生产5-甲基叶酸盐的微生物的制作方法

本发明涉及生物技术工程领域，具体地涉及生产5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)(5-甲基-thf)的微生物，及其制备和用途。更具体地，本发明提供了一种产生5-甲基叶酸盐的微生物(如产生5-甲基叶酸盐的细菌)，该微生物a)已被修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，参与5-甲基叶酸盐生物合成的至少一种酶(例如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种酶)的表达水平增加；b)已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的内源多肽的表达和/或活性降低；c)已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的内源多肽的表达和/或活性降低；和/或d)已被(进一步)修饰以表达仅具有二氢叶酸合成酶活性的异源多肽。

背景技术：

1、叶酸盐是叶酸及其一些衍生物的统称；它们在氧化状态、蝶啶环的一个碳取代以及γ连接的谷氨酸残基数量上有所不同(如图1所示)。叶酸盐的蝶呤部分可以以三种氧化状态存在，即完全氧化的(叶酸)、或还原的7,8-二氢叶酸盐(dhf)、或5,6,7,8-四氢叶酸盐(thf)。thf是维生素的辅酶活性形式，它接受、转移和捐赠c1基团，c1基团要么连接在n5或n10位置要么通过桥接这些位置。c1基团的氧化状态也有所不同，其中叶酸盐作为甲酸盐(5-甲酰基-thf(5-fthf或亚叶酸)、10-甲酰基-thf、5,10-甲烯基-thf和5-亚氨甲基-thf)、甲醇(5-甲基-thf；5-mthf)或甲醛(5,10-亚甲基-thf)的衍生物存在。此外，大多数天然存在的叶酸盐都以γ-连接的聚谷氨酸缀合物的形式存在。

2、叶酸(蝶酰基-l-谷氨酸)是一种合成化合物，在自然界中不存在。叶酸作为辅酶不具有活性，必须在细胞内经历多个个代谢步骤才能转化为具有代谢活性的thf形式。然而，叶酸是商业上最重要的叶酸盐化合物，通过化学合成在工业上生产。哺乳动物不能合成叶酸，只能依靠膳食补充剂来维持正常叶酸盐水平。低叶酸盐状态可能是由低膳食摄入、摄入叶酸盐吸收不良以及由于遗传缺陷或药物相互作用导致的叶酸盐代谢改变引起的。大多数国家已经通过叶酸补充剂或强化食品制定了叶酸盐的推荐摄入量。膳食补充剂中使用的叶酸盐包括叶酸、亚叶酸(5-fthf、leucovorin)或5-mthf(scaglione和panzavolta 2014)。目前生产两种5-mthf盐形式作为补充剂。默克密理博(merck millipore)生产一种5-mthf的钙盐，它是天然存在的主要叶酸盐形式的稳定晶形。gnosis s.p.a.开发了一种(6s)-5-mthf的氨基葡萄糖盐并获得专利，商标名称

3、目前，叶酸主要通过化学合成在工业上生产，而与其他维生素不同，由于当前细菌菌株生产的叶酸产量低，因此微生物生产叶酸的工业规模尚未开发(rossi等人，2016)。尽管化学生产的叶酸不是天然存在的分子，但人类能够通过二氢叶酸还原酶(dhfr)的作用将其代谢为叶酸盐的生物活性形式。有多个理由支持用微生物发酵代替化学合成方法来商业化生产叶酸盐：首先，通过微生物可以生产还原形式的叶酸，还原形式的叶酸可被人类更有效地使用。最重要的是，原则上，一步发酵工艺比多阶段化学工艺更高效且更环保。

4、先前的研究已阐明微生物中叶酸盐/叶酸的产生。大多数微生物在叶酸盐生产中的应用限于发酵乳制品的强化和产生叶酸盐的益生菌。还对培养条件进行了优化，以提高叶酸盐的合成，叶酸产量达到约150μg/g(hjortmo等人，2008；sybesma等人，2003b)。一些研究描述了乳酸菌(sybesma等人，2003a)、酵母(walkey等人，2015)或丝状真菌(serranoamatriain等人，2016)的基因修饰菌株，这些菌株能够产生滴度最高达6,6mg/l的叶酸。微生物产生叶酸盐的另一种成功方法是在对氨基苯甲酸(paba)存在下培养酵母或细菌菌株。在这些培养物的上清液中测量到最高达22mg/l的总叶酸盐含量。

5、(6s)-5-甲基四氢叶酸盐(l-5-甲基四氢叶酸盐或l-5-甲基-thf)是叶酸(维生素b9)的活性形式。叶酸(蝶酰基-l-谷氨酸)是一种合成化合物，通过化学合成在工业上生产，在新鲜的天然食品中不存在。叶酸作为辅酶不具有活性，必须在细胞内经历多个代谢步骤才能转化为具有代谢活性的叶酸盐形式。另一方面，5-甲基四氢叶酸盐是膳食叶酸盐的主要形式，也是人体叶酸盐的主要活性形式，约占人体血浆叶酸盐的98％。摄入l-5-甲基-thf可能比摄入叶酸具有多个优点，例如降低了掩盖维生素b12缺乏的血液学症状的可能性，减少药物的干扰，该药物靶向二氢叶酸盐还原酶，并且l-5-甲基-thf不会作为未代谢维生素在人体血浆中积累。

6、化学合成叶酸的工业技术受到巨大的环境负担的阻碍。到目前为止，用于生产叶酸或任何叶酸盐的天然形式如5-甲基叶酸盐的微生物发酵工艺，由于叶酸盐的生产滴度/产量非常低，因此没有竞争力。

7、因此，迫切需要开发新的基因工程化微生物来提高5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐或其前体或中间体)的生产能力。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供基因工程化微生物以增强5-甲基叶酸盐(例如，5-甲基-四氢叶酸)或其前体或中间体的生产能力。本发明人解决了这个问题。

2、可以通过以下项目来概括本发明。

3、1.一种基因工程化微生物，如细菌。

4、2.根据项目1所述的基因工程化微生物，其已被修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的内源多肽的表达和/或活性降低。

5、3.根据项目2所述的基因工程化微生物，其已被修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述多肽的内源基因的表达水平降低。

6、4.根据项目3所述的基因工程化微生物，其中与其他相同微生物相比，所述内源基因的表达水平降低了至少50％，例如降低了至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

7、5.根据项目3或项目4所述的基因工程化微生物，其中编码具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述多肽的内源基因已被失活。

8、6.根据项目5所述的基因工程化微生物，其中编码具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述多肽的内源基因已通过删除部分或全部基因序列被失活。

9、7.根据项目4或5所述的基因工程化微生物，其中编码具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述多肽的内源基因已经通过在微生物中引入或表达能够通过dna切割而选择性地失活编码所述肽的内源基因的罕见切割核酸内切酶而被失活。

10、8.根据项目7所述的基因工程化微生物，其中所述罕见切割核酸内切酶是类转录激活因子效应物(tale)核酸酶、大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(zfn)或rna引导的核酸内切酶。

11、9.根据项目8所述的基因工程化微生物，其中所述rna引导的核酸内切酶是催化失活的cas9蛋白。

12、10.根据项目13所述的基因工程化微生物，其包含(例如，表达)在细胞条件下与编码所述多肽的基因组dna特异性杂交(例如结合)的单一引导rna(sgrna)。

13、11.根据项目2所述的基因工程化微生物，其中通过编码所述多肽的内源基因的转录和/或翻译抑制，降低(例如，抑制)具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述内源多肽的表达。

14、12.根据项目2所述的基因工程化微生物，其中通过在微生物中引入或表达在细胞条件下与编码所述多肽的细胞mrna和/或基因组dna特异性杂交(例如结合)的抑制性核酸分子，降低(例如抑制)具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述内源多肽的表达。

15、13.根据项目12所述的基因工程化微生物，其中所述抑制性核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰rna(rnai)分子。

16、14.根据项目13所述的基因工程化微生物，其中所述干扰rna分子是微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)或短发夹rna(shrna)。

17、15.根据项目2或3所述的基因工程化微生物，其已被修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的内源多肽的活性降低。

18、16.根据项目15所述的基因工程化微生物，其中通过至少一种导致活性降低或丧失的活性位点突变降低所述多肽的活性。

19、17.根据项目16所述的基因工程化微生物，其中所述至少一个活性位点突变位于对应于与seq id no:11中所示的氨基酸序列中的位置51-54、75、114-117、145、152-154、172、263、302和315中的任一项的位置。

20、18.根据项目16或17所述的基因工程化微生物，其中所述至少一个活性位点突变是非保守氨基酸替换。

21、19.根据项目2至18中任一项所述的基因工程化微生物，其中编码具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述多肽的内源基因是基因folc。

22、20.根据项目2至18中任一项所述的基因工程化微生物，其中编码具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述多肽的内源基因是内源基因folc。

23、21.根据项目2至20中任一项所述的基因工程化微生物，其中编码具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述多肽的内源基因包括与seq id no:5所示的核酸序列具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。

24、22.根据项目2至21中任一项所述的基因工程化微生物，其中通过内源基因编码的具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的所述多肽包括与seq id no:11所示的氨基酸序列具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸。

25、23.根据项目1至22中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为表达仅具有二氢叶酸合成酶活性的异源多肽。

26、24.根据项目23所述的基因工程化微生物，其中所述仅具有二氢叶酸合成酶活性的异源多肽衍生自细菌或真菌，优选选自罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)和棉阿舒囊霉(ashbya gossypii)。

27、24.根据项目23或24所述的基因工程化微生物，其中所述仅具有二氢叶酸合成酶活性的异源多肽包括与seq id no:22或23具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

28、25.根据项目1至24中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有显著提高的5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)或其前体或中间体的生产能力。

29、26.根据项目25所述的基因工程化微生物，其中与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)或其前体或中间体的生产能力增加了至少50％，例如至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少2000％、至少5000％、至少10000％、至少20000％或至少50000％。

30、27.根据项目1至26中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的至少一种基因(例如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种基因)的表达水平增加。

31、28.根据项目1至27中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的至少两种基因(例如至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种基因)的表达水平增加。

32、29.根据项目1至28中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码参与5-甲基叶酸盐的生物合成的酶的至少三种基因(例如至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种基因)的表达水平增加。

33、30.根据项目1至29中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的至少四种基因(例如至少五种、至少六种、至少七种或至少八种基因)的表达水平增加。

34、31.根据项目1至30中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的至少五种基因(例如至少六种、至少七种或至少八种基因)的表达水平增加。

35、32.根据项目1至31中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的至少六种基因(例如至少七种或至少八种基因)的表达水平增加。

36、33.根据项目1至32中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的至少七种基因(例如至少八种基因)的表达水平增加。

37、34.根据项目27至33中任一项所述的基因工程化微生物，其中所述至少一种编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的基因选自由以下组成的组：fole/mtra、folb、folk、folp/sul、fola/dfra、glya、puru、yitj和metf。

38、35.根据项目27至34中任一项所述的基因工程化微生物，其中参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基-四氢叶酸盐)的生物合成的酶选自由以下组成的组：具有gtp环化水解酶活性的多肽、具有7,8-二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽、具有2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽、具有二氢蝶酸合成酶活性的多肽、具有二氢叶酸还原酶活性的多肽、具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽、具有甲酰四氢叶酸脱甲酰酶活性的多肽和具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性的多肽。

39、36.根据项目1至34中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有gtp环化水解酶活性的多肽的基因的表达水平增加。

40、37.根据项目1至36中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有7,8-二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽的基因的表达水平增加。

41、38.根据项目1至37中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽的基因的表达水平增加。

42、39.根据项目1至38中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有二氢蝶酸合成酶活性的多肽的多肽的基因的表达水平增加。

43、40.根据项目1至39中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有二氢叶酸还原酶活性的多肽的基因的表达水平增加。

44、41.根据项目1至40中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达水平增加。

45、42.根据项目1至41中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有甲酰四氢叶酸脱甲酰酶活性的多肽的基因的表达水平增加。

46、43.根据项目1至42中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性的多肽的基因的表达水平增加。

47、44.根据项目27至43中任一项所述的基因工程化微生物，其中所述编码参与5-甲基叶酸盐(例如，5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的至少一种基因与所述基因工程化微生物异源。

48、45.根据项目27至44中任一项所述的基因工程化微生物，其中所述编码参与5-甲基叶酸盐的生物合成的酶的至少一种基因衍生自细菌或真菌，优选选自芽孢杆菌属(bacillus)、大肠杆菌属(escherichia)、乳球菌属(lactococcus)、希瓦氏菌属(shewanella)、弧菌属(vibrio)和阿舒氏菌属(ashbya)。

49、46.根据项目27至45中任一项所述的基因工程化微生物，其中所述编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的至少一种基因衍生自选自枯草芽孢杆菌(bacillus subtiltis)、乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis)、大肠杆菌(escherichia coli)、堇色希瓦氏菌(shewanella violacea)、需钠弧菌(vibrionatriegens)或棉阿舒囊霉(ashbya gossypii)的细菌或真菌。

50、47.根据项目27至46中任一项所述的基因工程化微生物，其中与其他相同微生物(参考微生物)相比，编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的至少一种基因(例如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种基因)的表达水平增加了至少50％，至少100、至少200％、至少500％、至少1000％、至少2000％、至少5000％、至少10000％、至少20000％或至少50000％。

51、48.根据项目1至47中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少一种酶(例如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种)的表达水平增加。

52、49.根据项目1至47中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少两种酶(例如至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种)的表达水平增加。

53、50.根据项目1至47中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少三种酶(例如至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种)的表达水平增加。

54、51.根据项目1至47中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少四种酶(例如至少五种、至少六种、至少七种或至少八种)的表达水平增加。

55、52.根据项目1至47中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少五种酶(例如至少六种、至少七种或至少八种)的表达水平增加。

56、53.根据项目1至47中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少六种酶(例如至少七种或至少八种)的表达水平增加。

57、54.根据项目1至47中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少七种酶(例如至少八种)的表达水平增加。

58、55.根据项目48至54中任一项所述的基因工程化微生物，其中参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基-四氢叶酸盐)的生物合成的所述至少一种酶选自由以下组成的组：具有gtp环化水解酶活性的多肽、具有7,8-二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽、具有2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽、具有二氢蝶酸合成酶活性的多肽、具有二氢叶酸还原酶活性的多肽、具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽、具有甲酰四氢叶酸脱甲酰酶活性的多肽和具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性的多肽。

59、56.根据项目1至55中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有gtp环化水解酶活性的多肽的表达水平增加。

60、57.根据项目1至56中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有7,8-二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽的表达水平增加。

61、58.根据项目1至57中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽的表达水平增加。

62、59.根据项目1至58中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有二氢蝶酸合成酶活性的多肽的表达水平增加。

63、60.根据项目1至59中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有二氢叶酸还原酶活性的多肽的表达水平增加。

64、61.根据项目1至60中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的表达水平增加。

65、62.根据项目1至61中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有甲酰四氢叶酸脱甲酰酶活性的多肽的表达水平增加。

66、63.根据项目1至62中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性的多肽的表达水平增加。

67、64.根据项目48至63中任一项所述的基因工程化微生物，其中所述参与5-甲基叶酸盐(例如，5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少一种酶(分别为所述多肽)与所述基因工程化微生物异源。

68、65.根据项目48至64中任一项所述的基因工程化微生物，其中所述参与5-甲基叶酸盐的生物合成的至少一种酶(分别为所述多肽)衍生自细菌或真菌，优选选自芽孢杆菌属(bacillus)、大肠杆菌属(escherichia)、乳球菌属(lactococcus)、希瓦氏菌属(shewanella)、弧菌属(vibrio)和阿舒氏菌属(ashbya)。

69、66.根据项目48至65中任一项所述的基因工程化微生物，其中所述参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少一种酶(分别为所述多肽)衍生自选自枯草芽孢杆菌(bacillus subtiltis)、乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis)、大肠杆菌(escherichia coli)、堇色希瓦氏菌(shewanella violacea)、需钠弧菌(vibrionatriegens)或棉阿舒囊霉(ashbya gossypii)的细菌或真菌。

70、67.根据项目35、36、55和56中任一项所述的基因工程化微生物，其中具有gtp环化水解酶活性的多肽包括与seq id no:7具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

71、68.根据项目35、37、55和57中任一项所述的基因工程化微生物，其中具有7,8-二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽包括与seq id no:8具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

72、69.根据项目35、38、55和58中任一项所述的基因工程化微生物，其中具有2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽包括与seq id no:9具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

73、70.根据项目35、39、55和59中任一项所述的基因工程化微生物，其中具有二氢蝶酸合成酶活性的多肽包括与seq id no:10具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

74、71.根据项目35、40、55和60中任一项所述的基因工程化微生物，其中具有二氢叶酸还原酶活性的多肽包括与seq id no:12具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

75、72.根据项目35、41、55和61中任一项所述的基因工程化微生物，其中具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽包括与seq id no:79具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

76、73.根据项目35、42、55和62中任一项所述的基因工程化微生物，其中具有甲酰四氢叶酸脱甲酰酶活性的多肽包括与seq id no:81具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

77、74.根据项目35、43、55和63中任一项所述的基因工程化微生物，其中具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性的多肽包括与seq id no:83具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

78、75.根据项目35、43、55和64中任一项所述的基因工程化微生物，其中具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性的多肽包括与seq id no:84具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

79、76.根据项目1至75中任一项所述的基因工程化微生物，其已被(进一步)修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的内源多肽的表达和/或活性降低。

80、77.根据项目76所述的基因工程化微生物，其已被修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，编码具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述多肽的内源基因的表达水平降低。

81、78.根据项目77所述的基因工程化微生物，其中与其他相同微生物相比，所述内源基因的表达水平降低了至少50％，例如降低了至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

82、79.根据项目76或77所述的基因工程化微生物，其在编码所述多肽的内源基因的调控区中包括至少一个突变，所述多肽具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性，导致表达水平降低。

83、80.根据项目76或77所述的基因工程化微生物，其中编码具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述多肽的内源基因已被失活。

84、81.根据项目76或77所述的基因工程化微生物，其中编码具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述多肽的内源基因已通过删除部分或全部基因序列被失活。

85、82.根据项目76所述的基因工程化微生物，其中编码具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述多肽的内源基因已经通过在微生物中引入或表达能够通过dna切割而选择性地失活编码所述肽的内源基因的罕见切割核酸内切酶而被失活。

86、83.根据项目82所述的基因工程化微生物，其中所述罕见切割核酸内切酶是类转录激活因子效应物(tale)核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或rna引导的核酸内切酶。

87、84.根据项目83所述的基因工程化微生物，其中所述rna引导的核酸内切酶是催化失活的cas9蛋白。

88、85.根据项目84所述的基因工程化微生物，其包含(例如，表达)在细胞条件下与编码所述多肽的基因组dna特异性杂交(例如结合)的单一引导rna(sgrna)。

89、86.根据项目76所述的基因工程化微生物，其中通过编码所述多肽的内源基因的转录和/或翻译抑制，降低(例如，抑制)具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述内源多肽的表达。

90、87.根据项目76所述的基因工程化微生物，其中通过在微生物中引入或表达在细胞条件下与编码所述多肽的细胞mrna和/或基因组dna特异性杂交(例如结合)的抑制性核酸分子，降低(例如抑制)具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述内源多肽的表达。

91、88.根据项目87所述的基因工程化微生物，其中所述抑制性核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰rna(rnai)分子。

92、89.根据项目88所述的基因工程化微生物，其中所述干扰rna分子是微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)或短发夹rna(shrna)。

93、90.根据项目76或77所述的基因工程化微生物，其已被修饰为与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述内源多肽的活性降低。

94、91.根据项目90所述的基因工程化微生物，其中通过至少一种导致活性降低或丧失的活性位点突变降低所述多肽的活性。

95、92.根据项目91所述的基因工程化微生物，其中所述至少一个活性位点突变位于对应于与seq id no:100中所示的氨基酸序列中的位置18、21、112、117、119、435-437、488、494、519-521、565、601、603、605、645、647、669、730和731中任一项的位置。

96、92.根据项目16或17所述的基因工程化微生物，其中所述至少一个活性位点突变是非保守氨基酸取代。

97、93.根据项目76至92中任一项所述的基因工程化微生物，其中编码具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述多肽的内源基因是基因mete。

98、94.根据项目76至93中任一项所述的基因工程化微生物，其中编码具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述多肽的内源基因包括与seq idno:101所示的核酸序列具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。

99、95.根据项目76至94中任一项所述的基因工程化微生物，其中通过内源基因编码的具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述多肽包括与seqid no:100所示的氨基酸序列具有至少70％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

100、96.根据项目1至95中任一项所述的基因工程化微生物，其为细菌。

101、97.根据项目1至96中任一项所述的基因工程化微生物，其为芽孢杆菌科(bacillaceae)的一种细菌。

102、98.根据项目1至97中任一项所述的基因工程化微生物，其为芽孢杆菌属(bacillus)的一种细菌。

103、99.根据项目1至98中任一项所述的基因工程化微生物，其为枯草芽胞杆菌种(bacillus subtiltis)的一种细菌。

104、100.一种用于制备叶酸盐、其前体或中间体的方法，包括i)在合适的培养条件下在培养基中培养根据项目1至99中任一项所述的基因工程化微生物，以获得含有所述叶酸盐、其前体或中间体的发酵产物；以及ii)任选地，分离和/或纯化所述叶酸盐、其前体或中间体。

105、101.根据项目100所述的方法，其中步骤i)在32至42℃范围内的培养温度下进行，优选在34至39℃范围内，更优选在36至39℃范围内，例如在约37℃下进行。

106、102.根据项目100或101所述的方法，其中步骤i)进行10至70小时范围内，优选24至60小时范围内，更优选36至50小时范围内的时间段。

107、103.根据项目100至102中任一项所述的方法，其中步骤i)在ph为6至8范围内、优选6.5至7.5范围内、更优选6.8至7.2范围内进行。

108、104.根据项目100至102中任一项所述的方法，其中所述叶酸盐是式i化合物：

109、

110、任选地为一种立体异构体的形式，优选对映异构体或非对映异构体，外消旋体的形式，或任意混合比的至少两种立体异构体(优选对映异构体和/或非对映异构体)的混合物的形式。

111、105.根据项目100至104中任一项所述的方法，其中所述叶酸盐是式ii化合物：

112、

113、任选地为一种立体异构体的形式，优选对映异构体或非对映异构体，外消旋体的形式，或任意混合比的至少两种立体异构体(优选对映异构体和/或非对映异构体)的混合物的形式。

114、106.根据项目100至105中任一项所述的方法，其中所述叶酸盐是式iia化合物：

115、

116、107.根据项目100至104中任一项所述的方法，其中所述叶酸盐是式iii化合物：

117、

118、任选地为一种立体异构体的形式，优选对映异构体或非对映异构体，外消旋体的形式，或任意混合比的至少两种立体异构体(优选对映异构体和/或非对映异构体)的混合物的形式。

119、108.根据项目100至107中任一项所述的方法，还包括在培养步骤(i)期间添加对氨基苯甲酸(paba)的步骤。

120、109.根据项目108所述的方法，其中所述对氨基苯甲酸(paba)选自由以下组成的组：对氨基苯甲酸钾、对氨基苯甲酸钠、对氨基苯甲酸甲酯、对氨基苯甲酸乙酯、对氨基苯甲酸丁酯或其组合。

121、110.根据项目100至109中任一项所述的方法，还包括使所述步骤(i)或(ii)中获得的产物经受酸性或碱性条件以进一步获得衍生物化合物。

122、111.一种制备基因工程化微生物的方法，包括以下步骤(a)至(d)中的任一步骤：

123、(a)与其他相同微生物(参考微生物)相比，增加参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的至少一种(例如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种)酶的表达水平；

124、(b)与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，降低具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的内源多肽的表达和/或活性；

125、(c)与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，降低具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的内源多肽的表达和/或活性；和/或

126、(d)表达仅具有二氢叶酸合成酶活性的异源多肽。

127、112.根据项目111所述的方法，包括以下步骤(a)至(b)中的任一步骤：

128、(a)与其他相同微生物(参考微生物)相比，增加参与5-甲基叶酸盐的生物合成的至少一种酶的表达水平；以及

129、(b)与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，降低具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的内源多肽的表达和/或活性。

130、113.根据权利要求112所述的方法，还包括以下步骤(c)和(d)：

131、(c)与不携带所述修饰的其他相同微生物(参考微生物)相比，降低具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性的内源多肽的表达和/或活性；以及

132、(d)表达仅具有二氢叶酸合成酶活性的异源多肽。

133、114.根据项目111至113中任一项所述的方法，包括以下步骤：aa)将至少一种外源核酸分子引入所述微生物，所述外源核酸分子包含编码参与5-甲基叶酸盐(例如5-甲基四氢叶酸盐)的生物合成的酶的核酸序列；bb)例如通过删除部分或全部基因序列，使编码具有5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸s-甲基转移酶活性的所述多肽的内源基因失活，或在所述内源基因的调控区中引入至少一个突变，这导致表达水平降低；cc)例如通过删除部分或全部基因序列，使编码所述多肽的内源基因失活，所述多肽在所述微生物中具有二氢叶酸合成酶活性和叶酰聚谷氨酸合成酶活性；和/或dd)将包含编码仅具有二氢叶酸合成酶活性的异源多肽的核酸序列的外源核酸分子引入所述微生物。

134、应当理解，在本发明的范围内，上述和以下描述的本发明的每个技术特征可以彼此组合以形成优选的技术方案，由于篇幅限制，这里没有明确列出。