背景技术:
1、从混合细胞群中获取单细胞转录组信息的能力对于分子生物学研究和医学应用都很重要。需要一种灵敏且快速的方法来生成标记的dna扩增子,以便对远离转录物末端的目标基因座进行测序。
技术实现思路
1、本发明提供了生成用于测序的标记dna扩增子的方法。
2、一方面,本发明提供了一种生成用于测序的标记dna扩增子的方法,其包括以下步骤:
3、a)将第一寡核苷酸退火至核酸模板,所述核酸模板包含靶核酸分子序列、标签序列和第一通用序列的至少一部分,其中,靶核酸分子序列包含目标基因座;
4、b)从退火的第一寡核苷酸进行核酸模板导向的核酸延伸以产生第一延伸产物,所述第一延伸产物包含含有目标基因座的靶核酸分子序列的全部或部分、标签序列和第一通用序列的至少一部分;
5、c)环化第一延伸产物以产生环化的dna模板,其包含目标基因座、标签序列、第一通用序列的至少一部分和第二通用序列的至少一部分;和
6、d)进行环化的dna模板导向的核酸扩增以产生dna扩增子,其包含目标基因座、标签序列、第一通用序列的至少一部分和第二通用序列的至少一部分,
7、从而生成用于测序的标记dna扩增子。
8、在某些实施方式中,所述方法还包括进行第一延伸产物导向的核酸扩增以扩增第一延伸产物。在某些实施方式中,第一延伸产物导向的核酸扩增使用以下进行:
9、a)第一寡核苷酸;和
10、b)第一引物,其包含第一通用序列的至少一部分。
11、另一方面,本发明提供了一种生成用于测序的标记dna扩增子的方法,其包括以下步骤:
12、a)提供核酸模板,其包含靶核酸分子序列、标签序列和第一通用序列的至少一部分,其中,靶核酸分子序列包含目标基因座;
13、b)通过以下方式进行核酸模板导向的核酸扩增以产生第一扩增产物:
14、i.在引物退火至核酸模板中的互补核苷酸序列的条件下,使核酸模板与包含第一寡核苷酸和第一引物的反应混合物接触,其中,第一引物包含第一通用序列的至少一部分;和
15、ii.延伸第一寡核苷酸和第一引物中的每一个;
16、c)环化第一扩增产物以产生环化的dna模板,其包含目标基因座、标签序列、第一通用序列的至少一部分和第二通用序列的至少一部分;和
17、d)进行环化的dna模板导向的核酸扩增以产生dna扩增子,其包含目标基因座、标签序列、第一通用序列的至少一部分和第二通用序列的至少一部分,
18、从而生成用于测序的标记dna扩增子。
19、在另一方面,本发明提供了一种生用于测序的标记dna扩增子的方法,其包括以下步骤:
20、a)提供核酸模板,其从5'端到3'端包含截短的第一通用序列、标签序列、靶核酸分子序列和第一模板转换寡聚物(tso1)序列,其中,靶核酸分子序列包含目标基因座;
21、b)通过以下方式进行核酸模板定向的核酸扩增以产生第一扩增产物:
22、i.在第一寡核苷酸和第一反向引物退火至核酸模板中的互补核苷酸序列的条件下,使核酸模板与包含第一寡核苷酸和第一反向引物的反应混合物接触,其中:
23、1)第一寡核苷酸从5'端到3'端包括第二通用序列和靶核酸分子特异性序列;和
24、2)第一反向引物从5'端到3'端包含第二通用序列、[i7]、缺失的第一通用序列和截短的第一通用序列的至少一部分;和
25、ii.延伸第一寡核苷酸和第一反向引物中的每一个;
26、c)环化第一扩增产物以产生环化dna模板,其包含第二通用序列、目标基因座、标签序列、第一通用序列和[i7];和
27、d)进行环化的dna模板导向的核酸扩增以产生dna扩增子,其从5'端到3'端包含illumina p5序列、目标基因座、第二通用序列、[i7]、第一通用序列、标签序列和illuminap7序列,
28、从而生成用于测序的标记dna扩增子。
29、在另一方面,本发明提供了一种生成用于测序的标记dna扩增子的方法,其包括以下步骤:
30、a)提供核酸模板,其从5'端到3'端包含截短的第一通用序列、标签序列、第二模板转换寡聚物(tso2)序列和靶核酸分子序列,其中,靶核酸分子序列包含目标基因座;
31、b)通过以下方式进行核酸模板导向的核酸扩增以产生第一扩增产物:
32、i.在第一寡核苷酸和第一反向引物退火至核酸模板中的互补核苷酸序列的条件下,使核酸模板与包含第一寡核苷酸和第一反向引物的反应混合物接触,其中:
33、1)第一寡核苷酸从5'端到3'端包含第二通用序列和靶核酸分子特异性序列;和
34、2)第一反向引物从5'端到3'端包含第二通用序列、[i7]、缺失的第一通用序列和截短的第一通用序列的至少一部分;和
35、ii.延伸第一寡核苷酸和第一反向引物中的每一个;
36、c)环化第一扩增产物以产生环化的dna模板,其包含第二通用序列、目标基因座、tso2序列、标签序列、第一通用序列和[i7];和
37、d)进行环化的dna模板导向的核酸扩增以产生dna扩增子,其从5'端到3'端包含illumina p5序列、目标基因座、第二通用序列、[i7]、第一通用序列、tso2序列、标签序列和illumina p7序列,
38、从而生成用于测序的标记dna扩增子。
39、在某些实施方式中,核酸模板是互补dna(cdna)模板。在某些实施方式中,cdna模板是通过反转录来自单个细胞的rna获得的。在某些实施方式中,rna是mrna。在某些实施方式中,核酸模板是通过cdna分子的扩增产生的双链dna分子(例如,扩增子)。
40、在某些实施方式中,cdna模板对应于第一链cdna,其从5'端到3'端包含第一通用序列的至少一部分、标签序列、靶核酸分子序列和第一模板转换寡聚物(tso1)序列。在其他实施方式中,cdna模板对应于第二链cdna,其从5'端到3'端包含第一通用序列的至少一部分、标签序列、第二模板转换寡聚物(tso2)序列和靶核酸分子序列。
41、在某些实施方式中,目标基因座包含突变、多态性、插入、缺失、基因融合、编辑的核苷酸、修饰的核苷酸、转基因或其组合。
42、在某些实施方式中,标签序列包含细胞识别标签或独特分子标识符(umi)序列,或其组合。
43、在某些实施方式中,所述方法包括单个环化步骤。
44、在某些实施方式中,环化第一延伸产物包括由吉布森组装介导的分子内连接。
45、在某些实施方式中,所述方法用于制作测序文库。
46、在另一方面,本发明提供了一种用于测序的标记dna扩增子,其从5'端到3'端包含目标基因座、第二通用序列的至少一部分、第一通用序列的至少一部分和标签序列。在某些实施方式中,标记的dna扩增子从5'端到3'端包含目标基因座、第二通用序列、第一通用序列和标签序列。
47、在某些实施方式中,标记的dna扩增子从5'端到3'端包含illumina p5序列、目标基因座、第二通用序列、第一通用序列、标签序列和illumina p7序列。
48、在某些实施方式中,标记的dna扩增子从5'端到3'端包含illumina p5序列、目标基因座、第二通用序列、[i7]、第一通用序列、标签序列和illumina p7序列。
49、在某些实施方式中,标记的dna扩增子从5'端到3'端包含illumina p5序列、目标基因座、第二通用序列、[i7]、第一通用序列、标签序列、poly(t)序列和illumina p7序列。
50、在某些实施方式中,标记的dna扩增子从5'端到3'端包含illumina p5序列、目标基因座、第二通用序列、[i7]、第二模板转换寡聚物(tso2)序列和illumina p7序列。