富集基因工程T细胞的方法与流程

本发明属于细胞治疗和/或基因治疗领域。一些实施方案也属于细胞或基因工程领域。

背景技术：

1、细胞疗法是一种将活细胞注射、移植或植入患者体内以实现药效(medicinaleffect)的疗法，例如通过在免疫治疗过程中移植能够通过细胞介导的免疫对抗癌细胞的t细胞，或移植干细胞以再生患病组织。

技术实现思路

1、本文描述的一些实施方案涉及用于选择基因工程细胞的方法。所述方法包括ⅰ)将至少一种可操作用于在细胞中表达的两部分核苷酸序列(two-part nucleotidesequence)导入所述细胞，其中所述细胞具有存活和/

2、或增殖所必需的蛋白，在正常细胞培养基中所述蛋白被抑制到所述细胞不能存活和/或增殖的水平，并且其中所述至少一种两部分核苷酸序列包含编码存活和/或增殖所必需的蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达蛋白的第二部分核苷酸序列，其中所述第二部分核苷酸序列编码目的蛋白(例如，对细胞而言是外源性的蛋白)；和ⅱ)在正常细胞培养基中培养所述细胞以选择表达第一部分核苷酸序列和第二部分核苷酸序列两者的细胞。

3、本文描述的一些实施方案涉及用于选择基因工程细胞的方法。所述方法包括ⅰ)将至少一种可操作用于在细胞中表达的两部分核苷酸序列导入所述细胞，其中所述细胞具有存活和/或增殖必需的蛋白，在所选培养条件下所述蛋白被抑制到所述细胞不能存活和/或增殖的水平，并且其中所述至少一种两部分核苷酸序列包含编码允许存活和/或增殖的蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达蛋白的第二部分核苷酸序列，其中所述第二部分核苷酸序列编码对所述细胞而言是外源性的蛋白；和ⅱ)在使得富集表达第一部分核苷酸序列和第二部分核苷酸序列两者的细胞的体外增殖条件下培养所述细胞。

4、本文描述的一些实施方案涉及用于富集基因工程细胞的方法。所述方法包括：ⅰ)将细胞存活和/或增殖所必需的至少第一蛋白的活性降低到所述细胞在正常体外增殖条件下不能存活和/或增殖的水平；ⅱ)导入至少一种两部分核苷酸序列，所述两部分核苷酸序列可操作用于在所述细胞中表达并且包含编码所述第一蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达的第二蛋白的第二部分核苷酸序列，其中所述第二部分蛋白对所述细胞而言是外源性的，和ⅲ)在正常的体外增殖条件下培养所述细胞以富集表达所述第一蛋白和所述第二蛋白两者的细胞。

5、本文描述的一些实施方案涉及一种细胞，其包括ⅰ)内源性二氢叶酸还原酶(endogenous dihydrofolate reductase，(dhfr))，其被抑制到细胞在正常细胞培养基中不能存活和/或增殖的水平，和ⅱ)至少一种两部分核苷酸序列，其包含编码dhfr的第一部分核苷酸序列和编码新生抗原(neo-antigen)t细胞受体复合物的第二部分核苷酸序列。

6、本文描述的一些实施方案涉及用于富集基因工程细胞的方法。所述方法包括ⅰ)导入至少一种可操作用于在细胞中表达的两部分核苷酸序列，并且所述两部分核苷酸序列包含编码为细胞提供对选择压力的抗性的第一蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达的第二蛋白的第二部分核苷酸序列，其中第二部分蛋白对细胞而言是外源性的，和ⅱ)在含有至少一种导致表达第一蛋白和第二蛋白两者的细胞富集的补充剂(supplement)的细胞培养基中培养细胞。

7、本文所述的一些实施方案涉及用于富集基因工程t细胞的方法。所述方法包括ⅰ)通过在tra或trb启动子下游整合两部分核苷酸序列，将包含编码氨甲蝶呤(methotrexate)抗性dhfr蛋白的第一部分核苷酸序列和编码t细胞受体复合物或嵌合抗原受体的第二部分核苷酸序列的两部分核苷酸序列导入t细胞，和ⅱ)在含有导致表达第一蛋白和第二蛋白两者的细胞富集的氨甲蝶呤的细胞培养基中培养细胞。

8、本文描述的一些实施方案涉及用于富集经工程改造以表达外源性t细胞受体基因的t细胞的方法。所述方法包括ⅰ)使用第一crispr/cas9rnp将内源性trbc基因从其基因座上敲除；ⅱ)使用第二crispr/cas9rnp将编码氨甲蝶呤抗性dhfr基因的第一部分核苷酸序列和包含治疗性tcr基因的第二部分核苷酸序列敲入内源性trbc基因座，其中两种核苷酸序列可操作地连接使得能够从内源性trbc启动子表达；和ⅲ)在含有导致表达治疗性tcr和氨甲蝶呤抗性dhfr基因两者的t细胞富集的氨甲蝶呤的细胞培养基中培养细胞。

9、本文描述的一些实施方案涉及t细胞，其包括ⅰ)在氨甲蝶呤的存在下被抑制(suppressed)到细胞不能存活和/或增殖的水平的内源性二氢叶酸还原酶(dhfr)，和ⅱ)至少一种两部分核苷酸序列，其包含编码氨甲蝶呤抗性dhfr蛋白的第一部分核苷酸序列和编码由内源性tra或trb启动子可操作地表达的t细胞受体的第二部分核苷酸序列。

10、本文描述的一些实施方案涉及t细胞，或用于富集经工程改造以表达外源基因的t细胞的方法，其包括ⅰ)因氨甲蝶呤的存在而被抑制到细胞不能存活和/或增殖的水平的内源性dhfr，和ⅱ)至少两种核苷酸序列，包括包含编码与第一结合结构域融合的氨甲蝶呤抗性dhfr蛋白的非功能部分的核苷酸序列的第一核苷酸和包含编码与第二结合结构域融合的氨甲蝶呤抗性dhfr蛋白的非功能部分的核苷酸序列的第二核苷酸，使得当同时表达两种核苷酸时，存在功能性氨甲蝶呤抗性dhfr并且功能性氨甲蝶呤抗性dhfr能够促进含有第一核苷酸和第二核苷酸两者的细胞的选择。所述核苷酸序列中的任一者都可以包含两个以上的部分，使得第一部分包含编码与结合结构域融合的氨甲蝶呤抗性dhfr蛋白的非功能部分的核苷酸序列，并且第二部分包含编码外源基因的核苷酸序列。

11、对于根据这些实施方案的某些选择方法，随后在含有导致包含所述至少两种核苷酸序列的细胞富集的氨甲蝶呤的细胞培养基中培养t细胞。

12、本文描述的一些实施方案涉及用于恢复被拆分成多个非功能部分的dhfr蛋白的功能的结合结构域。当结合结构域与dhfr蛋白的互补非功能部分融合时，可以恢复dhfr蛋白的功能。结合结构域可以是天然结合结构域、不与天然蛋白相互作用的工程化结合结构域或诱导性结合结构域。

13、本文还公开了一种用于选择基因工程细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括导入至少两种可操作用于在细胞中表达的两部分核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞具有存活和/或增殖所必需的蛋白，所述蛋白被抑制到细胞不能存活和/或增殖的水平。在一些实施方案中，第一两部分核苷酸序列包含编码第一融合蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达蛋白的第二部分核苷酸序列，所述第一融合蛋白包含与第一结合结构域融合的存活和/或增殖必需的蛋白的非功能部分。在一些实施方案中，第二两部分核苷酸序列包含编码第二融合蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达蛋白的第二部分核苷酸序列，所述第二融合蛋白包含与第二结合结构域融合的存活和/或增殖必需的蛋白的非功能部分。在一些实施方案中，当第一融合蛋白和第二融合蛋白两者在细胞中一起表达时，存活和/或增殖必需的蛋白的功能得到恢复。在一些实施方案中，所述方法还包括在导致表达第一两部分核苷酸序列和第二两部分核苷酸序列的细胞的选择的条件下培养细胞。

14、在一些实施方案中，必需的蛋白是dhfr蛋白。在一些实施方案中，

15、第一两部分核苷酸序列或第二两部分核苷酸序列的第二部分核苷酸序列对细胞而言是外源性的。在一些实施方案中，第一两部分核苷酸序列或

16、第二两部分核苷酸序列的第二部分核苷酸序列是tcr。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域源自gcn4。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域源自fkbp12。在一些实施方案中，fkbp12具有f36v突变。在一些实施方案中，第一结合结构域源自jun，并且第二结合结构域源自fos。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域具有保持(preserve)相互之间结合的互补突变。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域都不结合天然结合配偶体(binding partner)。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域各具有3至7个互补突变。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域各具有3个互补突变。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域各具有4个互补突变。在一些实施方案中，必需的蛋白的功能的恢复是诱导的，任选地通过ap1903诱导。在一些实施方案中，培养步骤在氨甲蝶呤存在下进行。

17、本文还公开了用于富集基因工程细胞的方法。在一些实施方案中，

18、所述方法包括将细胞存活和/或增殖所必需的至少第一蛋白的活性降低到细胞在正常体外增殖条件下不能存活和/或增殖的水平。在一些实施方案中，所述方法还包括导入至少两种可操作用于在细胞中表达的两部分核苷酸序列。在一些实施方案中，第一两部分核苷酸序列包含编码第一融合蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达蛋白的第二部分核苷酸序列，所述第一融合蛋白包含与第一结合结构域融合的存活和/或增殖必需的蛋白的非功能部分。在一些实施方案中，第二两部分核苷酸序列包含编码第二融合蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达蛋白的第二部分核苷酸序列，所述第二融合蛋白包含与第二结合结构域融合的存活和/或增殖必需的蛋白的非功能部分。在一些实施方案中，当第一融合蛋白和第二融合蛋白两者在细胞中一起表达时，存活和/或增殖必需的蛋白的功能得到恢复。在一些实施方案中，所述方法还包括在导致表达第一融合蛋白和第二融合蛋白两者的细胞富集的体外增殖条件下培养所述细胞。

19、在一些实施方案中，必需的蛋白是dhfr蛋白。在一些实施方案中，

20、第一两部分核苷酸序列或第二两部分核苷酸序列的第二部分核苷酸序列对细胞而言是外源性的。在一些实施方案中，第一两部分核苷酸序列或

21、第二两部分核苷酸序列的第二部分核苷酸序列是tcr。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域源自gcn4。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域源自fkbp12。在一些实施方案中，fkbp12具有f36v突变。在一些实施方案中，第一结合结构域源自jun，并且第二结合结构域源自fos。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域具有保持相互之间结合的互补突变。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域都不结合天然结合配偶体。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域各具有3至7个互补突变。

22、在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域各具有3个互补突变。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域各具有4个互补突变。在一些实施方案中，必需的蛋白的功能的恢复是诱导的，任选地通过ap1903诱导。在一些实施方案中，培养步骤在氨甲蝶呤存在下进行。

23、本文提供的一些实施方案涉及用于选择或富集基因工程细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将至少一种能够在细胞中表达第一部分核苷酸序列和第二部分核苷酸序列两者的两部分核苷酸序列导入细胞。细胞具有存活和/或增殖所必需的蛋白，所述蛋白被降低到细胞在正常细胞培养基中不能存活和/或增殖的水平。所述至少一种两部分核苷酸序列可操作用于在细胞中表达，或者当插入靶基因组中的预定位点时变得可操作用于表达，并且所述至少一种两部分核苷酸序列包括编码存活和/或增殖所必需的蛋白或其变体的第一部分核苷酸序列，和编码待表达蛋白的第二部分核苷酸序列。第二部分核苷酸序列编码目的蛋白。所述方法还包括在没有药理学外源选择压力的正常细胞培养基中培养细胞，以用于选择或富集表达第一部分和第二部分核苷酸序列两者的细胞。

24、在一些实施方案中，所述方法包括将细胞存活和/或增殖所必需的至少第一蛋白的水平降低到细胞在正常体外增殖条件下不能存活和/或增殖的水平，将至少一种两部分核苷酸序列导入细胞，所述两部分核苷酸序列能够在细胞中表达第一部分核苷酸序列和第二部分核苷酸序列两者，并且包括编码第一蛋白或其变体的第一部分核苷酸序列和编码待表达的第二蛋白的第二部分核苷酸序列。所述至少一种两部分核苷酸序列可操作用于在细胞中表达，或者当插入靶基因组中的预定位点时变得可操作用于表达。第二部分蛋白是目的蛋白。所述方法还包括在没有药理学外源选择压力的情况下在正常的体外增殖条件下培养细胞，以用于富集表达第一蛋白和第二蛋白两者的细胞。

25、在一些实施方案中，所述方法包括将至少一种能够在细胞中表达第一部分核苷酸序列和第二部分核苷酸序列两者的两部分核苷酸序列导入细胞。所述细胞具有存活和/或增殖必需的蛋白的功能活性，所述功能活性被降低以至于所述细胞不能在正常细胞培养基中存活和/或增殖。所述至少一种两部分核苷酸序列可操作用于在细胞中表达，或者当插入靶基因组中的预定位点时变得可操作用于表达。所述至少一种两部分核苷酸序列包含编码第一蛋白的第一部分核苷酸序列，所述第一蛋白提供与存活和/或增殖所必需的蛋白基本上等同的功能，并且所述第二部分核苷酸序列编码待表达的第二蛋白。第二蛋白是目的蛋白。所述方法还包括在含有至少一种导致富集或选择表达第一蛋白和第二蛋白两者的细胞的补充剂的细胞培养基中培养细胞。

26、在一些实施方案中，所述方法包括将细胞存活和/或增殖所必需的至少第一蛋白的功能活性降低到所述细胞在正常体外增殖条件下不能存活和/或增殖的水平；将能够在细胞中表达第一部分核苷酸序列和第二部分核苷酸序列两者的至少一种两部分核苷酸序列导入细胞中，并且所述至少一种两部分核苷酸序列包括编码提供基本等同的功能的第一蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达的第二蛋白的第二部分核苷酸序列。所述至少一种两部分核苷酸序列可操作用于在细胞中表达或当插入靶基因组中的预定位点时变得可操作用于表达，并且所述第二蛋白是目的蛋白。

27、所述方法还包括在含有至少一种导致选择或富集表达第一蛋白和第二蛋白两者的细胞的补充剂的细胞培养基中培养细胞。

28、在一些实施方案中，所述方法包括将至少两种能够在细胞中表达第一部分核苷酸序列和第二部分核苷酸序列两者的两部分核苷酸序列导入细胞。细胞具有存活和/或增殖所必需的蛋白，所述蛋白被抑制(suppressed)到细胞不能存活和/或增殖的水平。第一两部分核苷酸序列包含编码第一融合蛋白的第一部分核苷酸序列和编码第一目的蛋白的第二部分核苷酸序列，所述第一融合蛋白包含与第一结合结构域融合的存活和/或增殖必需的蛋白的非功能部分。第二两部分核苷酸序列包含编码第二融合蛋白的第一部分核苷酸序列和编码第二目的蛋白的第二部分核苷酸序列，所述第二融合蛋白包含与第二结合结构域融合的存活和/或增殖必需的蛋白的非功能部分。当第一融合蛋白和第二融合蛋白在细胞中一起表达时，存活和/或增殖必需的蛋白的功能得到恢复。所述方法还包括在导致选择表达第一两部分核苷酸序列和第二两部分核苷酸序列两者的细胞的条件下培养细胞。

29、在一些实施方案中，所述方法包括将细胞存活和/或增殖所必需的至少第一蛋白抑制到细胞在正常体外繁殖条件下不能存活和/或增殖的水平，并导入至少两种能够在细胞中表达的两部分核苷酸序列。第一两部分核苷酸序列包含编码第一融合蛋白的第一部分核苷酸序列和编码第一目的蛋白的第二部分核苷酸序列，所述第一融合蛋白包含与第一结合结构域融合的存活和/或增殖必需的蛋白的非功能部分。第二两部分核苷酸序列包含编码第二融合蛋白的第一部分核苷酸序列和编码第二目的蛋白的第二部分核苷酸序列，所述第二融合蛋白包含与第二结合结构域融合的存活和/或增殖必需的蛋白的非功能部分。当第一融合蛋白和第二融合蛋白两者在细胞中一起表达时，存活和/或增殖必需的蛋白的功能得到恢复。所述方法还包括在导致表达第一融合蛋白和第二融合蛋白两者的细胞富集的体外增殖条件下培养细胞。

30、在一些实施方案中，所述方法包括导入至少一种可操作用于在细胞中表达的两部分核苷酸序列。所述细胞具有存活和/或增殖所必需的蛋白，所述蛋白被抑制到所述细胞不能存活和/或增殖的水平，并且所述至少一种两部分核苷酸序列包括编码存活和/或增殖所必需的蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达蛋白的第二部分核苷酸序列。第二部分核苷酸序列编码对细胞而言是外源性的蛋白。所述方法还包括在导致选择表达第一部分核苷酸序列和第二部分核苷酸序列两者的细胞的条件下培养细胞。

31、在一些实施方案中，所述方法包括将细胞存活和/或增殖所必需的至少第一蛋白的活性降低到细胞在正常体外增殖条件下不能存活和/或增殖的水平，导入至少一种两部分核苷酸序列，所述两部分核苷酸序列可操作用于在细胞中表达并且包含编码第一蛋白的第一部分核苷酸序列和编码待表达的第二蛋白的第二部分核苷酸序列。第二部分蛋白对细胞而言是外源性的，并且在导致表达第一蛋白和第二蛋白两者的细胞富集的体外增殖条件下培养细胞。

32、本文还公开了根据本发明的任何方法制成的细胞。

33、本文还公开了用于富集基因工程t细胞的方法。在一些实施方案中，

34、所述方法包括通过在tra或trb启动子下游整合两部分核苷酸序列，将包含编码氨甲蝶呤抗性dhfr蛋白的第一部分核苷酸序列和编码t细胞受体复合物或嵌合抗原受体的第二部分核苷酸序列的两部分核苷酸序列导入t细胞，和在含有导致表达第一蛋白和第二蛋白两者的细胞的富集的氨甲蝶呤的细胞培养基中培养细胞。

35、本文还公开了用于富集经工程改造以表达外源性t细胞受体基因的t细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用第一crispr/cas9rnp将内源性trbc基因从其基因座上敲除，使用第二crispr/cas9rnp将编码氨甲蝶呤抗性dhfr基因的第一部分核苷酸序列和包含治疗性tcr基因的第二部分核苷酸序列敲入内源性trbc基因座，其中两种核苷酸序列可操作地连接使得能够从内源性trbc启动子表达，和在含有导致表达治疗性tcr和氨甲蝶呤抗性dhfr基因两者的t细胞富集的氨甲蝶呤的细胞培养基中培养细胞。

36、本文还公开了t细胞。在一些实施方案中，所述t细胞包含内源性二氢叶酸还原酶(dhfr)，其在氨甲蝶呤的存在下被抑制到细胞不能存活和/或增殖的水平，和至少一种两部分核苷酸序列，其包含编码氨甲蝶呤抗性dhfr蛋白的第一部分核苷酸序列和编码由内源性tra或trb启动子可操作地表达的t细胞受体的第二部分核苷酸序列。

37、在一些实施方案中，所述t细胞包含内源性二氢叶酸还原酶(dhfr)敲除，和至少一种两部分核苷酸序列，所述两部分核苷酸序列包含编码dhfr蛋白或其变体的第一部分核苷酸序列和编码由内源性tra或trb启动子可操作地表达的t细胞受体的第二部分核苷酸序列。

38、在一些实施方案中，所述t细胞包含二氢叶酸还原酶(dhfr)，其在氨甲蝶呤的存在下被抑制到细胞不能存活和/或增殖的水平，和至少两种两部分核苷酸序列。第一两部分核苷酸序列包含编码dhfr蛋白或其变体的非功能性的或功能失调的部分的第一种第一部分核苷酸序列(first first-part nucleotide sequence)，和编码由内源性tra或trb启动子可操作地表达的t细胞受体的第一种第二部分核苷酸序列(first second-partnucleotide sequence)。所述第二两部分核苷酸序列包含编码dhfr蛋白或其变体的非功能性的或功能失调的部分的第二种第一部分核苷酸序列(second first-part nucleotidesequence)，和编码由内源性b2m启动子可操作地表达的目的蛋白的第二种第二部分核苷酸序列(second second-part nucleotide sequence)，并且所述细胞具有dhfr活性。

39、本发明的这些和其他特征、方面和优点将在参照以下描述和所附权利要求后得到更好理解。