagagtttgacgtcgttggacctttcgcataacaagatcgccgggagcctgccggagatgatgacttctctggatttacagttcctgaacgtgagttacaatcgtttgtgtggtaagattccggtgggtgggaagttgcagagcttcgattacgactcctactttcacaatcggtgcttgtgtggtgctccactccagagctgcaagggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgagtctggtggaagttcttttgattttatggatggttatgataagcctgtgaaagggagaaaaatcaattggatgaaagccggcatattagaatcagacagggtgttaactgtcagtccatactatgcagaagaacttgtttcaggcatagaaaaaggtgtggaactagataacgtaattcggaagactggcattactggtattgtgaatggcacggatgttcaggagtggaacccaaccacagacaaatatatcagtgttaaatatgatgctacaactgttatggatgcaaagcctcttctaaaggaagcacttcaagcagaagtcgggttgcctgtggaccgaaatatccctgtaataggctttattggtagactcgaagagcagaaaggttcagatattctcgcagcatcaattcccaaattcattggagagaatgttcagataattgtcctcgggaccggtaaaaaggcctttgagaagcaacttgagcaactagagatcaaatatcctgacaaagccagaggagttgcaaaattcaatgttcctcttgcccatatgatcatagctggagctgactttctgctgatcccaagtagatttgaaccatgtggtctcattcaattacatcaccaccatcatcattgatgaggtacc。[0083]seqidno.4：根据本发明的融合蛋白的氨基酸序列[0084]esggefefefmetsklfllssslllvllatrpcpslsercnpkdkkvllqikkaldnpyilaswnpntdccgwycvecdltthrinsltifsgqlsgqipdavgdlpfletlifrklsnltgqippaiaklkhlkmvrlswtnlsgpvpaffselknltyldlsfnnlsgpipgslsllpnlgalhldrnhltgpipdsfgkfagstpglhlshnqlsgkipysfrgfdpnvmdlsrnklegdlsiffnankstqivdfsrnlfqfdlsrvefpksltsldlshnkiagslpemmtsldlqflnvsynrlcgkipvggklqsfdydsyfhnrclcgaplqsckggggsggggsggggsesggssfdfmdgydkpvkgrkinwmkagilesdrvltvspyyaeelvsgiekgveldnvirktgitgivngtdvqewnpttdkyisvkydattvmdakpllkealqaevglpvdrnipvigfigrleeqkgsdilaasipkfigenvqiivlgtgkkafekqleqleikypdkargvakfnvplahmiiagadfllipsrfepcgliqlhhhhhhgt。[0085]根据本发明的序列在任何情况下均报告在所附的序列表中。[0086]因此，seqidno.3的核苷酸序列和/或与seqidno.3具有至少90％，更优选95％序列同一性的序列；[0087]本发明还涉及具有seqidno.4的氨基酸序列和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的序列的蛋白。[0088]本发明还涉及由具有seqidno.3的序列编码和具有seqidno.4的氨基酸序列的合成融合蛋白。[0089]本发明还涉及根据本发明的合成融合蛋白的制备和纯化方法。[0090]所述方法包括以下基本步骤：[0091]i.在包括选择标记的表达载体中，插入包括以下至少一项的核酸：seqidno.3的序列，与seqidno.3具有至少90％序列同一性的序列和与seqidno.3具有至少95％同一性的序列；[0092]ii.使用所述载体转化适合使用所述载体的感受态细胞；[0093]iii.筛选所述载体转化的感受态细胞，并在培养基中增殖；[0094]iv.对第iii点的感受态细胞进行裂解；[0095]v.从第iv点获得的裂解物中筛选和纯化根据本发明的蛋白。[0096]在一个实施例中，为了获得表达并能够纯化根据本发明的蛋白，将具有seqidno.3的序列克隆至用于在细菌或酵母中表达的载体中。[0097]根据本发明的适用载体是本领域技术人员已知的，在优选的实施例中优选使用pbe-sdna，其次是载体pgapza-a(分别由宝生物公司takara和赛默飞世尔公司thermofisher销售)。[0098]本领域技术人员已知的各种启动子可用于促进根据本发明的序列的转录。在优选的实施例中，使用枯草芽孢杆菌(b.subtilis)分泌蛋白表达系统(takara公司)。[0099]根据本发明的蛋白可以在适用于该目的并且为本领域技术人员已知的各种细菌和酵母中制备，在优选的实施例中，根据本发明的蛋白在枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或毕赤酵母(pichiapastoris)中制备(creggetal.,1985；creggetal.,1989；clareetal.,1991a；clareetal.,1991b；romanosetal.,1991)，在蛋白的转录过程中，蛋白的糖基化导致其天然形式或其高糖基化形式，增加了其代谢能力。在毕赤酵母中，蛋白翻译后在5个位点处高糖基化，其分子量从62kda至200kda不等。在枯草芽孢杆菌中，高糖基化使蛋白的分子量达到120kda。这种高糖基化可以在纯化程序中去除。在一个实施例中，例如使用枯草芽孢杆菌分泌蛋白表达系统(takara公司)，为了便于纯化，使用6个组氨酸残基的标签序列(组氨酸标签，his-tag)。然而，本领域技术人员已知的其他标签类型也适用于根据本发明的目的。为了获得根据本发明的蛋白，所应用的方法如下：[0100]1)从葡萄(vitisvinifera)和莲花(nelumbonucifera)中提取rna；[0101]2)rt-pcr用于扩增seqidno.1和2的基因部分，优选使用包括被限制酶识别的序列的修饰引物进行(gibson法)，以便为扩增后的产物提供用于后续消化的所需序列；[0102]3)扩增后，对pcr产物进行纯化，进行第一次消化以连接两个片段，随后进行连接酶反应，目的是获得包括seqidno.3的片段。[0103]4)将第3)点中获得的连接酶产物纯化，并通过插入载体进行第二次消化，优选插入载体pbe-sdna，其次插入载体pgapza-a，因其专有地在不含蛋白酶的细菌和酵母中高表达的能力而被明确选择。[0104]5)包括seqidno.3序列的载体用于转化适于该目的的感受态细胞。感受态细胞优选为毕赤酵母或枯草芽孢杆菌。转化优选通过电穿孔进行，也不排除化学转化。[0105]6)筛选转化细胞，优选使用抗生素，并在本领域技术人员已知的合适培养基中增殖。lb/ypd分别优选用于枯草芽孢杆菌和毕赤酵母。[0106]7)基于微生物选择足够的培养时间，优选24h-48h，裂解细胞以提取总蛋白，并优选在亲和柱上进行目的蛋白的纯化。[0107]任选地，将从纯化步骤获得的产物包封在脂质中，优选包封在磷脂中，以促进其扩散和防止自氧化，从而延长在表面上的停留时间，并有利于与微生物结构的亲和力。[0108]任选地，将从纯化步骤或从包封步骤获得的产物进行冷冻干燥。在本发明的上下文中，粗提物是指经过离心和超声处理但未在亲和柱上纯化的细胞裂解物。[0109]在一个实施例中，毕赤酵母和枯草芽孢杆菌的工程化通过电穿孔或通过转化能接受质粒的感受态细菌(化学方法)来实现。[0110]在一个实施例中，所述pgip+gtf1的编码序列克隆在具有根据本发明的质粒的表达结构的5'-3'“框架内(inframe)”中。[0111]在可选的实施例中，将在第3)点中获得的连接产物插入适用于农杆菌(a.tumefaciens)的载体中，该载体随后用于电穿孔转化；优选地，该载体是具有两个多克隆位点的载体pri-201an(takara公司)，因此提供了具有双表达pgip-gtf1能力的载体，而纯化后的载体在非致瘤细菌农杆菌a.tumefacienslb4404(takara公司)中进行电穿孔转化。[0112]为了验证根据本发明蛋白的正确制备，感受态细菌用包括seqidno.3表达盒的载体转化，能够制备根据本发明的蛋白且被6个组氨酸标签标记，转化后的细菌在足够的培养时间后裂解。在冰上以》20kh的频率通过5min的超声处理进行机械裂解，其后裂解物进入咪唑梯度纯化柱直至咪唑达到100mm，在第一次洗脱后分离得到蛋白复合体。[0113]在sd-page凝胶上电泳不同的样品。在图3中，具体可以观察到超声处理细胞的上清液、浓度为100μg/μl的超声处理细胞沉淀(或粗提物)(泳道4)与阳性对照白蛋白(泳道2，具有能用5μg/μl抗组氨酸标签抗体检测的特性)以及纯化的蛋白(泳道5)的电泳情况。在电泳结束时，对凝胶进行蛋白印迹法，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。将膜与抗组氨酸标签一级抗体和用过氧化物酶标记的二级抗体一起孵育，以在增强型化学发光(ecl)中检测蛋白。在图3a(着色凝胶)中，可以观察到泳道5中存在条带，突出显示了存在分子量为62kda(pgip/gtf1的非糖基化形式)的明确和过表达的纯化产物。在图3b中，免疫印迹显示泳道4(未经纯化的超声处理细胞沉淀)中存在分子量为200kda的过表达的高度糖基化蛋白；在泳道5b中检测到63kda的非糖基化形式的纯化蛋白。[0114]该实验证明了存在融合蛋白，并且能被很好地表征，从此可以使用。为了验证根据本发明的蛋白对抗或杀灭以上提到的微生物的功效，设置了各种实验，其中蛋白在各种纯化和非纯化条件下与代表性细菌、真菌、植原体，以及由sarscov-2产生的刺突蛋白进行接触。[0115]金黄色葡萄球菌(s.aureus)[0116]图4显示了以下实验：将浓度为1μg的粗提物添加到浓度为1000个细菌/ml的金黄色葡萄球菌亚种(atcc6538p)细菌培养物中，在48和72h观察可能的杀灭生物作用。[0117]本实验的目的是观察可能的抗细菌作用。从图4所示的照片中可以看出，与初始培养物(以图c中时间0点表示)相比，观察到细菌体逐渐被破坏，以及随着产生h++和o22-而产生的微小气泡。具体地，图4a显示了与蛋白粗提物接触48h后金黄色葡萄球菌凝固酶阳性培养物的光学显微镜照片，图4b展示了接触72h后相同培养物的照片。[0118]可以看出，微生物的浓度降低了80％，以及观察到裂解反应产生的气泡增加。因此，由于pgip+gtf1提供的还原作用，平板的表面完全不存在或几乎不存在革兰氏阳性细菌。[0119]曲霉(aspergillus)[0120]图8显示了以下实验：将粗提物添加到曲霉(attc16404)培养物中，并在接触72h后观察可能的杀灭真菌作用。图8c显示了在时间零点带有菌丝的微观伞菌照片。图8a显示了在与粗提物接触72h后整个菌丝的裂解效果，图8b中显示了相对的放大图。实验证明了未纯化的粗融合蛋白具有真菌杀灭作用。[0121]sars-cov-2[0122]为了验证根据本发明的蛋白对抗病毒的有效性，设置了以下实验(图5)：其中将根据本发明的蛋白与sars-cov-2产生的刺突蛋白接触。[0123]根据本发明的蛋白与或不与pmsf和e-64蛋白酶抑制剂(分别为丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)一起进行纯化、提取；加入10mmmgcl2(镁作为共酶活化剂起作用)的两种提取物与sars-cov2的刺突蛋白混合物(艾博抗公司，abcam)以5:1的比例接触；根据本发明的蛋白以1μg/μl的最终浓度存在。[0124]在1、24、48h后观察这种接触的结果，以及相关的作用。[0125]图5a和5b显示在sds-page凝胶电泳后进行的蛋白印迹。将膜与抗刺突抗体一起孵育。图5a显示了不含蛋白酶抑制剂进行的实验结果，图5b显示了含蛋白酶抑制剂进行的实验结果。[0126]在泳道6至11中，可以观察到在不同接触时间的实验进展。在图5a中，在由箭头指示的最后一个泳道(11)中，注意到在48h时相对于相应的对照(10)不存在刺突。另一方面，在图5b中，重复相同的实验，但含蛋白酶抑制剂，可以观察到刺突蛋白的数量减少。[0127]箭头指示在1h、24h和48h时条带强度已经降低。该实验表明，62kda非糖基化形式的纯化蛋白具有显著的抗病毒特性。[0128]该实验的结果表明，在1h时蛋白裂解开始对covid-19刺突有轻微作用，证明了该蛋白在1μg/μl的浓度下已经具有杀灭病毒的活性。[0129]细胞毒性实验[0130]为了了解这种融合蛋白的生物学用途是否可能不会对人类细胞造成损害，进行了生物相容性测试以验证根据本发明的蛋白可能的细胞毒性，并了解其优化使用浓度。[0131]使用了两种细胞系来进行实验：人卵巢癌细胞系a2780和肺间皮瘤细胞系msto-211h。将各自培养基中的细胞保持在37℃湿润气氛的培养箱中，使用无菌层流罩进行操作，并在平板中孵育细胞48和72h。[0132]评估两种溶液的细胞毒性：[0133]a)包含不同标量浓度的融合蛋白的溶液(储备溶液的浓度等于1.9nm)和[0134]b)仅包含融合蛋白溶液的缓冲液的溶液。[0135]将每孔25,000-30,000个细胞(用于72h试验)或每孔50,000个细胞(用于48h试验)与5种不同浓度(从1nm至20nm)的蛋白接触，以获得数据的高斯分布。决定使用永生化细胞系是因为它们更稳定，因此反应更灵敏，并且不会遭受源自皮肤的细胞系所遭受的细胞衰变。[0136]如果在本实验中采用非永生化细胞系，正常细胞衰变会导致错误计数，将不得不通过反对数因子进行补偿，与稳定的细胞系相比，这将导致计算不正确。[0137]由于本实验中使用的纯化蛋白来自于imac纯化柱上的纯化过程，在从10至100mm的咪唑梯度中进行纯化，以及来自随后在异硫氰酸胍中的变性步骤，为了表征其性质，该蛋白已经经过纯化过程，该纯化过程通过具有两种不同渗透压(由两种不同的内部/外部渗透压产生)的纯化缓冲液的透析盒进行，这种内部/外部浓度差异导致盐通过纯化从融合蛋白的位点被提取出来。该溶液也用作对照以获得考虑到透析垫的测试结果。获得的结果计算为相对于对照条件的存活率百分比(对于20nm的条件，存活率值还根据对照+缓冲液的条件计算，并用*表示)，如下表所显示：[0138]表1：[0139][0140]*相对于对照+缓冲液的条件(视为100％)计算的值[0141]表2：[0142][0143]*相对于对照+缓冲液的条件(视为100％)计算的值[0144]这些实验的结果也显示在图11中，其中可以观察到对于两种细胞系(具体地，图a为a2780和图b为msto-211h)，使用不同蛋白浓度在72h时的细胞活力。[0145]关于在表1(a2780)中获得的结果，该实验对两种不同的永生化细胞系计算的截止值考虑为50％。已经表明，除去由缓冲液造成的截止值，a2780细胞系的平均存活率显示在5nm的蛋白浓度下，平均细胞存活率在48和72h之间只有8％的差异，而在10nm的浓度下，平均存活率增加了8％。证明了在5nm和10nm之间的浓度下，除去截止值，蛋白的毒性与细胞是相容的。[0146]在msto-211h细胞系中，注意到在5nm和10nm的浓度下存在趋势逆转，在48h存活率增加19％，而在72h恢复正常。在这种情况下，两种蛋白浓度对该细胞系没有毒性，参见表2(msto-211h)。[0147]在表1、2中，在最大浓度20nm下显示了最大毒性，它们通过与截止值50％进行比较来进行补偿，其中在表2中，显示死亡率为11％，通过截止值50％进行补偿，细胞存活率维持在89％。[0148]在表1中也是相同情况，在20nm的浓度下，同样减少了11％，该数据也是根据对照细胞对照+缓冲液的截止值进行补偿得到的。[0149]因此可以得出结论，根据本发明的融合蛋白在体外对人类细胞培养物没有表现出相关的细胞毒性作用。[0150]农杆菌粘附和对支原体/植原体和寄生真菌的作用[0151]支原体是一类完全没有细胞壁的微生物。由于这一特性，它们对青霉素和所有作用于细胞壁生物合成过程的抗生素(例如头孢菌素)完全免疫。它们的细胞膜也发生了进化，以补偿肽聚糖壁的缺失：事实上，它的组成非常特殊，与其他微生物不同；尤其是它富含甾醇(在细菌物种中的独特情况)，这使它们能够保持细胞体积恒定和抵抗水分胁迫。支原体可对人类、动物和植物致病；不论其物种，植物的致病性支原体通常被植物学家和农业学家分为两大类：螺原体(螺旋形，可体外培养)和植原体(形状可变，是完全专性寄生生物，不可体外培养)；在任何情况下，两者都是柔膜菌纲(mollicutes)，因此具有以上列出的所有特征，以及其他一些典型的特征。[0152]为了验证pigp+gtf1蛋白在对抗支原体感染或侵染方面的有效性，直接在叶上使用如上定义的毕赤酵母粗提取混合物，其包含pgip+1gtf1蛋白和浓度为0.005％-0.0025％的非离子增粘剂(聚-1-对薄荷烯、乙醇酸提取物、异癸醇乙氧基化物)。具体地，七甲基三硅氧烷改性的聚环氧烷以0.005％的稀释度使用；所述载体已被证明对于将以垂直方向散播的分子锚定在植物表面上令人惊讶地有效。[0153]图6abcd中的照片描述了对葡萄叶上的霜霉菌(葡萄生单轴霉，plasmoparaviticola)感染的阻断作用，通过用上述浓度的叶面粘附剂浸泡不同时间，这种处理使得蛋白能够散播开来。该测试的目的不仅证明了该蛋白在农业中的有效性，而且还证明了其对支原体，尤其是葡萄生单轴霉侵染的作用[0154]在图6中，实际上可以观察到pgip+gtf1在叶上粘附的渐进作用。在图a中，可以观察到在时间0点处的叶。在10h内，与根据本发明的蛋白接触如是消除葡萄生单轴霉在叶表面的扩散和生长(可在图6b中观察到)；随着时间的推移，可以在24h(图c)和48h后(图d)观察到其巩固的阻断效果。该实验证明了在单次处理后，pgip+gtf1复合体抗害菌作用的渐进有效性。[0155]该实验证明了植原体(与支原体完全相似的微生物)如何在接触数小时后被有效阻断。[0156]因此，根据本发明的蛋白已被证明具有抗微生物功效，即，它能够抑制细菌、真菌、病毒以及支原体和植原体的生长。[0157]在另一个实施例中，通过喷洒或通过使用无针注射器在叶的细胞间隙中使用农杆菌悬浮液的农杆菌浸入方法；事实上，已经表明使用这种方法可以获得良好的瞬时基因表达水平(santos-rosaetal.2008；zottinietal.,2008；bertazzonetal.2011.)。[0158]具体地，将根据本发明的seqidno.3的片段插入适用于农杆菌(a.tumefaciens)的载体中，该载体随后用于电穿孔；优选地，该载体是具有两个多克隆位点的载体pri-201an(takara公司)，因此提供了具有双表达pgip-gtf1能力的载体，而纯化后的载体在非致瘤细菌农杆菌a.tumefacienslb4404(takara公司)中进行电穿孔转化。[0159]随后将由此获得的农杆菌直接在叶组织上使用，优选将稀释产物(400μg)与浓度为0.0005％的非离子胶溶液一起制成悬浮液，然后喷洒在叶上。在图10a中，我们看到叶被灰霉病菌(botrytiscinerea)感染，灰霉病菌是一种核盘菌科(sclerotiniaceae)的真菌，在时间零点时刚刚农杆菌渗入，在图10b中显示了农杆菌渗入10h后阻断感染的作用。在最后一张照片中，我们可以看到感染如何迅速被阻止和限制。[0160]因此，本发明的目的是组合物，其包括表达载体转化的农杆菌，和至少一种非离子增粘剂或胶(优选为0.0005％)，该表达载体包括具有以下序列的核酸：seqidno.3的序列，或与seqidno.3具有至少90％序列同一性的序列，或与seqidno.3具有至少95％同一性的序列。[0161]因此，根据本发明的蛋白可以定义为抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂和消毒剂。[0162]更具体地，本发明因此涉及根据本发明的蛋白在用于各种领域的抗微生物制剂中的用途。[0163]医学和兽医领域[0164]具体地，考虑到其在细胞毒性实验中证明的安全性，本发明的目的是具有seqidno.4的氨基酸序列的蛋白和/或具有与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的序列的蛋白用于医学领域。本发明的另一个目的是所述蛋白用作由其抗微生物功能定义的医药产品，即抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗真菌剂。根据本发明的蛋白可以用于配制为液体形式的组合物，作为乳霜或洗剂或作为凝胶或喷雾剂用于动物和人类的局部应用。局部应用包括在皮肤和粘膜上的应用。载体可以是所有用于制药和化妆品领域的载体。佐剂和载体是化妆品和药学上可接受的，以及用于植物制药领域的佐剂和载体。[0165]载体包括脂质载体，优选单层和多层脂质体；在优选的实施例中，根据本发明的蛋白实际上被包装或包封在所述结构中以允许更有效地递送至处理部位，更好地扩散和防止自氧化，从而延长在表面上的停留时间，以及促进与微生物结构的亲和力。[0166]根据本发明的蛋白优选局部、皮肤和/或口咽-鼻施用，并且可以配制成喷雾剂、用于吸入的气雾剂、凝胶、乳霜和洗剂。因此，本发明的目的是包括具有seqidno.4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白的组合物；任选地，所述组合物包括以下至少一种：盐缓冲液(优选pbs)、蛋白酶抑制剂、mgcl2、药学上可接受的赋形剂、载体、增稠剂和胶凝剂。在优选的实施例中，根据本发明的组合物还包括纤维素，优选甲基纤维素。包括根据本发明的蛋白的组合物也可以配制成喷雾剂、半液体、霜状、半固体或固体形式、膏状、悬浮液、乳液或肥皂。[0167]根据本发明的组合物也可以由微生物的裂解物构成，该微生物表达具有seqidno.4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白。[0168]环境消毒剂[0169]附图中所示的体外实验结果显示根据本发明的蛋白对各种微生物，具体为革兰氏阳性细菌、真菌、支原体和病毒具有显著的抗微生物活性。[0170]因此，具有seqidno.4的氨基酸序列和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的氨基酸序列的蛋白可用作人类、动物和植物领域中的环境消毒剂和抗微生物剂。根据本发明的蛋白可以单独使用或包括在组合物中使用，该组合物还包括本领域技术人员已知的载体，并且可以通过喷雾应用，以凝胶形式配制或以溶液形式应用。因此，包括根据本发明的蛋白的组合物可以配制成喷雾、半液体、半固体、固体、悬浮液或凝胶形式，以应用于待处理的表面上。应用形式也可以是喷雾。该组合物也可以在各种区域的消毒领域中用作抗微生物的功能基质，例如用于诊所、医院和家庭领域，用于人流量大的环境，用于进气和排气系统或空调或atu处理单元的过滤器，用于制备食物的环境。一般来说，可用于所有需要采取抗微生物预防措施的领域。作为非限制性实例，包括根据本发明的蛋白的组合物可以在家庭卫生产品中用作消毒剂；用于皮肤消毒剂，用于肥皂等，例如用于完整皮肤的消毒，例如在术前阶段用于手部消毒；用于医院病房，防止院内交叉感染的传播；用于消毒剂或社区卫生产品(例如酒店、机场、学校、医生诊所或牙科诊所)；用于手术器械的消毒。[0171]包括根据本发明的蛋白的组合物还可以包括以下至少一种：盐缓冲液(优选pbs)、蛋白酶抑制剂、mgcl2、纤维素和甲基纤维素、胶凝剂(优选甲基环氧乙烷或海藻酸盐，例如海藻酸钙或海藻酸钠)。因此，本发明的目的是从环境或表面控制或消除以下微生物的方法：病毒、革兰氏阳性细菌、支原体、植原体、微型孢子和卵孢子真菌，优选金黄色葡萄球菌和sars-cov-2，其中该方法包括在表面或其部分上应用以下至少一项：毕赤酵母或枯草芽孢杆菌的微生物裂解物，该微生物表达具有seqidno4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白；具有seqidno.4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白；包括所述蛋白的组合物。根据所进行的测试，根据本发明的蛋白在室温下可在表面上抵抗48-72h。[0172]农业技术[0173]附图中所示的体外实验结果显示根据本发明的蛋白对各种微生物，具体为革兰氏阳性细菌、真菌、支原体和病毒具有显著的抗微生物活性。具体地，在植物病原微生物的对抗中，发现根据本发明的蛋白具有相当大的活性。因此，本发明的主题是合成的融合蛋白用于处理植物物种的感染，优选用于农业和植物制药领域，该合成融合蛋白具有seqidno.4的氨基酸序列和/或具有与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的氨基酸序列；根据本发明的蛋白出于相同的目的，既可以直接使用，也可以通过农杆菌渗入技术使用。[0174]该蛋白可用于配制液体形式或冻干形式的组合物。[0175]该应用可以用组合物来进行，该组合物包括通常用于植物应用的载体。[0176]在一个实施例中，优选使用非离子胶，其具有浸渍植物叶组织以允许某些农药渗透的功能，在这种情况下，它已用于使表达pgip+gtf1蛋白的毕赤酵母的粗提物和蛋白本身均能扎根于叶中。佐剂和载体是药学上可接受的，如同在植物制药领域中使用的佐剂和载体。[0177]载体包括单层和多层脂质体。包括根据本发明的蛋白的组合物也可以配制成液体、半液体或凝胶形式以应用于待处理的植物。应用形式也可以是喷雾。在一个实施例中，根据本发明的蛋白包括在组合物中，该组合物还包括浓度范围为0.0005％至0.00025％的非离子增粘剂。在非离子增粘剂中，优选聚-1-对薄荷烯、乙醇提取物、异癸醇乙氧基化物，甚至更优选七甲基三硅氧烷改性的聚环氧烷，优选浓度为0.0005％。[0178]包括根据本发明的蛋白的组合物还可以包括以下至少一种：盐缓冲液(优选pbs)、蛋白酶抑制剂、mgcl2、纤维素和甲基纤维素、胶凝剂(优选甲基环氧乙烷或海藻酸盐，例如海藻酸钙或海藻酸钠)。根据本发明的组合物也可以由微生物的裂解物构成，该微生物表达具有seqidno.4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白。因此，包括根据本发明的蛋白的组合物可以凭借其抗微生物的功能在农业领域中使用，以及用于处理栽培植物或观赏植物的植物病害。因此，本发明的目的是用于处理植物病原体的方法，其中所述方法包括在植物或其部分上应用以下至少一项：毕赤酵母或枯草芽孢杆菌的微生物裂解物，该微生物表达具有seqidno4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白；具有seqidno.4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白；包括所述蛋白的组合物。根据所进行的测试，根据本发明的蛋白在室温下可在表面上抵抗48-72h。在可选的实施例中，根据本发明的蛋白可以用于农杆菌的感染技术。因此，本发明的目的是用于处理植物病原体的方法，其中所述方法包括在所述植物中通过农杆菌渗入法引入表达载体，该表达载体包括seqidno.3的核苷酸序列和/或与seqidno.3具有至少90％，更优选95％序列同一性的序列。提供以下实施例的目的只是为了说明本发明，而不能认为对其范围进行限制。[0179]方案和实施例：[0180]pbe-sdna和pgapzalphaapr1201-an载体的克隆：[0181]1)轻轻混合新鲜的感受态细胞，将100μl转移至聚丙烯管中。[0182]2)将≤10ng的量加入到100μl的pr101-an细胞中。[0183]3)在冰浴中孵育30min。[0184]4)在+42℃下孵育43s。[0185]5)放回冰浴中1-2min。[0186]6)加入soc培养基至最终体积为1ml，在+37℃下预孵育。[0187]7)在+37℃下以160-225rpm振荡孵育1h。[0188]9)涂布于选择培养基的平板上，对于每个9cm直径的平板，通常少于100μl。[0189]10)在+37℃下孵育过夜。[0190]11)通过在lb平板中+37℃下孵育过夜来选择克隆并进行扩增，质粒具有卡那霉素/氨苄青霉素的特异性抗性，lb平板具有相应的选择性抗生素。[0191]克隆后质粒的纯化(初级和次级)[0192]液体离心后，将250μl裂解溶液和350μl中和溶液混合后，将250μl重悬液加入到细胞沉淀中，然后以14,000rpm离心5min。随后，将内容物置于纯化柱中并以14,000rpm离心1min。弃去洗出液后，加入两次500μl的“洗涤溶液”。[0193]弃去洗出液后，将50μl的“洗脱缓冲液”加入柱中，并在分光光度计上计算质粒纯度的浓度，将其保存于20℃。[0194]pbe-s质粒dnapgapzalphaa的酶切[0195]酶消化和线性化的多重反应。[0196]最终体积为20μl，混合：[0197]缓冲液10pgip+gtf12μlpbe-sdna/pgapzalphaada，用量范围为0.2至1μg；[0198]限制性内切酶如下：[0199]1μlkpni；[0200]1μlxbai；[0201]无核酸酶水qb。[0202]反应根据本领域专家已知的方案进行。[0203]pr201-an中的酶切和线性化[0204]酶消化和线性化的多重反应。最终体积为20μl：[0205]混合缓冲液10pgip+gtf12μldnaprpbe-sdna/pgapzalphaada，用量范围为0.2至1μg；[0206]限制性内切酶如下：[0207]1μlxbai；[0208]1μlndei；[0209]无核酸酶水qb。[0210]产物的连接[0211]最终体积为20μl，混合以下物质：[0212]如上的线性化pgip+gtf1复合体基因dna，插入的dna量为10至100ng，与使用的dnadel载体相比，摩尔比为过量的3:1，所有物质在室温下放置1h。[0213]可选方法：使用“infusionhdcloning”(takara公司)mastermix试剂盒，将15μl的daligare产品插入，pgip+gtf1与载体的比例始终为3:1，加入无核酸酶水至最终体积为20μl。所有物质在+50℃下保持15min。所有物质整体插入e.colistellarodh5α细胞中进行再克隆。[0214]质粒纯化[0215]1)向细胞沉淀中加入250μl重悬液(jetplasmidthermofishergene)。[0216]2)加入250μl裂解溶液。[0217]3)加入350μl中和溶液。[0218]4)以14,000rpm离心5min。[0219]5)回收上清液，在纯化柱中加入500μl上清液。[0220]6)以14.000rpm离心5min。[0221]7)加入500μl洗涤缓冲液以洗涤柱，以14.000rpm离心1min，重复两次。[0222]8)加入50μl重悬液，并以14.000rpm离心2min。纯化的质粒储存于-20℃。[0223]枯草芽孢杆菌/毕赤酵母、农杆菌的电穿孔[0224]1.将包含pigp+gtf1感受态细胞和电感受态枯草芽孢杆菌/毕赤酵母的1.5ml管置于冰上。对于毕赤酵母，电穿孔后，质粒pgapzalphaa用avrii(限制性内切酶)在+37℃下放置15min进行线性化，体积为20μl。[0225]2.将6μl(1ng)二元载体质粒dna加入到20μl毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和农杆菌的感受态细胞中，轻轻混合。[0226]3.将0.1cm电穿孔比色皿置于冰上。[0227]4.将genepulserii设置为25μf、200ω和2-2.5kv。*1[0228]5.将步骤2中制备的细胞和dna转移到电穿孔和电穿孔比色皿中。[0229]6.从穿孔器中取出比色皿，加入1mlsoc*2培养基并转移至14ml圆底管中。[0230]7.在30℃下以100rpm振荡孵育1h。[0231]8.在含50μg/ml卡那霉素/10μg博莱霉素(取决于载体)的lb琼脂板*3上涂布50-100μl细胞，并在30℃下孵育至48h。[0232]9.在+30℃/+37℃(取决于载体)下，在含卡那霉素/10μg博莱霉素的液体lb中扩增克隆。[0233]免疫印迹[0234]为了验证pgip+gtf1蛋白的产生及其产生位点，在组氨酸标签(his-tag)亲和柱上纯化后，对经修饰的细菌的细胞团进行超声处理，证明了该蛋白存在于细胞内，测量其光谱-光度计浓度，在纯化过程的洗脱中达到1μg/μl。his-tag阳性对照(例如白蛋白)和阴性对照，分别由10μl上样缓冲液和电泳缓冲液组成，分别加入10μl至孔n.2和孔3中。将粗提物置于孔n.4中。孔n.5中的纯化蛋白的浓度评估为1μg/μl。随后，通过电泳图3a和通过免疫印迹3b进行表征。与2μl上样缓冲液(4％sds，10％2-巯基乙醇，20％甘油，0.004％溴酚蓝，0.125mtris-hclph6.8)混合后，将10μl提取物与阴性孔和阳性对照一起上样至5-10％丙烯酰胺梯度的预制凝胶(法玛西亚公司，pharmacia)的孔中，而电泳缓冲液由25mmtris、190mm甘氨酸、0.1％sds组成。电泳后，凝胶通过浸入染料溶液(625mm考马斯亮蓝；50％甲醇；10％乙酸)30min进行固定和着色。然后，经过照相检测(图3a)后，将其用溶液(50％甲醇-10％乙酸，处理24h)脱色。蛋白印迹在电泳缓冲液中以恒定100v电泳70min，将其置于硝酸纤维素上经受380ma电流90min。为了验证电转移的结果，将膜用丽春红ponceaus染色液(sigma公司)着色，然后用双蒸水脱色直到红色完全消失。然后将膜置于100ml由1×pbs(ph7.2：80mmna2hpo4；20mmnah2po4×2h2o；100mmnacl；0.1％吐温20；8g奶粉)组成的饱和溶液中在4℃下孵育16-18h。[0235]用0.1×pbs和0.1％吐温20(sigma公司)洗涤后。在室温下，印迹运行后得到的膜在包含5ml用pbs1:5000稀释的抗组氨酸标签小鼠单克隆一级抗体(ab-cam公司)的溶液中孵育1h。然后再次洗涤，用5mlpbs-吐温20溶液洗涤六次，每次5min，并与另外5ml的1:10,000稀释的二级抗体(与过氧化物酶偶联的兔抗小鼠抗体，sigma公司)在室温下孵育1h。在用pbs-吐温20洗涤6次后，按照供应商公司的说明，用增强型化学发光(ecl)方法(安玛西亚公司，amersham)对抗体识别的蛋白进行可视化。实验证实，在孔5中存在分子量约为62kda、浓度为1μg/μl的纯化蛋白。而在孔4中，鉴定出分子量为200kda的相同的高糖基化蛋白。[0236]平板接触金黄色葡萄球菌和粗提物和任何其它细菌，在冰上以》20kh的频率超声处理2min后，将细菌裂解物离心30s。在1.5ml管中，以14,000rpm离心10s。根据考马斯亮蓝法(bradford法)，根据在595nm处的光谱读数报告粗提物的浓度，得到其浓度为400μg。用1.5ml管以1400rpm离心2min后，随后将100μl上清液置于培养皿中，并使其与之前在金黄色葡萄球菌凝固酶阳性的选择培养基上培养的菌株反应，计算粗提物的最终浓度为100μg。pgip+gtf1与金黄色葡萄球菌的接触在室温下放置48h(图4a)和72h(图4b)，在显微镜下观察载玻片上相对于时间0点接触的结果(图4c)，在细菌浓度方面有明显的差异。[0237]刺突蛋白的接触试验和相应的免疫印迹[0238]在imac组氨酸标签柱上以10-200mm的咪唑梯度纯化后，经纯化和分离的蛋白与即用型刺突蛋白(ab-cam公司)进行反应。根据bradford法，根据在595nm处的光谱读数报告纯化蛋白的浓度，得到其浓度为1μg/μl。使用图3中表征的蛋白进行实验，实验按以下方式进行：将刺突蛋白与根据本发明的蛋白以1:5的比例制成溶液。使该混合物反应1h、24h和48h。与2μl上样缓冲液(4％sds，10％2-巯基乙醇，20％甘油，0.004％溴酚蓝，0.125mtris-hclph6.8)混合后，将10μl体积的这些溶液上样至5-10％丙烯酰胺梯度的预制凝胶(pharmacia)的孔中，而电泳缓冲液由25mmtris、190mm甘氨酸、0.1％sds组成。凝胶通过浸入染料溶液(625mm考马斯亮蓝；50％甲醇；10％乙酸)30min进行固定和着色。然后，经过照相检测后，将其用溶液(50％甲醇-10％乙酸)脱色。然后将凝胶在加入50％甲醇-10％乙酸的脱色溶液中放置24h。脱色后，样品以恒定100v电泳70min，将其置于硝酸纤维素上经受380ma电流90min。为了验证电转移的结果，将膜用丽春红染色液(ponceaus，sigma公司)着色，然后用双蒸水脱色直到红色完全消失。然后将膜置于100ml由1×pbs(ph7.2：80mmna2hpo4；20mmnah2po4×2h2o；100mmnacl；0.1％吐温20；8g奶粉)组成的饱和溶液中，在4℃下孵育16-18h。用0.1×pbs和0.1％吐温20(sigma公司)洗涤后。将膜与用pbs1:5000稀释的小鼠抗刺突标签一级单克隆抗体(ab-cam公司)在室温下孵育1h。然后再次洗涤，用pbs-吐温20溶液洗涤六次，每次5min，并与1:10,000稀释的二级抗体(与过氧化物酶偶联的兔抗小鼠抗体，sigma公司)在室温下孵育1h。在用pbs-吐温20洗涤6次后，按照供应商公司的说明，用ecl方法(amersham公司)对抗体识别的蛋白进行可视化。[0239]生物相容性实验[0240]使用的材料：[0241]a2780细胞(人卵巢癌)在补充有10％胎牛血清(gibco品牌)的rpmi-1640培养基(sigmaaldrichr6504)中培养。msto-211h(人双相间皮瘤)细胞在补充有2.38g/l羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)、0.11g/l丙酮酸钠、2.5g/l葡萄糖和10％胎牛血清的rpmi-1640培养基(sigmaaldrichr6504)中培养。[0242]将细胞保持在37℃湿润气氛的培养箱中，并使用无菌层流罩进行操作。评估两种溶液的细胞毒性：[0243]a)蛋白溶液(储备溶液的浓度等于1.9微摩尔)和[0244]b)仅包含上述蛋白溶液的缓冲液的溶液。[0245]实验方案：[0246]在以下实验条件下将细胞接种在p24胸板的完全培养基中：[0247]》25,000-30,000个细胞/孔，用于72h的测定[0248]》50,000个细胞/孔，用于48h的测定。[0249]接种24h后，去除耗尽的培养基，并根据以下方案处理细胞，一式两份：oflowerandhighereukaryotestophleomycinresistance.nucleicacidsres.18,4009.[0261]evan,gi,lewis,gk,ramsay,g.,andbishop,vm(1985)isolationofmonoclonalantibodiesspecificforc-mycproto-oncogeneproduct.mol.cell.biol.5,3610-3616.[0262]gatignol,a.,durand,h.,andtiraby,g.(1988)bleomycinresistanceconferredbyadrug-bindingprotein.febletters230,171-175.[0263]gietz,rd,andschiestl,rh(1996)inmethodsinmolecularandcellularbiology,inpresshenikoff,s.,andcohen,eh(1984)sequencesresponsiblefortranscriptionterminationonagenesegmentinsaccharomycescerevisiae.mol.cell.biol.4,1515-1520.[0264]irniger,s.,egli,cm,andbraus,gh(1991)differentclassesofpolyadenylationsitesintheyeastsaccharomycescerevisiae.mol.cell.bio.11,3060-3069.[0265]kozak,m.(1987)ananalysisofsequencesfrom699vertebratemessengerrnas.nucleicacidsres.15,8125-8148.[0266]kozak,m.(1990)downstreamsecondarystructurefacilitatesrecognitionofinitiatorcodonsbyeukaryoticribosomes.proc.natl.acad.sci.usa87,8301-8305.[0267]kozak,m.(1991)ananalysisofvertebratemrnasequences:intimationsoftranslationalcontrol.j.cellbiology115,887-903.[0268]mulsant,p.,tiraby,g.,kallerhoff,j.,andperret,j.(1988)phleomycinresistanceasadominantselectablemarkerinchocells.somat.cellmol.genet.14,243-252.[0269]perez,p.,tiraby,g.,kallerhoff,j.,andperret,j.(1989)phleomycinresistanceasadominantselectablemarkerforplantcelltransformation.plantmol.biol.13,365-373.[0270]sambrook,j.,fritsch,ef,andmaniatis,t.(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,seconded.,coldspringharborlaboratorypress,plainview,newyorkscorer,ca,buckholz,rg,clare,jj,andromanos,ma(1993)theintracellularproductionandsecretionofhiv-1envelopeproteininthemethylotrophicyeastpichiapastoris.gene136,111-119.[0271]waterham,hr,digan,me,koutz,pj,lair,sv,andcregg,jm(1997)isolationofthepichiapastorisglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenasegeneandregulationanduseofitspromoter.gene186,37-44.[0272]zaret,ks,andsherman,f.(1984)mutationallyalteredendsofyeastcyc1mrnaaffecttranscriptstabilityandtranslationalefficiency.j.mol.biol.177,107-136.[0273]thilanthanbienetal.j.gen.appl.microb.175-182(2014).当前第1页12当前第1页12