嵌合抗原受体细胞的制作方法

发明领域本发明涉及嵌合抗原受体(car)和双特异性蛋白，尤其涉及car和双特异性蛋白的组合；涉及包含所述car并表达所述双特异性蛋白的细胞；尤其涉及使car能够靶向通常不存在于细胞的细胞表面的抗原的方法。本发明涉及包含根据本发明的细胞和/或双特异性蛋白的药物组合物及其在治疗和/或预防疾病中的用途。

背景技术：

0、发明背景

1、免疫系统在许多不同类型癌症的发生和发展中发挥着重要作用。正在开发若干不同的免疫治疗策略作为这些癌症的潜在疗法。修饰免疫系统以识别肿瘤细胞和促进抗肿瘤效应物功能的免疫治疗策略包括免疫检查点阻断、使用肿瘤浸润淋巴细胞或表达转基因t细胞受体(tcr)或car的遗传修饰t细胞的过继细胞疗法(act)。

2、将car或转基因tcr引入细胞允许通过将编码car或tcr的核酸离体引入外周血细胞(例如，外周血t细胞)生成大量对抗原特异性的细胞。

3、car是将单克隆抗体的特异性移植到细胞(例如t细胞)上的人工受体，可以通过将抗体重链(vh)和轻链(vl)的可变区连接到单独的细胞内信号链或与其他信号传导部分结合来构建。car识别出现在肿瘤细胞表面的抗原。

4、car t细胞植入患者体内，增殖并定位于疾病部位。car t细胞已显示出针对淋巴样恶性肿瘤，包括那些对标准疗法难以治疗的恶性肿瘤的活性。cart细胞的持久性保护免于复发。这些特性共同使car t细胞疗法成为极具吸引力的癌症治疗方式。

5、迄今为止，使用cd19靶向car t细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了最成功的结果，并获得了美国食品和药物管理局(fda)的商业批准。car t细胞也被证明可有效治疗难治性癌症。

6、然而，目前car t细胞的一个主要限制是它们不能靶向细胞内抗原，例如，细胞内抗原对于car的抗原结合结构域是无法接近的细胞内。这限制了car特异性靶向癌症的可能性，因为许多细胞内抗原会发生突变、融合或异常磷酸化事件，这些事件对肿瘤细胞的选择性高于对正常细胞的选择性。已知肿瘤细胞会将细胞内抗原(其中许多包含这些对肿瘤细胞具有高度选择性的突变、融合或异常磷酸化事件)泄漏到肿瘤微环境中。

7、识别细胞内抗原的一种方法是通过使用识别mhc环境中的肽的转基因tcr。例如，识别以下的tcr：来自过表达的蛋白质的肽；或包含点突变的肽；可以生成融合连接点甚至磷表位。

8、然而，转基因tcr有若干局限性。首先，必须针对不同的hla类型生成转基因tcr。临床研究中描述和测试的几乎所有转基因tcr都受到hla-a2限制。取决于人群，hla-a2流行率为40％或更低。其次，肽的呈递完全依赖于加工蛋白质和肽呈递的复杂过程。这意味着有相当大的机会破坏必要的机制。靶向多个表位并不能解决这个相关问题，因为所有肽都依赖于这些途径。使用转基因tcr靶向细胞内抗原的进一步限制是难以产生特异性，并且临床前数据不能预测由于交叉反应引起的毒性。

9、需要靶向细胞内抗原进行免疫治疗的改进方法。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明至少部分基于发明人的认识，即失调的肿瘤细胞会泄漏少量可以使用免疫疗法进行靶向的肿瘤抗原(例如细胞内肿瘤抗原)。例如，由于er/高尔基体和/或膜运输失调，肿瘤细胞可能会释放少量肿瘤抗原。这些肿瘤抗原被释放到肿瘤周围的微环境中，并以低水平存在。由于这些肿瘤抗原不存在于细胞表面(即不保留在细胞表面上)，因此无法用标准car靶向它们。它们的低表达水平也可能对有效靶向这些肿瘤抗原进行治疗带来问题。

2、本发明提供了靶向这些在肿瘤微环境中以低水平存在的肿瘤抗原的治疗策略。该策略包括使用以下组合：1)表达car的工程化细胞；和2)双特异性蛋白。本发明的说明性实施方案显示于图1-4中。

3、双特异性蛋白包含结合肿瘤微环境中的细胞表面抗原的第一结构域(例如，在肿瘤细胞的细胞表面上)；和结合肿瘤抗原的第二结构域。工程化的car细胞表达在与双特异性蛋白识别的表位不同的表位处结合肿瘤抗原的car。当肿瘤抗原经由与双特异性蛋白的相互作用从肿瘤细胞或邻近细胞释放时，肿瘤抗原积聚在细胞(例如肿瘤细胞)的表面。然后，car与被双特异性蛋白拴系的肿瘤抗原结合。将抗原捕获在其表面的靶标细胞被裂解。

4、这种治疗策略可以用于靶向肿瘤抗原，包括但不限于：

5、·肿瘤表达的融合蛋白(例如，其中双特异性蛋白识别并结合一个融合配偶体，并且car识别并结合另一个融合配偶体)；

6、·包含肿瘤特异性突变的蛋白质(例如，其中双特异性蛋白识别并结合蛋白质的表位，并且car识别并结合可以是肿瘤特异性突变的突变(或反之亦然))；

7、·在肿瘤中异常磷酸化的蛋白质(例如，其中双特异性蛋白识别并结合蛋白质的表位，并且car识别并结合包含异常磷酸化的表位(或反之亦然))。

8、因此，根据本发明的工程化细胞和双特异性蛋白可以提供改进的工程化细胞以用作治疗剂。

9、在一方面，本发明提供了细胞，其包含：

10、(i)包含结合肿瘤抗原的第一表位的结合结构域的car；和

11、(ii)编码双特异性蛋白的多核苷酸，双特异性蛋白包含：

12、结合所述肿瘤抗原的第二表位的第一结合结构域；和

13、结合细胞表面抗原的第二结合结构域。

14、该细胞可以是工程化的免疫效应细胞。

15、双特异性蛋白可以是分泌蛋白。

16、结合肿瘤抗原的第一表位和肿瘤抗原的第二表位的结合结构域可以是非竞争性的。适当地，结合肿瘤抗原的第一表位的car的结合结构域和结合肿瘤抗原的第二表位的双特异性蛋白的第一结合结构域可以能够同时结合相同的抗原。

17、细胞表面抗原可以是细胞表面组织抗原。

18、适当地，肿瘤抗原不是细胞表面肿瘤抗原，优选地所述肿瘤抗原不包含跨膜结构域或脂质锚例如糖基磷脂酰肌醇(gpi)-锚。

19、适当地，肿瘤抗原不包含信号肽。

20、与相应的非癌性组织相比，肿瘤抗原在肿瘤中可以以更高的水平表达，或者抗原可以是肿瘤特异性的。

21、肿瘤抗原的第一和/或第二表位可以包含肿瘤特异性突变。

22、突变可以选自取代、插入或缺失。

23、肿瘤抗原可以是融合蛋白。适当地，所述融合蛋白可以包含至少两个结构域，融合蛋白的第一结构域可以包含肿瘤抗原的第一表位，并且融合蛋白的第二结构域可以包含肿瘤抗原的第二表位。换言之，car的结合结构域和双特异性蛋白的第一结合结构域结合融合蛋白的不同结构域或构成融合蛋白的不同融合配偶体。

24、肿瘤抗原的第一或第二表位可以包含肿瘤特异性翻译后修饰。

25、肿瘤特异性翻译后修饰可以是磷酸化，适当地，肿瘤抗原表位之一可以是磷酸化位点。例如，肿瘤抗原表位之一可以是磷酸化位点(其对肿瘤具有特异性)，而第二肿瘤抗原表位可以是不在磷酸化位点处的表位或非肿瘤特异性的表位。

26、car的结合结构域可以结合对肿瘤特异性的肿瘤抗原的第一表位。

27、双特异性蛋白的第一结合结构域可以结合对肿瘤特异性的肿瘤抗原的第二表位。

28、细胞可以是免疫效应细胞，例如α-βt细胞、nk细胞、γ-δt细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞或巨噬细胞。

29、在另一方面，本发明提供了核酸构建体，其包含：

30、(i)编码car的第一核酸序列，所述car包含结合肿瘤抗原的第一表位的结合结构域；和

31、(ii)编码双特异性蛋白的第二核酸序列，所述双特异性蛋白包含：

32、结合所述肿瘤抗原的第二表位的第一结合结构域；和

33、结合细胞表面组织抗原的表位的第二结合结构域。

34、第一和第二核酸序列可以由共表达位点分开。

35、在又一方面，本发明提供了核酸序列的试剂盒，其包含：

36、(i)编码car的第一核酸序列，所述car包含结合肿瘤抗原的第一表位的结合结构域；和

37、(ii)编码双特异性蛋白的第二核酸序列，双特异性蛋白包含：

38、结合所述肿瘤抗原的第二表位的第一结合结构域；和

39、结合细胞表面组织抗原的表位的第二结合结构域。

40、在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的核酸构建体的载体。

41、在另一方面，本发明提供了载体的试剂盒，其包含：

42、(i)包含编码car的核酸序列的第一载体，所述car包含结合肿瘤抗原的第一表位的结合结构域；和

43、(ii)包含编码双特异性蛋白的核酸序列的第二载体，所述双特异性蛋白包含：

44、结合所述肿瘤抗原的第二表位的第一结合结构域；和

45、结合细胞表面组织抗原的表位的第二结合结构域。

46、在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含多个根据本发明的细胞、根据本发明的核酸构建体、根据本发明的第一核酸序列和第二核酸序列；根据本发明的载体或根据本发明的第一和第二载体。

47、在另一方面，本发明提供根据本发明的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。

48、该疾病可以是癌症。

49、在又一方面，本发明提供了用于制备根据本发明的细胞的方法，其包括将以下引入细胞的步骤：根据本发明的核酸构建体、根据本发明的第一核酸序列和第二核酸序列；根据本发明的载体或根据本发明的第一和第二载体。

50、在另一方面，本发明提供了car系统，其包含：

51、(i)受体组分，其包含结合肿瘤抗原的第一表位的结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；和

52、ii)双特异性蛋白，其包含：

53、结合所述肿瘤抗原的第二表位的第一结合结构域；和

54、结合细胞表面组织抗原的表位的第二结合结构域。

55、该系统可以包含工程化免疫效应细胞。例如，细胞可以是α-βt细胞、nk细胞、γ-δt细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞或巨噬细胞。适当地，工程化免疫效应细胞可以表达受体组分。

56、该系统可以包含工程化免疫效应细胞。例如，细胞可以是α-βt细胞、nk细胞、γ-δt细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞或巨噬细胞。适当地，工程化免疫效应细胞可以表达双特异性蛋白。

57、受体组分和双特异性蛋白可以由相同细胞表达。例如，双特异性蛋白可以由系统或由系统内的组分产生。

58、可以将双特异性蛋白施用于系统。例如，双特异性蛋白可以在系统外产生并随后引入系统。

59、在又一方面，本发明提供了与car表达细胞组合用于治疗癌症的双特异性蛋白，其中：

60、双特异性蛋白包含：

61、结合所述肿瘤抗原的第二表位的第一结合结构域；和

62、结合细胞表面组织抗原的表位的第二结合结构域；并且

63、car包含结合肿瘤抗原的第一表位的结合结构域。

64、在另一方面，本发明提供了用于与双特异性蛋白组合用于治疗癌症的car表达细胞，其中：

65、car包含结合肿瘤抗原的第一表位的结合结构域；并且

66、双特异性蛋白包含：

67、结合所述肿瘤抗原的第二表位的第一结合结构域；和

68、结合细胞表面组织抗原的表位的第二结合结构域。