识别HA-1抗原的结合蛋白及其用途的制作方法

识别ha-1抗原的结合蛋白及其用途
1.对相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年11月6日提交的美国临时申请号63/110,851、于2020年11月9日提交的美国临时申请号63/111,462、于2020年12月23日提交的美国临时申请号63/129,804和于2021年4月15日提交的美国临时申请号63/175,350的权益；所述申请中的每篇的全部内容均通过引用整体并入本文。
3.发明背景
4.大约30-40％的aml患者在同种异体造血干细胞移植疗法后复发，使他们的治疗选择非常少(pavletic et al.(2010)biol blood marrow transplant.16:871-890；miller et al.(2010)biol blood marrow transplant.16:565-586)。然而，天然发展ha-1特异性移植物抗白血病t细胞应答的罕见患者显示出显著降低的复发率(marijt et al.(2003)pnas.100:2742-2747；spierings et al.(2013)biol blood marrow transplant.19:1244-1253)。ha-1(vlhddllea，基因型rs_1801284a/g或a/a)是hla-a*02:01和造血受限的次要组织相容性抗原，使其成为针对液体肿瘤的tcr免疫疗法的理想候选物(bleakley and riddell(2011)immunol.cell biol.89:396-407)。需要开发ha-1特异性tcr免疫疗法，诸如治疗以ha-1抗原表达为特征的病症。
5.发明概述
6.本发明至少部分基于包含识别ha-1抗原的t细胞受体(tcr)的结合蛋白的发现。
7.一方面，提供了结合蛋白，其包含：a)t细胞受体(tcr)α链cdr序列，其与选自由表1中所列tcrα链cdr序列组成的组的tcrα链cdr序列具有至少约80％同一性；和/或b)tcrβ链cdr序列，其与选自由表1中所列tcrβ链cdr序列组成的组的tcrβ链cdr序列具有至少约80％同一性，其中结合蛋白能够与ha-1免疫原性肽-mhc(pmhc)复合物结合，任选地其中结合亲和力具有小于或等于约5x10-4
m的kd。
8.在另一方面，提供了结合蛋白，其包含：a)tcrα链可变(v
α
)域序列，其与选自由表1中所列tcr v
α
域序列组成的组的tcr v
α
域序列具有至少约80％同一性；和/或b)tcrβ链可变(v
β
)域序列，其与选自由表1中所列tcr v
β
域序列组成的组的tcr v
β
域序列具有至少约80％同一性，其中结合蛋白能够与ha-1免疫原性肽-mhc(pmhc)复合物结合，任选地其中结合亲和力具有小于或等于约5x10-4
m的kd。
9.在另一方面，提供了结合蛋白，其包含：a)tcrα链序列，其与选自由表1中所列tcrα链序列组成的组的tcrα链序列具有至少约80％同一性；和/或b)tcrβ链序列，其与选自由表1中所列tcrβ链序列组成的组的tcrβ链序列具有至少约80％同一性，其中结合蛋白能够与ha-1免疫原性肽-mhc(pmhc)复合物结合，任选地其中结合亲和力具有小于或等于约5x10-4
m的kd。
10.在又一方面，提供了结合蛋白，其包含：a)tcrα链cdr序列，其选自由表1中所列的tcrα链cdr序列组成的组；和/或b)tcrβ链cdr序列，其选自由表1中所列的tcrβ链cdr序列组成的组，其中结合蛋白能够与ha-1免疫原性肽-mhc(pmhc)复合物结合，任选地其中结合亲和力具有小于或等于约5x10-4
m的kd。
11.在另一方面，提供了结合蛋白，其包含：a)tcrα链可变(v
α
)域序列，其选自由表1中所列的tcr v
α
域序列组成的组；和/或b)tcrβ链可变(v
β
)域序列，其选自由表1中所列的tcr v
β
域序列组成的组，其中结合蛋白能够与ha-1免疫原性肽-mhc(pmhc)复合物结合，任选地其中结合亲和力具有小于或等于约5x10-4
m的kd。
12.在另一方面，提供了结合蛋白，其包含：a)tcrα链序列，其选自由表1中所列的tcrα链序列组成的组；和/或b)tcrβ链序列，其选自由表1中所列的tcrβ链序列组成的组，其中结合蛋白能够与ha-1免疫原性肽-mhc(pmhc)复合物结合，任选地其中结合亲和力具有小于或等于约5x10-4
m的kd。
13.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，1)tcrα链cdr、tcr v
α
域和/或tcrα链由选自表1中所列的trav、traj和trac基因的组的trav、traj和/或trac基因或其片段编码，和/或2)tcrβ链cdr、tcr v
β
域和/或tcrβ链由选自表1中所列的trbv、trbj和trbc基因的组的trbv、trbj和/或trbc基因或其片段编码，和/或3)结合蛋白的每个cdr与表1中所列的关联参考cdr序列相比具有多达五个氨基酸取代、插入、缺失或其组合。在另一个实施方案中，ha-1免疫原性肽包含氨基酸序列vlhddllea。在又一个实施方案中，结合蛋白是嵌合的、人源化的或人的。在又一个实施方案中，结合蛋白是tcr、tcr的抗原结合片段、单链tcr(sctcr)、嵌合抗原受体(car)或包含tcr和效应物域的融合蛋白，任选地其中结合域包含跨膜域和细胞内的效应物域。在另一个实施方案中，tcrα链和tcrβ链共价连接，任选地其中tcrα链和tcrβ链通过接头肽共价连接。在又一个实施方案中，tcrα链和/或tcrβ链共价连接至部分，任选地其中共价连接的部分包含亲和标签或标记物。在又一个实施方案中，亲和标签选自由cd34富集标签、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、钙调蛋白结合蛋白(cbp)、蛋白c标签、myc标签、halotag、ha标签、flag标签、his标签、生物素标签和v5标签组成的组，和/或其中标记物是荧光蛋白。在另一个实施方案中，共价连接的部分选自由炎性剂、细胞因子、毒素、细胞毒性分子、放射性同位素或抗体或其抗原结合片段组成的组。在另一个实施方案中，结合蛋白与细胞表面上的pmhc复合物结合。在又一个实施方案中，mhc是mhc多聚体，任选地其中mhc多聚体是四聚体。在另一个实施方案中，mhc是mhc i类分子。在又一个实施方案中，mhc包含为hla血清型hla-a*02的mhcα链。在又一个实施方案中，hla等位基因选自由hla-a*0201、hla-a*0202、hla-a*0203、hla-a*0205、hla-a*0206和hla-a*0207等位基因组成的组。在另一个实施方案中，本文所述的结合蛋白与ha-1肽-mhc(pmhc)复合物的结合引发免疫应答，任选地其中免疫应答是t细胞应答。在另一个实施方案中，t细胞应答选自由t细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤组成的组。在又一个实施方案中，结合蛋白能够以小于或等于约1x10-4
m、小于或等于约5x10-5
m、小于或等于约1x10-5
m、小于或等于约5x10-6
m、小于或等于约1x10-6
m、小于或等于约5x10-7
m、小于或等于约1x10-7
m、小于或等于约5x10-8
m、小于或等于约1x10-8
m、小于或等于约5x10-9
m、小于或等于约1x10-9
m、小于或等于约5x10-10
m、小于或等于约1x10-10
m、小于或等于约5x10-11
m、小于或等于约1x10-11
m、小于或等于约5x10-12
m或小于或等于约1x10-12
m的kd与ha-1免疫原性肽-mhc(pmhc)复合物特异性和/或选择性结合。在另一个实施方案中，结合蛋白对肽-mhc(pmhc)的结合亲和力比已知的t细胞受体高。在另一个实施方案中，结合蛋白对肽-mhc(pmhc)的结合亲和力比已知的t细胞受体高至少1.05倍。在另一个实施方案中，在与具有ha-1的杂合表达的靶细胞接触时，结合蛋
白与已知的t细胞受体相比诱导更多的t细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤。在又一个实施方案中，在与具有ha-1的杂合表达的靶细胞接触时，结合蛋白与已知的t细胞受体相比诱导t细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤的至少1.05倍增加。如本文所用，在一些实施方案中，对倍数变化的提及可以是与任何感兴趣的参考模态的比较，诸如与不同结合蛋白的比较；与不同背景下的相同结合蛋白的比较，如相同结合蛋白在不同免疫细胞中以不同水平的表达，联合本文所述的其他试剂；以及等等。在另一个实施方案中，靶细胞是thp-1或tf1细胞系。在又一个实施方案中，靶细胞是癌细胞，任选地其中癌细胞是造血癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓增生异常病症细胞、骨髓增生性赘生物细胞，或骨髓瘤细胞。在另一个实施方案中，本文所述的结合蛋白不与ha-1r肽-mhc(pmhc)复合物结合，其中ha-1r肽包含氨基酸序列vlrddllea。在又一个实施方案中，本文所述的结合蛋白与ccdc114肽-mhc(pmhc)复合物结合，任选地其中ccdc114肽是smiddllgv。
14.在另一方面，提供了选自由表1中所列的tcrα链和β链序列组成的组的tcrα链和/或β链。
15.在另一方面，提供了分离的核酸分子，其在严格条件下与编码选自由表1中所列多肽序列组成的组的多肽的核酸或与编码选自由表1中所列多肽序列组成的组的多肽的核酸具有至少约80％同源性的序列的互补物杂交，任选地其中分离的核酸分子包含1)选自表1中所列的trav、traj和trac基因的组的trav、traj和/或trac基因或其片段，和/或2)选自表1中所列的trbv、trbj和trbc基因的组的trbv、trbj和/或trbc基因或其片段。
16.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，核酸针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化。
17.在另一方面，提供了包含本文所述的分离的核酸的载体。
18.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，载体是克隆载体、表达载体或病毒载体。在另一个实施方案中，载体进一步包含编码cd8α和/或cd8β的核酸序列。在又一个实施方案中，编码cd8α或cd8β的核酸序列可操作地连接至编码标签的核酸。在又一个实施方案中，编码标签的核酸位于编码cd8α或cd8β的核酸序列的5’上游，使得标签融合至cd8α或cd8β的n端。在另一个实施方案中，标签是cd34富集标签。在另一个实施方案中，本文所述的分离的核酸和编码cd8α和/或cd8β的核酸序列与内部核糖体进入位点或编码自切割肽的核酸序列相互连接。在又一个实施方案中，自切割肽是p2a、e2a、f2a或t2a。
19.在另一方面，提供了包含本文所述的分离的核酸、包含本文所述的载体和/或表达本文所述的结合蛋白的宿主细胞，任选地其中细胞是遗传工程化的。
20.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，宿主细胞包含tcr基因、hla基因或两者的染色体基因敲除。在另一个实施方案中，宿主细胞包含选自α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因及其组合的hla基因的敲除。在又一个实施方案中，宿主细胞包含选自tcrα可变区基因、tcrβ可变区基因、tcr恒定区基因及其组合的tcr基因的敲除。在又一个实施方案中，宿主细胞表达cd8α和/或cd8-β。在另一个实施方案中，cd8α和/或cd8β与cd34富集标签融合。在另一个实施方
案中，宿主细胞使用cd34富集标签进行富集。在又一个实施方案中，宿主细胞是造血祖细胞、外周血单个核细胞(pbmc)、脐带血细胞或免疫细胞。在另一个实施方案中，免疫细胞是细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性淋巴细胞前体细胞、细胞毒性淋巴细胞祖细胞、细胞毒性淋巴细胞干细胞、cd4
+ t细胞、cd8
+ t细胞、cd4/cd8双阴性t细胞、gamma delta(γδ)t细胞、自然杀伤(nk)细胞、nk-t细胞、树突状细胞或其组合。在另一个实施方案中，t细胞是初始t细胞、中央记忆t细胞、效应记忆t细胞或其组合。在又一个实施方案中，t细胞是原代t细胞或t细胞系的细胞。在又一个实施方案中，t细胞不表达内源性tcr或具有较低的内源性tcr表面表达。在另一个实施方案中，宿主细胞在与包含肽-mhc(pmhc)复合物的靶细胞接触时能够产生细胞因子或细胞毒性分子，该肽-mhc(pmhc)复合物包含在mhc分子的背景下的ha-1肽表位。在另一个实施方案中，宿主细胞在体外、离体或体内与靶细胞接触。在又一个实施方案中，细胞因子是tnf-α、il-2和/或ifn-γ。在另一个实施方案中，细胞毒性分子是穿孔素和/或颗粒酶，任选地其中细胞毒性分子是颗粒酶b。在又一个实施方案中，宿主细胞在与具有ha-1的杂合表达的靶细胞接触时能够产生更高水平的细胞因子或细胞毒性分子。在又一个实施方案中，宿主细胞能够产生高至少1.05倍水平的细胞因子或细胞毒性分子。在另一个实施方案中，宿主细胞能够杀伤包含肽-mhc(pmhc)复合物的靶细胞，该肽-mhc(pmhc)复合物包含在mhc分子的背景下的ha-1肽表位。在又一个实施方案中，杀伤通过杀伤测定来确定。在又一个实施方案中，杀伤测定中宿主细胞与靶细胞的比率为20:1至0.625:1。在另一个实施方案中，靶细胞是用1μg/ml至50pg/ml的ha-1肽脉冲的t2细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞在与具有ha-1的杂合表达的靶细胞接触时能够杀伤更多数量的靶细胞。在又一个实施方案中，宿主细胞能够杀伤高至少1.05倍数量的靶细胞。在另一个实施方案中，靶细胞是thp-1或tf1细胞系。在又一个实施方案中，一个ha-1免疫原性肽包含氨基酸序列vlhddllea。在又一个实施方案中，mhc分子是mhc i类分子。在另一个实施方案中，mhc分子包含为hla血清型hla-a*02的mhcα链。在另一个实施方案中，hla等位基因选自由hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:05、hla-a*02:06和hla-a*02:07等位基因组成的组。在又一个实施方案中，靶细胞是选自由supm2、thp-1和tf1细胞系组成的组的细胞系，是表达ha-1的造血癌细胞，或者不是su-dhl1。在另一个实施方案中，癌细胞是选自由白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常病症、骨髓增生性赘生物或骨髓瘤组成的组的血液恶性肿瘤的。在另一个实施方案中，a)宿主细胞在与包含肽-mhc(pmhc)复合物的靶细胞接触时不诱导t细胞扩增、细胞因子释放或细胞毒性杀伤，该肽-mhc(pmhc)复合物包含在mhc分子的背景下的ccdc114肽表位，和/或b)宿主细胞不表达ha-1抗原、不由本文所述的结合蛋白识别、不属于血清型hla-a*02的，和/或不表达hla-a*02等位基因，诸如hla-a*02:01和/或hla-a*02:06。
21.在另一方面，提供了本文所述的宿主细胞群。
22.在另一方面，提供了组合物，其包含：a)本文所述的结合蛋白，b)本文所述的分离的核酸，c)本文所述的载体，d)本文所述的宿主细胞，和/或e)本文所述的宿主细胞群，以及载剂。
23.在另一方面，提供了装置或试剂盒，其包含：a)本文所述的结合蛋白，b)本文所述的分离的核酸，c)本文所述的载体，d)本文所述的宿主细胞，和/或e)本文所述的宿主细胞群，所述装置或试剂盒任选地包含用于检测a)、d)和/或e)与pmhc复合物的结合的试剂。
24.在另一个方面，提供了产生本文所述的结合蛋白的方法，其中方法包括以下步骤：
(i)在如下条件下培养转化的宿主细胞，该宿主细胞已由包含编码本文所述的结合蛋白的序列的核酸转化，该条件适合于允许所述结合蛋白的表达；(ii)回收表达的结合蛋白。
25.在另一方面，提供了产生表达本文所述的结合蛋白的宿主细胞的方法，其中方法包括以下步骤：(i)将包含编码本文所述的结合蛋白的序列的核酸引入宿主细胞中；(ii)在适合于允许表达所述结合蛋白的条件下培养转化的宿主细胞。
26.在另一方面，提供了检测ha-1抗原和/或表达ha-1的细胞的存在或不存在的方法，任选地其中细胞是过度增殖细胞，该方法包括通过使用本文所述的至少一种结合蛋白或本文所述的至少一种宿主细胞来检测样品中所述ha-1抗原的存在或不存在，其中ha-1抗原的检测指示ha-1抗原和/或表达ha-1的细胞的存在。
27.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，至少一种结合蛋白或至少一种宿主细胞在mhc分子的背景下与ha-1肽形成复合物，并且复合物以以下形式检测：荧光激活细胞分选(facs)、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、免疫化学、蛋白质印迹或细胞内流动测定。在另一个实施方案中，方法进一步包括从受试者获得样品。在又一个实施方案中，方法进一步包括通过骨髓生检确认表达ha-1的细胞。
28.在另一方面，提供了检测受试者中的以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的水平的方法，其包括a)使从受试者获得的样品与本文所述的至少一种结合蛋白、本文所述的至少一种宿主细胞或本文所述的宿主细胞群接触；和b)检测反应性水平，其中与对照水平相比更高的反应性水平指示受试者中的以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的水平。
29.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，对照水平是参考数字。在另一个实施方案中，对照水平是不患有以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的受试者的水平。
30.在另一个方面，监测受试者中的以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的进展的方法，该方法包括：a)如本文所述，在第一时间点检测受试者样品中的ha-1抗原或表达ha-1的感兴趣细胞的水平；b)在随后的时间点重复步骤a)；和c)比较在步骤a)和b)中检测到的ha-1抗原或表达ha-1的感兴趣细胞的水平以监测受试者中的以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的进展，其中与步骤a)相比，步骤b)中检测到的ha-1抗原或表达ha-1的感兴趣细胞的缺乏或水平降低指示受试者中的以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的进展受到抑制。
31.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，受试者已经在第一个时间点和随后的时间点之间经历治疗以治疗以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发。
32.在又一方面，提供了评估针对以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的疗法的功效的方法，其包括：a)在向受试者提供针对以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的疗法的至少部分
之前，在从受试者获得的第一样品中，确定从受试者获得的样品与本文所述的至少一种结合蛋白、本文所述的至少一种宿主细胞或本文所述的宿主细胞群之间反应性的存在或水平，和b)在提供针对以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的疗法的部分之后，在从受试者获得的第二样品中，确定从受试者获得的样品与本文所述的至少一种结合蛋白、本文所述的至少一种宿主细胞或本文所述的宿主细胞群之间反应性的存在或水平，其中相对于第一样品，第二样品中反应性的不存在或水平降低是疗法有效治疗受试者中的以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的指示。
33.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，反应性的水平由a)结合的存在和/或b)t细胞活化和/或效应物功能指示。在另一个实施方案中，t细胞活化或效应物功能是t细胞增殖、杀伤或细胞因子释放。在另一个实施方案中，t细胞结合、活化和/或效应物功能使用荧光激活细胞分选法(facs)、酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法(ria)、免疫化学、蛋白质印迹或细胞内流动测定进行检测。
34.在另一方面，预防和/或治疗受试者中的以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含表达本文所述的至少一种结合蛋白的细胞的组合物。
35.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，细胞是同种异体细胞、同系细胞或自体细胞。在另一个实施方案中，细胞是经遗传修饰的。在又一个实施方案中，细胞包含tcr基因、hla基因或tcr基因和hla基因两者的染色体基因敲除。在又一个实施方案中，细胞包含选自α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因及其组合的hla基因的敲除。在另一个实施方案中，细胞包含选自tcrα可变区基因、tcrβ可变区基因、tcr恒定区基因及其组合的tcr基因的敲除。在另一个实施方案中，细胞表达cd8α和/或cd8β，任选地其中cd8α和/或cd8β与cd34富集标签融合。在又一个实施方案中，细胞使用cd34富集标签进行富集。在另一个实施方案中，细胞是造血祖细胞、外周血单个核细胞(pbmc)、脐带血细胞或免疫细胞。在又一个实施方案中，免疫细胞是细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性淋巴细胞前体细胞、细胞毒性淋巴细胞祖细胞、细胞毒性淋巴细胞干细胞、cd4
+ t细胞、cd8
+ t细胞、cd4/cd8双阴性t细胞、gamma delta(γδ)t细胞、自然杀伤(nk)细胞、nk-t细胞、树突状细胞或其组合。在又一个实施方案中，t细胞是初始t细胞、中央记忆t细胞、效应记忆t细胞或其组合。在另一个实施方案中，t细胞是原代t细胞或t细胞系的细胞。在又一个实施方案中，t细胞不表达内源性tcr或具有较低的内源性tcr表面表达。在又一个实施方案中，细胞在与包含肽-mhc(pmhc)复合物的靶细胞接触时能够产生细胞因子或细胞毒性分子，该肽-mhc(pmhc)复合物包含在mhc分子的背景下的ha-1肽表位。在另一个实施方案中，细胞因子是tnf-α、il-2和/或ifn-γ。在又一个实施方案中，细胞毒性分子是穿孔素和/或颗粒酶，任选地其中细胞毒性分子是颗粒酶b。在又一个实施方案中，细胞在与具有ha-1的杂合表达的靶细胞接触时能够产生更高水平的细胞因子或细胞毒性分子。在另一个实施方案中，细胞能够产生高至少1.05倍水平的细胞因子或细胞毒性分子。在另一个实施方案中，宿主细胞能够杀伤包含肽-mhc(pmhc)复合物的靶细胞，该肽-mhc(pmhc)复
合物包含在mhc分子的背景下的ha-1肽表位。在又一个实施方案中，宿主细胞在与具有ha-1的杂合表达的靶细胞接触时能够杀伤更多数量的靶细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞能够杀伤高至少1.05倍数量的靶细胞。在又一个实施方案中，ha-1免疫原性肽包含氨基酸序列vlhddllea。在又一个实施方案中，mhc分子是mhc i类分子。在另一个实施方案中，mhc分子包含为hla血清型hla-a*02的mhcα链。在另一个实施方案中，hla等位基因选自由hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:05、hla-a*02:06和hla-a*02:07等位基因组成的组。在又一个实施方案中，靶细胞是受试者中表达ha-1抗原的非恶性细胞或过度增殖细胞。在另一个实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载剂。在又一个实施方案中，组合物诱导针对受试者中表达ha-1抗原的非恶性细胞或过度增殖细胞的免疫应答。在又一个实施方案中，组合物在受试者中诱导针对表达ha-1抗原的非恶性细胞或过度增殖细胞的抗原特异性t细胞免疫应答。在另一个实施方案中，抗原特异性t细胞免疫应答包括cd4
+
辅助性t淋巴细胞(th)应答和cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答中的至少一者。在又一个实施方案中，过度增殖性病症包括血液恶性肿瘤。在又一个实施方案中，血液恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常病症、骨髓增生性赘生物或骨髓瘤。在另一个实施方案中，血液恶性肿瘤包括白血病。在又一个实施方案中，白血病选自急性髓性白血病(aml)、急性淋巴细胞性白血病(all)、混合表型急性白血病(mpal)、慢性髓性白血病(cml)、b细胞幼淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性淋巴细胞性白血病(cll)。在又一个实施方案中，血液学病症包括淋巴瘤。在另一个实施方案中，淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤(hl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、中枢神经系统淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、cd37+树突状细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(malt)的结外边缘区b细胞淋巴瘤、结边缘区b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或伯基特淋巴瘤。在另一个实施方案中，血液恶性肿瘤包括骨髓增生异常病症(mds)，任选地其中mds选自难治性血细胞减少症伴单系发育异常(难治性贫血、难治性中性粒细胞减少症和难治性血小板减少症)、难治性贫血伴环状铁粒幼细胞(rars)、难治性贫血伴环状铁粒幼细胞-血小板增多症(rars-t)、难治性血细胞减少伴多细胞发育不良(rcmd)、难治性血细胞减少伴多细胞发育不良和环铁粒幼细胞(rcmd-rs)、难治性贫血伴原始细胞过多(raeb)、不可分类的骨髓增生异常、难治性儿童血细胞减少症或mds伴孤立del(5q)。在又一个实施方案中，非恶性病症是免疫缺陷病症，任选地其中免疫缺陷病症选自由严重联合免疫缺陷(scid)、wiskott-aldrich综合征、omenn综合征、x连锁淋巴增生综合征、慢性肉芽肿病、白细胞粘附缺陷、digeorge综合征、造血干细胞移植(hct)的适应症组成的组。在另一个实施方案中，非恶性病症是非恶性血液学，任选地其中非恶性血液病症选自由镰状细胞性贫血、地中海贫血、再生障碍性贫血、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hlh)、严重再生障碍性贫血、骨髓衰竭综合征、范可尼贫血、戴-布二氏贫血和施瓦赫曼-蒙德综合征组成的组。在又一个实施方案中，非恶性病症是自身免疫病症，任选地其中自身免疫病症是系统性硬化症或多发性硬化症。在又一个实施方案中，受试者正在接受或先前接受造血细胞移植(hct)，任选地其中hct包含不表达ha-1抗原、不由本文所述的结合蛋白识别、不属于血清型hla-a*02，和/或不表达hla-a*02:01等位基因的细胞。在另一个实施方案中，hct包含供体造血细胞，该供体造血细胞包含编码hla组分的基因的染色体敲除、编码
tcr组分的基因的染色体敲除或两者。在又一个实施方案中，受试者先前已接受淋巴细胞消减性化学疗法。在另一个实施方案中，淋巴细胞消减性化学疗法包括环磷酰胺、氟达拉滨、抗胸腺细胞球蛋白或其组合。在又一个实施方案中，方法进一步包括向受试者施用针对非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的至少一种额外治疗。在又一个实施方案中，针对非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的至少一种额外治疗与组合物并行或序贯施用。在另一个实施方案中，受试者是以ha-1表达为特征的病症的动物模型和/或受试者是哺乳动物，任选地其中哺乳动物是人、灵长类动物或啮齿动物。
36.在另一方面，提供了表达载体，其包含可操作地连接至编码cd8α和/或cd8β的核酸序列的启动子。
37.进一步提供了许多实施方案，这些实施方案可以应用于本发明所涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在一个实施方案中，编码cd8α或cd8β的核酸序列可操作地连接至编码标签的核酸，使得标签融合至cd8α或cd8β。在另一个实施方案中，编码标签的核酸位于编码cd8α或cd8β的核酸序列的5’上游，使得标签融合至cd8α或cd8β的n端。在又一个实施方案中，标签是cd34富集标签。在又一个实施方案中，载体进一步包含编码tcrα和/或tcrβ的核酸序列。在另一个实施方案中，tcrα和/或tcrβ包含突变的跨膜域和/或突变的恒定域。在又一个实施方案中，突变的跨膜域和/或突变的恒定域增强tcrα和/或tcrβ的细胞表面表达，同时降低内源性tcrα和/或tcrβ的表达。在又一个实施方案中，编码cd8α和/或cd8β的核酸序列和编码tcrα和/tcrβ的核酸序列与内部核糖体进入位点或编码自切割肽的核酸序列相互连接。在另一个实施方案中，自切割肽是p2a、e2a、f2a或t2a。在又一个实施方案中，载体进一步包含编码选自由表1中所列多肽序列组成的组的多肽的核酸序列，或与编码选自由表1中所列多肽序列组成的组的多肽的核酸具有至少约80％同源性的序列，任选地其中分离的核酸分子包含1)选自表1中所列的trav、traj和trac基因的组的trav、traj和/或trac基因或其片段和/或2)选自表1中所列的trbv、trbj和trbc基因的组的trbv、trbj和/或trbc基因或其片段。在又一个实施方案中，载体具有表3中所列的核酸序列。
38.附图简述
39.专利申请文件包含至少一幅以彩色绘制的附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
40.图1显示了tcr发现平台的示意图。tcr发现平台鉴定出329个新的ha-1tcr。cd14
+
单核细胞在第-4天从六名ha-1阴性健康供体的pbmc中分离并分化为成熟的dc。在第-1天，初始cd8 t细胞从自体pbmc中分离并静置过夜。在用1μg/ml ha-1肽(vlhddllea)脉冲dc 3小时后，执行cd8 t细胞和dc的共培养，然后是11天的细胞扩增阶段。用a*02:01特异性ha-1 dextramer执行dextramer染色以鉴定克隆，然后在存在il-2的情况下使用经照射的不匹配的pbmc快速扩增克隆。7天后，对ha-1 dextramer阳性细胞进行分选并执行单个细胞tcr测序。
41.图2a和图2b显示“边走边验证(validate as you go)”(vayg)筛选鉴定出11种具有高表达和细胞毒性的抗ha-1tcr。与基准“fred hutch”tcr和tscan的其他10个tcr相比，tsc-100始终表现出优越的功能，特别是当ha-1水平较低时，尽管tscan的其他10个tcr也被认为表现出良好的结合和响应概况。图2a显示泛t细胞经转导以表达329个ha-1特异性tcr。
通过ha-1(vlhddllea)hla-a*02:01 dextramer染色评估tcr的表面表达。高表达tcr中的三个以及基准“fred hutch”tcr显示为代表性数据。图2b显示了与加载有1ng/ml ha-1肽(e:t＝5:1)的nuclight red标记的t2细胞共培养的工程化t细胞的结果，并且t2细胞的生存通过时间依赖性成像量化为t细胞细胞毒性的读出。非转导细胞(ntd)充当对照。
42.图3a-图3d显示了最佳载体可以包括cd8α和cd8β中的一种或多种(例如全部)、cd34富集标签以及ha-1tcr的恒定域和跨膜域中的修饰。图3a显示将cd4t细胞分离并转导以表达ha-1特异性tcr以及单独的cd8α或cd8α和cd8β两者。工程化t细胞与标记的t2细胞共培养，该t2标记的细胞加载有各种浓度的ha-1(vlhddllea)肽(e:t＝5:1)，并且t2细胞的生长(或其缺乏)在incucyte上量化为t细胞的细胞毒性的读出。图3b显示tsc-100递送载体包含接枝在cd8αn端的cd34标签，从而能够使用gmp相容性miltenyi cd34富集试剂盒富集工程化t细胞。用tsc-100转导t细胞，并在cd34富集前后通过ha-1(vlhddllea)hla-a*02:01 dextramer染色评价cd34表达和tcr表达。图3c显示将tsc-100的原始序列与修饰的序列进行比较，这些修饰的序列携带恒定域(cd)和跨膜域(tm)中的残基的优化，旨在确保tcr的表面表达和正确的α/β配对。用不同版本的tcr转导原代人t细胞，并通过ha-1(vlhddllea)hla-a*02:01 dextramer染色评估正确配对的tcr的表面表达。图3d显示了代表性的载体构造。星号指示cd和tm修饰。
43.图4a-图4f显示tsc-100优于fred hutch tcr，尤其是当ha-1和hla-a*02:01表达较低时。泛t细胞经转导以表达tsc-100和fred hutch ha-1特异性tcr，并评估对表达ha-1和hla-a*02:01的靶细胞的功能性响应。ha-1-细胞表达ha-1蛋白的vlrddllea同等型并且ha-1
+
表达ha-1蛋白的vlhddllea同等型。图4a提供了显示如通过ha-1(vlhddllea)hla-a*02:01 dextramer染色所评估的tsc-100和fred hutch tcr的表达的点状图。图4b-4f显示了tsc-100和fred hutch tcr对靶细胞系的功能性响应。sup-m2(hla-a*02:01
+
ha-1
+
)(图4b)、thp-1(hla-a*02:01
+
ha-1
+
)(图4c)、tf-1(hla-a*02:01
lo
ha-1
lo
)(图4d)、su-dhl1(hla-a*02:01
+
ha-1-)(图4e)和仅t细胞(图4f)条件。左小图显示工程化t细胞与内源性表达不同水平ha-1的nuclight red标记的hla-a*02:01+细胞系以指示的e:t比率共培养，并且它们的生存在incucyte上量化为t细胞的细胞毒性的读出。中小图显示24小时时共培养上清液(e:t 1:1)中ifn-γ、il-2、tnf-α和颗粒酶b的产生。sup-m2和su-dhl1细胞内源性产生颗粒酶b。使用仅t细胞条件来确定细胞因子产生的背景水平。右小图显示表达tsc-100和fred hutch tcr的t细胞的增殖。工程化t细胞用增殖染料进行标记，并与靶细胞系共培养96小时(e:t 1:1)。使用染料稀释物来评估cd8和cd4t细胞的增殖。在通过流式细胞术分析之前将计数珠添加到样品中，并确定分裂的cd8和cd4t细胞的绝对数量。tcr通过单向anova、随后dunnett多重比较检验进行比较。*p《0.05，**p《0.005，***p《0.0005，****p《0.0001。这些实验在2-3个供体中执行，并显示了来自一个供体的代表性数据。在测试tf-1细胞的2个供体中的1个中观察到增殖差异。
44.图5显示tsc-100对104种hla类型没有显示出同种异体反应性。tsc-100和fred hutch tcr在同种异体反应性测定中进行测试。使用crispr/cas9-grna核糖核蛋白递送将内源性mhc从hek293t细胞中敲除，并制备出稳定表达包含ha-1序列的90残基蛋白质片段的细胞系。然后通过慢病毒转导将代表104种最普遍的hla类型的各个mhc引入ha-1
+
和ha-1-细胞系两者中。将为96孔格式的细胞与表达tsc-100和fred hutch tcr的人原代cd8
+ t细胞
温育过夜，并通过elisa测量上清液中的ifn-γ浓度。高于20,000pg/ml的浓度超出该测定的线性检测范围。
45.图6a和图6b显示tscan的全基因组筛选确定tsc-100没有可检测的脱靶，而ccdc114(诸如ccdc114肽抗原smiddllgv)鉴定为fred hutch tcr的脱靶。使用t-scan平台(kula et al.(2019)cell 178:1016-1028)评价tsc-100(图6a)和fred hutch(图6b)tcr的脱靶反应性。在这个全基因组安全性筛选中，表达tsc-100或fred hutch tcr的t细胞与hla-a*02:01
+
靶细胞文库共同培养，该靶细胞各自表达不同的90氨基酸蛋白质片段。总的来说，该文库包括以22氨基酸为步长在每个蛋白质间平铺的片段。片段由靶细胞天然加工，并且所得的肽展示在细胞表面mhc上。如果t细胞识别出它的靶标，则它尝试杀伤靶细胞，从而激活荧光报告物。通过分离荧光细胞并对它们的表达盒进行测序，揭示tcr的天然靶标。在约600,000个克隆中，仅文库中含有ha-1表位的三个克隆在tsc-100筛选中显著富集。fred hutch tcr的类似筛选将ccdc114鉴定为脱靶。x轴表示tscan肽组文库中的蛋白质片段，并且y轴表示输入文库中各个方格(tile)的富集倍数。
46.图7a-图7q显示其他10种tscan ha-1特异性tcr的功能活性类似于tsc-100。如上文针对tsc-100所述，使用与上文描述中为tsc-100提供的数据相同的方法和在相同的实验中分析了10种额外的ha-1特异性tcr(例如，图4中显示的数据是图7a-图7q中提供的数据的子组)。例如，泛t细胞经转导以表达11种ha-1特异性tcr，包括tsc-100和fred hutch，以及非功能性对照tcr(tk-1)，并评估对表达ha-1和hla-a*02:01的靶细胞的功能性响应。ha-1-细胞表达ha-1蛋白的vlrddllea同等型并且ha-1
+
表达ha-1蛋白的vlhddllea同等型。图7a-图7c提供了显示如通过ha-1(vlhddllea)hla-a*02:01 dextramer染色对三个独特供体所评估的ha-1tcr的表达的点状图。图7d-图7q显示了tcr对靶细胞系的功能性响应。显示了使用sup-m2(hla-a*02:01
+
ha-1
+
)细胞(图7d-图7f)、thp-1(hla-a*02:01
+
ha-1
+
)细胞(图7g-图7i)、tf-1(hla-a*02:01
lo
ha-1
lo
)细胞(图7j-图7l)、su-dhl1(hla-a*02:01
+
ha-1-)细胞(图7m-图7o)和仅t细胞(图7p和图7q)的条件的结果。工程化t细胞与内源性表达不同水平ha-1的nuclight red标记的hla-a*02:01+细胞系以指示的e:t比率共培养，并且它们的生存在上量化为t细胞的细胞毒性的读出。评估了24小时时共培养上清液(e:t 1:1)中ifn-γ、il-2、tnf-α和颗粒酶b的产生。为了量化表达ha-1特异性tcr的t细胞的增殖，工程化t细胞用增殖染料进行标记并与靶细胞系共培养96小时(e:t 1:1)。使用染料稀释物来评估cd8和cd4t细胞的增殖。在通过流式细胞术分析之前将计数珠添加到样品中，并确定分裂的cd8和cd4t细胞的绝对数量。使用“仅t细胞”条件来确定细胞因子产生和增殖的背景水平。sup-m2和su-dhl1内源性产生颗粒酶b(数据未显示)。tf-1细胞的il-2产生类似于所测试的所有供体的仅t细胞条件下的背景水平。在所测试的3名供体中的2名中观察到响应于tf-1细胞的细胞毒性和细胞因子产生。供体1响应于tf-1细胞的增殖类似于仅t细胞条件(数据未显示)。nd指示未进行实验。tcr通过单向anova进行比较，然后使用fred hutch作为对照tcr进行dunnett的多重比较测试。*p《0.05。
47.图8显示tsc-100展示出针对ha-1阳性细胞的特异性细胞毒活性。执行基于流式细胞术的细胞毒性测定。tsc-100工程化t细胞或未转导的对照t细胞(用celltrace
tm violet标记)与指示的原代靶细胞(用celltrace
tm farred标记)以1:1的比率共培养24小时。靶细胞的相对存活力(即celltrace
tm farred事件)使用可固定的存活力染料通过流式细胞术测
量。数据表示为靶细胞相对于未转导的对照t细胞共培养条件的存活力。
48.对于显示与图例相关的条形直方图、曲线或其他数据的任何图形，每个指示从左到右呈现的条形、曲线或其他数据直接且按顺序对应于图例从上到下或从左到右的框。
49.发明详述
50.本发明至少部分基于结合蛋白的发现，该结合蛋白包含识别ha-1抗原(例如，包含氨基酸序列vlhddllea的免疫原性肽)的t细胞受体(tcr)。
51.因此，本发明部分涉及鉴定的结合蛋白(例如，tcr)，表达结合蛋白(例如，tcr)的宿主细胞，包含结合蛋白(例如，tcr)和表达结合蛋白(例如，tcr)的宿主细胞的组合物，诊断、预后和监测t细胞对表达ha-1抗原的细胞的应答的方法，以及用于通过施用表达结合蛋白(例如，tcr)的宿主细胞来预防和/或治疗以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的方法。
52.i.定义
53.为方便起见，此处收集说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语。
54.冠词“一个”和“一种”在本文中用于指代冠词的一个或多于一个(即，至少一个)的语法对象。例如，“一个元素”是指一个元素或多于一个的元素。
55.术语“施用”是指向受试者提供药剂或药物组合物，包括但不限于由医疗专业人员施用和自行施用。这涉及使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一者将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白的施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“胃肠外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常是通过注射，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病变内(intralesional)、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。替代地，本文所述的结合蛋白可以经由非胃肠外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。施用还可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内执行。
56.如本文所用，术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质，诸如蛋白质、肽或半抗原(hapten)。抗原可以是ha-1抗原或其片段，期望针对其进行保护性或治疗性免疫应答。
57.如本文所用，术语“佐剂”是指当在施用抗原之前、同时或之后施用时与单独施用抗原相比加速、延长和/或增强针对抗原的免疫应答的质量和/或强度的物质。佐剂可以增加由疫苗接种诱导的免疫应答的强度和持续时间。
58.如本文所用，术语“抗体”包括整个抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方案中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区。在某些天然存在的抗体中，重链恒定区包含三个域ch1、ch2和ch3。在某些天然存在的抗体中，每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为v
l
)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个域cl。vh和v
l
区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布着更保守的区，称为框架区(fr)。每个vh和v
l
由三个cdr和四个fr构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合
域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq))的结合。
59.术语“抗原呈递细胞”或“apc”包括专职性抗原呈递细胞(例如，b淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞)，以及其他抗原呈递细胞(例如，角质形成细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、和少突胶质细胞)。
60.如本文所用，术语结合蛋白(诸如tcr)的“抗原结合部分”是指保留与抗原(例如，ha-1抗原和关联mhc/hla)结合(例如，特异性和/或选择性地)的能力的tcr的一个或多个部分。此类部分为，例如约8个至约1500个氨基酸长度，合适地约8个至约745个氨基酸长度，合适地约8个至约300个，例如约8个至约200个氨基酸，或约10个至约50个或100个氨基酸长度。已显示tcr的抗原结合功能可以由全长tcr的片段执行。术语tcr的“抗原结合部分”内涵盖的结合部分包括(i)由tcr的v
α
和v
β
域组成的fv片段，(ii)分离的互补决定区(cdr)或(iii)两个或多个分离的cdr的组合，它们可以任选地通过合成接头连接。此外，尽管v
α
和v
β
由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，使它们能够制成单条蛋白质链，其中v
α
和v
β
区配对以形成单价分子(称为单链tcr(sctcr))。此类单链tcr也旨在涵盖在术语tcr的“抗原结合部分”内。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些tcr片段，并且以与完全结合蛋白相同的方式筛选片段的实用性。抗原结合部分可以通过重组dna技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。
61.术语“互补决定区”和“cdr”与“高变区”或“hvr”同义，并且在本领域中已知是指某些结合蛋白内的非连续氨基酸序列，诸如tcr可变区，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。对于tcr，一般而言，每个α链可变区中有三个cdr(αcdr1、αcdr2和αcdr3)并且每个β链可变区中有三个cdr(βcdr1、βcdr2和βcdr3)。cdr3被认为是负责识别经加工抗原的主要cdr。cdr1和cdr2主要与mhc相互作用。
62.术语“体液”是指从身体排泄或分泌的流体以及通常不从身体排泄或分泌的流体(例如，羊水、房水、胆汁、血液和血浆、脑脊液、耵聍和耳垢、考珀液(cowper’s fluid)或预射精液(pre-ejaculatory fluid)、乳糜、食糜、粪便、女性射液、间质液、细胞内液、淋巴、月经、母乳、粘液、胸腔积液、脓、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、泪液、尿液、阴道润滑物(vaginal lubrication)、玻璃体液、呕吐物)。在一些实施方案中，体液包含免疫细胞，任选地，其中免疫细胞是细胞毒性淋巴细胞，诸如细胞毒性t细胞和/或nk细胞、cd4+ t细胞以及等等。
63.术语“编码区”是指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区，而术语“非编码区”是指不翻译成氨基酸的核苷酸序列的区(例如，5’和3’非翻译区)。
64.术语“互补”是指两条核酸链的区之间或同一核酸链的两个区之间的序列互补性的广义概念。已知第一核酸区的腺嘌呤残基能够与反平行于第一区的第二核酸区的残基(如果该残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特异性氢键(“碱基配对”)。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与反平行于第一链的第二核酸链的残基(如果该残基是鸟嘌呤)碱基配对。如果当两个区以反平行方式排列时，第一区的至少一个核苷酸残基能够与第二区的残基碱基配对，则核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区互补。在一些实施方案中，第一区包括第一部分并且第二区包括第二部分，由此，当第一和第二部分以反平行方式排列时，第一部分的至少约50％，并且在其他实施方案中，至少约75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如至少约80％-100％的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。在一些实施方案中，第一部分的所有核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
65.如本文所用，关于活化免疫细胞的术语“共刺激”包括共刺激分子提供诱导增殖或效应物功能的第二非活化受体介导的信号(“共刺激信号”)的能力。例如，共刺激信号可能导致细胞因子分泌，例如，在已接收到t细胞受体介导的信号的t细胞中。已接收细胞受体介导的信号(例如，经由激活受体)的免疫细胞在本文中称为“活化免疫细胞”。
[0066]“cd3”在本领域中被称为六链多蛋白复合物(参见abbas and lichtman,cellular and molecular immunology(第9版)(2018)；janeway et al.(immunobiology)(第9版)(2016))。在哺乳动物中，该复合物包含cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链，以及cd3ζ链的同二聚体。cd3γ、cd3δ和cd3ε链是含有单个免疫球蛋白域的免疫球蛋白超家族的相关细胞表面蛋白。cd3γ、cd3δ和cd3ε链的跨膜区带负电，这一特征被认为允许这些链与t细胞受体链的带正电区或残基缔合。cd3γ、cd3δ和cd3ε链的细胞内尾各自含有单个保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或it am，而每个cd3ζ链具有三个itam。不希望受理论束缚，据信it am对于tcr复合物的信号传导能力很重要。根据本发明使用的cd3可以来自各种动物物种，包括人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。
[0067]
如本文所用，“tcr复合物的组分”是指tcr链(即tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ)、cd3链(即cd3γ、cd3δ、cd3ε或cd3ζ)或由两条或更多条tcr链或cd3链形成的复合物(例如，tcrα和tcrβ的复合物、tcrγ和tcrδ的复合物、cd3ε和cd3δ的复合物、cd3γ和cd3ε的复合物，或tcrα、tcrβ、cd3γ、cd3δ和两条cd3ε链的亚tcr复合物)。
[0068]“嵌合抗原受体”或“car”是指融合蛋白，其经工程化以含有以非天然存在或宿主细胞中非天然存在的方式连接在一起的两个或更多个氨基酸序列，该融合蛋白在存在于细胞表面时可以作为受体发挥功能。本发明所涵盖的car包括与跨膜域和一个或多个细胞内信号传导域(诸如效应物域，任选地含有共刺激域)连接的包含抗原结合域(即，获得自或衍生自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，诸如对ha-1抗原具有特异性的tcr、单链tcr衍生的结合蛋白、衍生自抗体的scfv、从来自nk细胞的杀手免疫受体衍生或获得的抗原结合域，以及等等)的细胞外部分(例如，参见sadelain et al.(2013)cancer discov.3:388；还参见harris and kranz(2016)trends pharmacol.sci.37:220；stone et al.(2014)cancer immunol.immunother.63:1163)。
[0069]
如本文所用，术语“细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答”是指由细胞毒性t细胞诱导的免疫应答。ctl应答主要由cd8
+ t细胞介导。
[0070]
术语“基本上由
……
组成”不等同于“包含”，并且是指权利要求的特定材料或步骤，或者是指对所要求保护的主题的基本特征不产生实质性影响的那些材料或步骤。例如，当域、区、模块或蛋白质的氨基酸序列包括延伸、缺失、突变或其组合(例如，氨基端或羧基端或域之间的氨基酸)，其组合起来贡献域、区、模块或蛋白质的长度的至多20％(例如，至多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)并且不显著影响(即不降低活性超过50％，诸如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)域、区、模块或蛋白质的活性(例如，结合蛋白的靶标结合亲和力)时，则蛋白质域、区或模块(例如，结合域、铰链区、接头模
块)或蛋白质(其可能具有一个或多个域、区或模块)“基本上由特定氨基酸序列组成。
[0071]
术语“ccdc114”指的是含有卷曲螺旋域的114，这是含有卷曲螺旋域的蛋白质，是纤毛细胞中外动力蛋白臂对接复合物的组分。该基因的突变可能导致原发性纤毛运动障碍20。在一个实施方案中，ccdc114具有670个氨基酸和75046da的分子量。ccdc114的代表性mrna和蛋白质序列显示在下表4中。
[0072]
术语“为受试者确定合适的治疗方案”被认为意指为受试者确定治疗方案(即，用于预防和/或治疗受试者中的病毒感染的单一疗法或不同疗法的组合)主题)，该方案基于或基本上基于或至少部分基于根据本发明的分析结果而开始、修改和/或结束。一个实例是在手术后开始辅助治疗，其目的是降低复发的风险，另一个实例将是修改特定化学疗法的剂量。除了根据本发明的分析结果之外，该确定还可以基于待治疗受试者的个人特征。在大多数情况下，对受试者合适的治疗方案的实际确定将由主治医师或医师执行。
[0073]“fred hutch t细胞受体”是指已在pct公开号wo 2018/058002、美国专利号10,538,574和美国专利公开号2020/0231649中的至少一种基准t细胞受体。在一些实施方案中，fred hutch t细胞受体具有表2中所列的序列。
[0074]
如本文所用，“造血祖细胞”是可以衍生自造血干细胞或胎儿组织并且能够进一步分化成成熟细胞类型(例如，免疫系统细胞)的细胞。示例性造血祖细胞包括具有cd24
lo lin-cd117
+
表型的那些或在胸腺中发现的那些(称为祖胸腺细胞)。
[0075]
如本文所用，“同源”是指相同核酸链的两个区之间或两个不同核酸链的区之间的核苷酸序列相似性。当两个区中的核苷酸残基位置由相同的核苷酸残基占据时，则该区在该位置是同源的。如果每个区的至少一个核苷酸残基位置由相同的残基占据，则第一区与第二区同源。两个区之间的同源性以两个区的核苷酸残基位置由相同核苷酸残基占据的比例来表示。举例来说，具有核苷酸序列5
’‑
attgcc-3’的区和具有核苷酸序列5
’‑
tatggc-3’的区具有50％的同源性。在一些实施方案中，第一区包括第一部分并且第二区包括第二部分，由此，部分中的每一者的至少约50％，并且在其他实施方案中，至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如至少约80％-100％的核苷酸残基位置由相同的核苷酸残基占据。在一些实施方案中，部分中的每一者的所有核苷酸残基位置均由相同的核苷酸残基占据。
[0076]
如本文所用，术语“ha-1抗原”或“ha-1肽抗原”或“含ha-1肽抗原”或“ha-1表位”或“ha-1肽表位”或“ha-1肽”是指hmha1蛋白的天然或合成产生的肽部分，其也称为arhgap45，并且是在所有血细胞中以高水平表达但在任何其他组织中均不表达的细胞内蛋白。arhgap45有两种形式。在ha-1阳性个体中，肽具有序列vlhddllea，并且如果个体具有hla a*02血清型，诸如hla a*02:01型或hla a*02:06型(torikai et al.(2007)bone marrow transplant.40:165-174)，则抗原在血细胞表面高效展示。在ha-1阴性个体中，该肽具有序列vlrddllea，并且不展示ha-1抗原。大约60％的人具有vlhddllea序列，并且在美国大约42％的人具有hla a*02:01型，这意味着在美国大约25％的人是ha-1阳性且hla a*02:01型阳性。对接受hct的患者的研究已经显示，在ha-1阴性供体的t细胞天然发生对ha-1阳性患者的ha-1的应答的情况下，t细胞介导特定的移植物抗白血病(gvl)效应，并且患者通常经历长期缓解。在一些实施方案中，本文所述的组合物和治疗方法基于该临床观察并且设计
为在接受hct的患者中特异性引起该gvl效应。ha-1抗原蛋白的长度范围可以从约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、至多约20个氨基酸，并且包含r139h取代多态性，其可以与mhc(例如hla)分子形成复合物，并且对ha-1肽:mhc(例如hla)复合物具有特异性的本公开的结合蛋白可以与此类复合物结合(例如特异性结合)。示例性ha-1肽抗原包含具有氨基酸vlhddllea的肽，其中序列中的粗体组氨酸代表r139h多态性。术语“ha-1
r”或“ha-1-h”是指具有r139h的ha-1抗原。
[0077]
术语“以ha-1抗原的表达为特征的过度增殖性病症”可以是任何过度增殖性病症，其中ha-1抗原存在于由受试者中至少一些过度增殖细胞表达的mhc(例如hla)复合物中。以ha-1:hla复合物为特征的过度增殖性病症的实例包括血液恶性肿瘤。在某些实施方案中，血液恶性肿瘤包括白血病(例如，急性白血病或慢性白血病)。在具体实施方案中，白血病包括急性髓性白血病(aml)、急性淋巴细胞性白血病(all)、混合表型急性白血病(mpal)、慢性髓性白血病(cml)、b细胞幼淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性淋巴细胞性白血病(cll)。在某些实施方案中，血液恶性肿瘤包括淋巴瘤。在某些实施方案中，淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤(hl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、中枢神经系统淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、cd37+树突状细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜相关淋巴组织(malt)的结外边缘区b细胞淋巴瘤、结边缘区b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、恶性潜能不确定的b细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿和移植后淋巴增生性病症。在某些实施方案中，血液恶性肿瘤包括骨髓增生异常病症(mds)，诸如，例如难治性血细胞减少伴单系发育异常(难治性贫血、难治性中性粒细胞减少症和难治性血小板减少症)、难治性贫血伴环状铁粒幼细胞(rars)、难治性贫血伴环状铁粒幼细胞-血小板增多症(rars-t)、难治性血细胞减少伴多细胞发育不良(rcmd)、难治性血细胞减少伴多细胞发育不良和环状铁粒幼细胞(rcmd-rs)、难治性贫血伴原始细胞过多(raeb)、不可分类的骨髓增生异常和难治性儿童血细胞减少症、mds伴孤立del(5q)和其他众所周知的mds亚型(例如，参见万维网nbci.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc655460/上的2016年世界卫生组织mds分类)。在某些实施方案中，血液恶性肿瘤包括骨髓增生性赘生物(mpn)，诸如例如骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、慢性粒单核细胞白血病、慢性骨髓增生性疾病-不可分类、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病和mpn-无具体指定。在进一步的实施方案中，血液恶性肿瘤包括骨髓瘤。
[0078]
术语“免疫应答”包括t细胞介导的和/或b细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括t细胞应答，例如细胞因子产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括受t细胞活化间接影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答性细胞(例如巨噬细胞)的活化。
[0079]
增加的刺激免疫应答或免疫系统的能力可以由增加的t细胞共刺激受体的激动剂活性和/或增加的抑制性受体的拮抗剂活性引起。增加的刺激免疫应答或免疫系统的能力可以通过ec
50
的倍数增加或测量免疫应答的测定，例如，测量细胞因子或趋化因子释放、细胞溶解活性(直接在靶细胞上测定或经由检测cd107a或颗粒酶间接测定)和增殖的变化的测定中的最大活性水平来反映。刺激免疫应答或免疫系统活性的能力可能增强了至少
10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、500％或更多。
[0080]
术语“免疫治疗剂”可以包括可以刺激宿主免疫系统以在受试者中生成针对病毒感染的免疫应答的任何分子、肽、抗体或其他试剂。各种免疫治疗剂可用于本文所述的组合物和方法。
[0081]
术语“免疫细胞”是指起源于骨髓中造血干细胞的免疫系统的任何细胞，其产生两个主要谱系：髓系祖细胞(其产生髓系细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨核细胞和粒细胞)；和淋巴样祖细胞(其产生淋巴样细胞，诸如t细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞)。示例性免疫系统细胞包括cd4
+
t细胞、cd8
+ t细胞、cd4 cd8双阴性t细胞、gd t细胞、调节性t细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞。巨噬细胞和树突状细胞可以称为“抗原呈递细胞”或“apc”，当与肽复合的apc表面的主要组织相容性复合物(mhc)受体与t细胞表面的tcr相互作用时，它们是可以激活t细胞的特化细胞。
[0082]“分离的蛋白质”是指从细胞中分离或通过重组dna技术产生时基本上不含其他蛋白质、细胞材料、分离介质和培养基，或化学合成时不含化学前体或其他化学品的蛋白质。“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自衍生结合蛋白、抗体、多肽、肽或融合蛋白的细胞或组织来源的细胞物质或其他污染蛋白质，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。语言“基本上不含细胞材料”包括生物标志物多肽或其片段的制剂，其中蛋白质与分离或重组产生其的细胞的细胞组分分开。在一个实施方案中，语言“基本上不含细胞材料”包括生物标志物蛋白质或其片段的制剂，其具有少于约30％(按干重计)的非生物标志物蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)，或在一些实施方案中，少于约25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如少于约1％至5％的非生物标志物蛋白。当重组产生结合蛋白、抗体、多肽、肽或融合蛋白或其片段，例如其生物活性片段时，其可以基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、15％、10％、5％、1％或更少，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，例如小于约1％至5％。
[0083]
如本文所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，igm、igg1、igg2c以及等等)。
[0084]
如本文所用，术语“k
d”旨在指特定结合蛋白-抗原相互作用的解离平衡常数。本发明所涵盖的结合蛋白的结合亲和力可以通过标准结合蛋白-靶标结合测定来测量或确定，例如竞争测定、饱和测定或标准免疫测定，诸如elisa或ria。相对较低的kd值指示相对较高的结合亲和力(例如，小于或等于约5x10-4
m(500um)的kd值包括1x10-4
m(100um)的kd值并且100um kd指示与500um kd相比相对更高的结合亲和力)。
[0085]“试剂盒”是包含至少一种试剂(例如，探针或小分子)的任何制品(例如，包装或容器)，其用于特异性检测和/或影响本发明所涵盖的标志物的表达。试剂盒可以作为用于执行本发明所涵盖的方法的单元来促销、分发或销售。该试剂盒可以包含表达可用于本发明所涵盖的方法的组合物所必需的一种或多种试剂。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含参考标准品，例如编码不影响或调节控制细胞生长、分裂、迁移、生存或凋亡的信号传导途径的蛋白质的核酸。本领域技术人员可以设想许多此类对照蛋白，包括但不限于常见的分子标签(例如，绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶)、未由geneontology参考分类在涵盖细
胞生长、分裂、迁移、生存或细胞凋亡的途径中的任一者中的蛋白质，或普遍存在的管家蛋白。试剂盒中的试剂可以在各个容器中提供，或者在单个容器中作为两种或更多种试剂的混合物提供。此外，可以包括描述试剂盒内的组合物的用途的说明材料。
[0086]
如本文所用，术语“连接的”是指两个或多个分子的缔合。联接可以是共价的或非共价的。联接也可以是遗传的(即，重组融合的)。此类联接可以使用多种本领域公认的技术，诸如化学缀合和重组蛋白生产来实现。
[0087]
在一些实施方案中，“接头”可以指连接两个蛋白质、多肽、肽、域、区或基序的氨基酸序列，并且可以提供与两个子结合域的相互作用相容的间隔区功能，使得所得多肽保留对靶分子的特异性结合亲和力(例如，sctcr)或保留信号传导活性(例如，tcr复合物)。在一些实施方案中，接头包含约两个至约35个氨基酸，例如或约四个至约20个氨基酸或约八个至约15个氨基酸或约15个至约25个氨基酸。
[0088]“主要组织相容性复合物”(mhc)是指将肽抗原递送至细胞表面的糖蛋白。mhc i类分子是具有跨越膜的a链(具有三个a域)和非共价缔合的b2微球蛋白的异二聚体。mhc ii类分子由两种跨膜糖蛋白a和b构成，这两者均跨越膜。每个链具有两个域。mhc i类分子将起源于胞质溶胶的肽递送至细胞表面，在此肽抗原-mhc(pmhc)复合物由cd8
+ t细胞识别。mhc ii类分子将起源于囊泡系统的肽递送至细胞表面，在此其由cd4
+ t细胞识别。人mhc被称为人白细胞抗原(hla)。
[0089]
术语“阻止”、“防止”、“预防”、“防治性治疗”以及等等是指降低受试者发展疾病、病症或病况的可能性，该受试者不患有，但有风险或易患疾病、病症或病况。
[0090]
术语“预后”包括对病毒感染的可能过程和结局或从疾病中恢复的可能性的预测。在一些实施方案中，统计算法的使用提供个体中病毒感染的预后。例如，预后可以是手术、病毒感染的临床亚型的发展、一种或多种临床因素的发展或疾病的恢复。
[0091]
如本文所用，氨基酸序列之间的“同一性百分比”与“同源性百分比”同义，这可以使用由karlin and altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:5873-5877修改的karlin and altschul(1990)proc.natl.acad.sci.usa 87:2264-2268的算法来确定。注意到的算法纳入altschul et al.(1990)j.mol.biol.215:403-410的nblast和xblast程序中。blast核苷酸搜索用nblast程序执行，得分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的多核苷酸同源的核苷酸序列。用xblast程序执行blast蛋白搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与参考多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如altschul et al.(1997)nuc.acids res.25:3389-3402所述，利用gapped blast。当利用blast和gapped blast程序时，可以使用相应程序的默认参数(例如xblast和nblast)。
[0092]
短语“药学上可接受的载剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包囊材料，参与从一个器官或身体部分携带或运输主题化合物至另一器官或身体部分。
[0093]
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指包含非天然存在于细胞中的核酸的细胞，诸如已引入重组表达载体的细胞。应当理解，根据本发明的细胞不仅旨在指特定的主题细胞，而且还涵盖此类细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而发生在后续世代中，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语根据本发明的细胞的范围内。
[0094]
术语“癌症响应”、“对免疫疗法的响应”或“对t细胞介导的细胞毒性/免疫疗法联合疗法的调节剂的响应”涉及过度增殖性病症(例如，癌症)对癌剂，诸如t细胞介导的细胞毒性的调节剂和免疫疗法的任何响应，优选地在新辅助或辅助疗法开始后肿瘤质量和/或体积的变化。术语“新辅助治疗”是指在初级治疗之前给予的治疗。新辅助疗法的实例可以包括化学疗法、放射疗法和激素疗法。可以评估过度增殖性病症响应，例如针对功效或在新辅助或辅助情况下，其中可以将系统干预后的肿瘤大小与初始大小和尺寸进行比较，如通过ct、pet、乳房x线照片、超声或触诊所测量的。还可以通过在生检或手术切除后对肿瘤进行的卡尺测量或病理检查来评估响应。响应可以以定量方式，如肿瘤体积的百分比变化记录，或以定性方式，如“病理完全响应”(pcr)、“临床完全缓解”(ccr)、“临床部分缓解”(cpr)、“临床疾病稳定”(csd)、“临床进行性疾病”(cpd)或其他定性标准记录。过度增殖性病症响应的评估可以在新辅助或辅助疗法开始后的早期，例如在数小时、数天、数周之后或优选地数月之后完成。响应评估的典型终点是新辅助化学疗法终止时或手术除去残留肿瘤细胞和/或瘤床时。这典型地是在新辅助疗法开始后三个月。在一些实施方案中，可以通过测量临床获益率(cbr)来确定本文所述治疗性治疗的临床功效。临床获益率通过在疗法结束后至少6个月的时间点确定处于完全缓解(cr)的患者的百分比、处于部分缓解(pr)的患者的数目和疾病稳定(sd)的患者的数目的总和来测量。此公式的简写为cbr＝6个月内的cr+pr+sd。在一些实施方案中，特定癌症治疗方案的cbr为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多。用于评价对癌症疗法的响应的其他标准与“生存”相关，其包括以下所有：生存至死亡，也称为总体生存(其中所述死亡可以与原因无关或与肿瘤相关)；“无复发生存”(其中术语复发应包括局部复发和远端复发)；无转移生存；无疾病生存(其中术语疾病应包括癌症和与之相关联的疾病)。所述生存的长度可以通过参考定义的起点(例如，诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如，死亡、复发或转移)来计算。此外，治疗功效的标准可以扩大到包括对化学疗法的响应、生存的概率、给定时间段内转移的概率和肿瘤复发的概率。例如，为了确定适当的阈值，特定的癌症治疗方案可以施用于受试者群体，并且可以将结局与在施用任何癌症疗法之前确定的生物标志物测量相互关联。结局测量可以是对新辅助治疗的病理响应。替代地，可以在生物标志物测量值已知的癌症疗法后的一段时间内监测受试者的结局测量，诸如总体生存和无病生存。在某些实施方案中，施用的剂量是本领域已知的癌症治疗剂的标准剂量。监测受试者的时间段可能有所不同。例如，可以监测受试者达至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。与癌症疗法的结局相关的生物标志物测量阈值可以使用本领域熟知的方法来确定，诸如实施例部分中描述的那些。
[0095]
如所指示的，这些术语还可以指改善的预后，例如，如增加的至复发的时间(这是审查第二原发性癌症作为第一事件或没有复发迹象的死亡的至首次复发的时期)或增加的总体生存(其是从治疗到因任何原因死亡的时间)所反映的。响应或具有响应意味着当暴露于刺激时达到有益的终点。替代地，负面或有害症状在暴露于刺激时被最小化、减轻或减弱。应当理解，评价肿瘤或受试者将表现出有利响应的可能性等同于评价肿瘤或受试者将不表现出有利响应(即，将表现出缺乏响应或无响应性)的可能性。
[0096]
术语“抗性”是指癌症样品或哺乳动物对癌症疗法的获得性或天然抗性(即，对治疗性治疗无响应性或具有降低或有限的响应)，诸如对治疗性治疗具有降低了5％、10％、
15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，诸如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端值)的响应。响应的降低可以通过与获得抗性之前的相同癌症样品或哺乳动物进行比较，或通过与已知对治疗性治疗没有抗性的不同癌症样品或哺乳动物进行比较来测量。典型的获得性化学疗法抗性称为“多药抗性(multidrug resistance)”。多药抗性可能由p-糖蛋白介导，或可能由其他机制介导，或者其可能在哺乳动物感染多药抗性微生物或微生物的组合时发生。对治疗性治疗的抗性的确定在本领域是常规的并且在普通临床医师的技能范围内，例如，可以通过如本文描述为“敏化”的细胞增殖测定和细胞死亡测定来测量。在一些实施方案中，术语“逆转抗性”是指在其中与未治疗肿瘤的肿瘤体积相比，单独的初级癌症疗法(例如，化学疗法或放射疗法)不能产生统计上显著的肿瘤体积减小的情况下，当与未治疗肿瘤的肿瘤体积相比时，使用第二剂联合初级癌症疗法(例如，化学疗法或放射疗法)能够在统计学显著性水平上产生肿瘤体积的显著减小(p《0.05)。这通常适用于在未治疗的肿瘤呈对数生长时进行的肿瘤体积测量。
[0097]
用于检测或确定至少一种生物标志物的不存在、存在或水平的术语“样品”典型地是脑组织、脑脊髓液、全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便(stool)(例如大便(feces))、泪液、和任何其他体液(例如，如上文“体液”定义下所述)，或组织样品(例如，生检)，诸如小肠、结肠样品或手术切除组织。在一些实施方案中，本发明所涵盖的方法进一步包括在检测或确定样品中至少一种标记物的不存在、存在或水平之前从个体获得样品。
[0098]
术语“敏化”是指以允许用癌症疗法(例如抗免疫检查点、化学疗法和/或放射疗法)更有效地治疗相关联癌症的方式改变癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方案中，正常细胞没有受影响到导致正常细胞被治疗过度损伤的程度。对治疗性治疗的增加的敏感性或降低的敏感性根据本领域已知的特定治疗和下文描述的方法来测量，包括但不限于细胞增殖测定(tanigawa et al.(1982)cancer res.42:2159-2164)和细胞死亡测定(weisenthal et al.(1984)cancer res.94:161-173；weisenthal et al.(1985)cancer treat rep.69:615-632；weisenthal et al.,in:kaspers g j l,pieters r,twentyman p r,weisenthal l m,veerman a j p编.drug resistance in leukemia and lymphoma.langhorne,p a:harwood academic publishers,1993:415-432；weisenthal(1994)contrib.gynecol.obstet.19:82-90)。还可以通过测量一段时间内肿瘤大小的减小来测量动物的敏感性或抗性，例如，人为6个月且小鼠为4-6周。如果与不存在此类组合物或方法的情况下的治疗敏感性或抗性相比，治疗敏感性的增加或抗性的降低为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，诸如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，则此类组合物或方法使对治疗性治疗的响应敏化。对治疗性治疗的敏感性或抗性的确定在本领域中是常规的并且在普通临床医师的技能范围内。应当理解，本文所述的用于增强癌症疗法功效的任何方法可以同样应用于用于使过度增殖或其他癌性细胞(例如，抗性细胞)对癌症疗法敏化的方法。
[0099]
术语“小分子”是本领域的术语并且包括小于约1000分子量或小于约500分子量的分子。在一个实施方案中，小分子不仅仅包含肽键。在另一个实施方案中，小分子不是寡聚的。可以筛选活性的示例性小分子化合物包括但不限于肽、肽模拟物、核酸、碳水化合物、有
机小分子(例如聚酮化合物)(cane et al.(1998)science 282:63-68)，和天然产物提取物文库。在另一个实施方案中，化合物是小的有机非肽化合物。在进一步的实施方案中，小分子不是生物合成的。
[0100]
术语“特异性结合”是指与预定的抗原结合的结合蛋白。典型地，当使用感兴趣抗原作为分析物且结合蛋白作为配体通过结合测定，诸如biacore分析仪器中的表面等离子共振(spr)技术确定时，结合蛋白以近似地小于或等于约5x10-4
m、小于或等于约1x10-4
m、小于或等于约5x10-5
m、小于或等于约1x10-5
m、小于或等于约5x10-6
m、小于或等于约1x10-6
m、小于或等于约5x10-7
m、小于或等于约1x10-7
m、小于或等于约5x10-8
m、小于或等于约1x10-8
m、小于或等于约5x10-9
m、小于或等于约1x10-9
m、小于或等于约5x10-10
m、小于或等于约1x10-10
m、小于或等于约5x10-11
m、小于或等于约1x10-11
m、小于或等于约5x10-12
m、小于或等于约1x10-12
m，甚至更低，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如约1-50微摩尔、1-100微摩尔、0.1-500微摩尔以及等等的亲和力结合。在一些实施方案中，结合蛋白以比其与不同于预定抗原或密切相关抗原的非特异性抗原(例如，bsa、酪蛋白)结合的亲和力的至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10.0倍或更大的亲和力与预定抗原结合。短语“识别抗原的结合蛋白”和“对抗原具有特异性的结合蛋白”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的结合蛋白”互换使用。选择性结合是相对术语，是指结合蛋白区别一种抗原与另一种抗原的结合，诸如特定家族成员或抗原靶标与相关家族成员或抗原靶标的结合的能力。例如，实施力部分提供的分析性数据表明，本文所述的结合蛋白特异性结合ha-1免疫原性表位和/或选择性结合许多相关表位(例如，ha-1免疫原性表位和密切相关的序列)，从而将此类靶标与人基因组中可用的绝大多数其他可能的表位相区别。
[0101]
术语“受试者”是指任何健康的动物、哺乳动物或人，或患有以表达ha-1抗原为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的任何动物、哺乳动物或人。术语“受试者”可与“患者”互换。
[0102]
术语“生存”包括以下所有：生存至死亡，也称为总体生存(其中所述死亡率可以与原因无关或与肿瘤相关)；“无复发生存”(其中术语复发应包括局部复发和远端复发)；无转移生存；无疾病生存(其中术语疾病应包括癌症和与之相关联的疾病)。所述生存的长度可以通过参考定义的起点(例如，诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如，死亡、复发或转移)来计算。此外，治疗功效的标准可以扩大到包括对化学疗法的响应、生存的概率、给定时间段内转移的概率和肿瘤复发的概率。
[0103]
术语“协同效应”是指大于单独癌症剂/疗法的单独作用的两种或多种剂(例如，本文所述的ha-1相关剂和用于治疗以ha-1表达为特征的病症的另一种疗法)的联合效应。
[0104]
如本文所用，术语“t细胞介导的应答”是指由t细胞介导的应答，包括效应t细胞(例如，cd8
+
细胞)和辅助t细胞(例如，cd4
+
细胞)。t细胞介导的应答包括，例如，t细胞细胞毒性和增殖。
[0105]“转录的多核苷酸”或“核苷酸转录物”是多核苷酸(例如，mrna、hnrna、cdna或此类rna或cdna的类似物)，其与通过生物标志物核酸的转录和rna转录物的正常转录后加工(如果有的话)和rna转录物的逆转录制成的成熟mrna的全部或部分互补或同源。
[0106]“t细胞”是在胸腺中成熟并产生t细胞受体(tcr)的免疫系统细胞。t细胞可能是初
始的(未暴露于抗原；与t
cm
相比，cd62l、ccr7、cd28、cd3、cd 127和cd45ra的表达增加且cd45ro的表达减少)、记忆t细胞(tm)(经历抗原的且长命的)和效应细胞(经历抗原的、细胞毒性的)。tm可以进一步分为中央记忆t细胞子集(t
cm
，与初始t细胞相比，cd62l、ccr7、cd28、cd127、cd45ro和cd95表达增加且cd54ra表达减少)和效应记忆t细胞(t
em
，与初始t细胞或t
cm
相比，cd62l、ccr7、cd28、cd45ra的表达减少且cd127的表达增加)。效应t细胞(te)是指经历抗原的cd8+细胞毒性t淋巴细胞，其与t
cm
相比具有降低的cd62l、ccr7、cd28的表达并且颗粒酶和穿孔素呈阳性。其他示例性t细胞包括调节性t细胞，诸如cd4
+
cd25
+
(foxp3
+
)调节性t细胞和treg17细胞，以及tr1、th3、cd8
+
cd28和qa-1限制性t细胞。
[0107]
常规t细胞，也称为tconv或teff，具有效应物功能(例如，细胞因子分泌、细胞毒活性、抗自我识别以及等等)，以凭借其一种或多种t细胞受体的表达来增加免疫应答。tcon或teff通常定义为不是treg的任何t细胞群，并且包括例如初始t细胞、活化t细胞、记忆t细胞、静息tcon或已朝向例如th1或th2谱系分化的tcons。在一些实施方案中，teff是非tregt细胞的子集。在一些实施方案中，teff是cd4+ teff或cd8+ teff，诸如cd4+辅助性t淋巴细胞(例如，th0、th1、tfh或th17)和cd8+细胞毒性t淋巴细胞。如本文进一步描述的，细胞毒性t细胞是cd8+ t淋巴细胞。“初始tcon”是已在骨髓中分化，并在胸腺中成功地经历中央选择的阳性和阴性过程，但尚未通过暴露于抗原而被激活的cd4
+ t细胞。初始tcon的特征通常在于l-选择素(cd62l)的表面表达，不存在活化标志物诸如cd25、cd44或cd69，以及不存在记忆标志物诸如cd45ro。因此，初始tcon被认为是静止的和非分裂的，需要白细胞介素7(il-7)和白细胞介素15(il-15)来稳态生存(参见，至少wo 2010/101870)。在抑制免疫应答的背景下，此类细胞的存在和活性是不期望的。与treg不同，tcon不是无变应性的，并且可以应答于基于抗原的t细胞受体激活而增殖(lechler et al.(2001)philos.trans.r.soc.lond.biol.sci.356:625-637)。
[0108]“t效应”(“t
eff”或“t
e”)细胞是指具有细胞溶解活性的t细胞(例如，cd4+和cd8+ t细胞)以及t辅助(th)细胞，其分泌细胞因子并激活和引导其他免疫细胞，但不包括调节性t细胞(treg细胞)。
[0109]“t细胞受体”或“tcr”是指免疫球蛋白超家族成员(具有可变结合域、恒定域、跨膜区和短胞质尾；参见，例如，janeway et al.(1997)curr.biol.publ.4:33)，其能够与结合至mhc受体的抗原肽结合(例如特异性和/或选择性地)。tcr可以在细胞表面或以可溶形式发现，并且通常包含具有α和β链(也分别称为tcrα和tcrβ)，或γ和δ链(也分别称为tcrγ和tcrδ)的异二聚体。与免疫球蛋白(例如抗体)一样，tcr链的细胞外部分(例如，α链和β链)含有两个免疫球蛋白域：在n端末端的可变域(例如，α链可变域或v
α
和β链可变域或v
β
；典型地基于kabat编号的氨基酸1至116(kabat et al.(1991)"sequences of proteins of lmmunological interest,usdept.health and human services,public health service national institutes of health,第5版)，和在c端末端且与细胞膜相邻的一个恒定域(例如，α链恒定域或c
α
，典型地基于kabat的氨基酸117至259，β链恒定域或c
β
，典型地基于kabat的氨基酸117至295)。还与免疫球蛋白一样，可变域含有由框架区(“fr”)分开的互补决定区(“cdr”，也称为高变区或“hvr”)(参见，例如，fores et al.(1990)proc.natl.acad sci.us.a.87:9138；chothia et al.(1988)embo j.7:3745；lefranc et al.(2003)dev.comp.immunol.27:55)。在一些实施方案中，tcr在t细胞(或t淋巴细胞)的表面发现并
al.(2009)blood 114:4099-4107)。估计每条β链与至少25条不同的α链配对，从而生成进一步的多样性(arstila et al.(1999)science 286:958-961)。
[0115]
术语“tcrα可变域”是指trav和traj区的串联；仅trav区；或trav和部分traj区，并且术语tcrα恒定域是指细胞外trac区，或c端截短的或全长的trac序列。同样，术语“tcrβ可变域”是指trbv和trbd/trbj区的串联；仅trbv和trbd区；仅trbv和trbj地区；或trbv和部分trbd和/或trbj区，并且术语tcrβ恒定域指细胞外trbc区，或c端截短的或全长的trbc序列。这些tcrα可变域和tcrβ可变域命名法类似地分别适用于γ/δtcr的tcrγ和tcrδ链的可变域。普通技术人员可以获得trav、traj、trac、trbv、trbj和trbc基因序列，诸如通过可公开获得的imgt数据库。
[0116]
术语“tcr复合物”是指由cd3与tcr的缔合形成的复合物。例如，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同二聚体、tcrα链和tcrβ链构成。替代地，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同源二聚体、tcrγ链和tcrδ链构成。
[0117]
术语“治疗作用”是指由药理活性物质引起的动物，特别是哺乳动物，更特别是人的局部或全身作用。因此，该术语意指旨在用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或用于增强动物或人的期望身体或心理发育和状况的任何物质。
[0118]
术语“治疗有效量”和“有效量”意指以适用于任何治疗的合理的益处/风险比在动物的至少一个细胞亚群中产生一些期望作用，诸如期望的局部或全身治疗作用的物质的量。在一些实施方案中，物质的治疗有效量将取决于物质的治疗指数、溶解度、药代动力学、半衰期以及等等。主题化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学规程(例如用于确定ld
50
和ed
50
)来确定。在一些实施方案中，使用表现出大治疗指数的组合物。在一些实施方案中，在一些实施方案中，可以测量ld
50
(致死剂量)，并且相对于不施用药剂，该药剂的ld
50
可以例如降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。类似地，可以测量ed
50
(即，实现症状的半数最大抑制的浓度)并且相对于不施用药剂，该药剂的ed
50
可以例如增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。而且，类似地，可以测量ic
50
，并且相对于不施用药剂，该药剂的ic
50
可以例如增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。在一些实施方案中，测定中的t细胞免疫应答可以增加了至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％。在另一个实施方案中，可以实现病毒载量至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％的降低。
[0119]
术语“治疗”是指对感兴趣的病况(例如，疾病或病症)的治疗性管理或改善。治疗可以包括但不限于向受试者施用药剂或组合物(例如，药物组合物)。典型地进行治疗以努力以对受试者有益的方式改变疾病(该术语用于指示需要或潜在需要治疗的任何疾病、病症、综合征或不良状况)的进程。治疗的效果可以包括对疾病或疾病的一种或多种症状或表现进行逆转、减轻、降低其严重性、延迟其发作、治愈、抑制其进展和/或降低其发生或复发的可能性。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任
何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改进或缓解疾病状态、以及缓和或改善的预后。可以将治疗剂施用于患有疾病或相对于普通人群的成员处于增加的发展疾病的风险中的受试者。在一些实施方案中，治疗剂可以施用于已患有疾病但不再表现出疾病迹象的受试者。可以施用药剂以例如降低明显疾病复发的可能性。可以防治性地施用治疗剂，即在发展疾病的任何症状或表现之前施用。“防治性治疗”是指向尚未发展疾病或未表现出疾病迹象的受试者提供医疗和/或手术管理，以便例如降低疾病将发生的可能性或降低疾病一旦发生的严重性。受试者可能已鉴定为处于发展疾病的风险中(例如，相对于一般人群处于增加的风险中)或具有增加发展疾病的可能性的风险因素。
[0120]
术语“无响应性”包括癌细胞对疗法的折射性或治疗性细胞(诸如免疫细胞)对刺激(例如，经由激活受体或细胞因子的刺激)的折射性。无响应性可能发生，例如，由于暴露于免疫抑制剂或暴露于高剂量抗原。如本文所用，术语“无变应性”或“耐受性”包括对激活受体介导的刺激的折射性。此类折射性通常是抗原特异性的，并且在已停止暴露于耐受抗原后仍然存在。例如，t细胞的无变应性(与无响应性相反)的特征在于细胞因子产生，例如il-2的缺乏。当t细胞暴露于抗原并在不存在第二信号(共刺激信号)的情况下接收第一信号(t细胞受体或cd-3介导的信号)时，t细胞无变应性发生。在这些条件下，细胞再次暴露于同一抗原(即使再次暴露发生在共刺激多肽的存在下)导致不能产生细胞因子，并且因此不能增殖。然而，如果与细胞因子(例如il-2)一起培养，无变应性t细胞可能增殖。例如，t细胞无变应性也可以通过t淋巴细胞的il-2产生的缺乏来观察，如通过elisa或通过使用指示细胞系的增殖测定所测量的。替代地，可以使用报告基因构建体。例如，无变应性t细胞不能启动由5’il-2基因增强子控制下的异源启动子或增强子中可能存在的ap1序列的多聚体诱导的il-2基因转录(kang et al.(1992)science 257:1134)。
[0121]
术语“可变区”或“可变域”是指参与免疫球蛋白超家族结合蛋白(例如tcr)与抗原结合的免疫球蛋白超家族结合蛋白的域(例如，tcrα链或β链(或γδtcr的γ链和δ链)。天然tcr的α链和β链的可变域(分别为v
α
和v
β
)通常具有类似的结构，每个域包含四个保守框架区(fr)和三个cdr。v
α
域由两个单独的dna区段(可变基因区段和连接基因区段(v-j))编码；v
β
域由三个单独的dna区段(可变基因区段、多样性基因区段和连接基因区段(v-d-j))编码。单个v
α
或v
β
域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的tcr可以使用来自结合抗原的tcr的v
α
或v
β
域分离，以分别筛选互补v
β
或v
β
域的文库。
[0122]
术语“载体”是指能够运输与其连接的另一核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体是附加体，即能够进行染色体外复制的核酸。在一些实施方案中，载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。能够引导与其可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，重组dna技术中有用的表达载体通常是“质粒”的形式，质粒一般指环状双链dna环，其在它们的载体形式中不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，正如本领域技术人员将理解的，本发明旨在包括具有等效功能并随后在本领域中已知的此类其他形式的表达载体。
[0123]
特定蛋白质的氨基酸序列与可以编码该蛋白质的核苷酸序列之间存在已知且明确的对应关系，如遗传密码(如下所示)所定义。同样，特定核酸的核苷酸序列与由该核酸编码的氨基酸序列之间存在已知且明确的对应关系，如遗传密码所定义。
[0124]
遗传密码
[0125]
丙氨酸(ala,a)gca,gcc,gcg,gct
[0126]
精氨酸(arg,r)aga,acg,cga,cgc,cgg,cgt
[0127]
天冬酰胺(asn,n)aac,aat
[0128]
天冬氨酸(asp,d)gac,gat
[0129]
半胱氨酸(cys,c)tgc,tgt
[0130]
谷氨酸(cys,c)tgc,tgt
[0131]
谷氨酰胺(gln,q)caa,cag
[0132]
甘氨酸(gly,g)gga,ggc,ggg,ggt
[0133]
组氨酸(his,h)cac,cat
[0134]
异亮氨酸(ile,i)ata,atc,att
[0135]
亮氨酸(leu,l)cta,ctc,ctg,ctt,tta,ttg
[0136]
赖氨酸(lys,k)aaa,aag
[0137]
甲硫氨酸(met,m)atg
[0138]
苯丙氨酸(phe,f)ttc,ttt
[0139]
脯氨酸(pro,p)cca,ccc,ccg,cct
[0140]
丝氨酸(ser,s)agc,agt,tca,tcc,tcg,tct
[0141]
苏氨酸(thr,t)aca,acc,acg,act
[0142]
色氨酸(trp,w)tgg
[0143]
酪氨酸(tyr,y)tac,tat
[0144]
缬氨酸(val,v)gta,gtc,gtg,gtt
[0145]
终止信号(结束)taa,tag,tga
[0146]
遗传密码的重要和众所周知的特征是它的冗余性，由此，对于用于制备蛋白质的大多数氨基酸，可以使用多于一个编码核苷酸三联体(如上所例示)。因此，许多不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。此类核苷酸序列被认为是功能上等同的，因为它们导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可能比翻译其他序列更高效地翻译一些序列)。此外，偶尔可以在给定的核苷酸序列中发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。此类甲基化不影响三核苷酸密码子和相应氨基酸之间的编码关系。
[0147]
鉴于前述，使用遗传密码将dna或rna翻译成氨基酸序列，编码生物标志物核酸(或其任何部分)的dna或rna的核苷酸序列可以用于衍生多肽氨基酸序列。同样，对于多肽的氨基酸序列，可以从遗传密码中推导出相应的可以编码该多肽的核苷酸序列(由于其冗余性，对于任何给定的氨基酸序列将产生多个核酸序列)。因此，本文对编码多肽的核苷酸序列的描述和/或公开应当被认为还包括对由该核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地，本文对多肽氨基酸序列的描述和/或公开应当被认为还包括对可以编码该氨基酸序列的所有可能核苷酸序列的描述和/或公开。
[0148]
ii.结合蛋白
[0149]
在本发明所涵盖的方面，本文提供了与肽-mhc(pmhc)复合物结合(例如，特异性和/或选择性地)的结合蛋白，该肽-mhc(pmhc)复合物包含在mhc分子(例如，mhc i类分子)的背景下的ha-1免疫原性肽。在一些实施方案中，-结合蛋白能够以小于或等于约5x10-4
m、
小于或等于约1x10-4
m、小于或等于约5x10-5
m、小于或等于约1x10-5
m、小于或等于约5x10-6
m、小于或等于约1x10-6
m、小于或等于约5x10-7
m、小于或等于约1x10-7
m、小于或等于约5x10-8
m、小于或等于约1x10-8
m、小于或等于约5x10-9
m、小于或等于约1x10-9
m、小于或等于约5x10-10
m、小于或等于约1x10-10
m、小于或等于约5x10-11
m、小于或等于约1x10-11
m、小于或等于约5x10-12
m、小于或等于约1x10-12
m，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如约1-50微摩尔、1-100微摩尔、0.1-500微摩尔以及等等的kd与ha-1肽-mhc(pmhc)复合物结合(例如，特异性和/或选择性地)。在一些实施方案中，mhc分子包含为hla血清型hla-a*02的mhcα链。在一些实施方案中，hla等位基因选自由hla-a*0201、hla-a*0202、hla-a*0203、hla-a*0205、hla-a*0206和hla-a*0207等位基因组成的组。在具体实施方案中，hla等位基因是hla-a*0201。在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白是遗传工程化的、分离的和/或纯化的。
[0150]
在一些实施方案中，结合蛋白对ha-1肽-mhc(pmhc)的结合亲和力比已知的t细胞受体(例如，本文所述的fred hutchinson tcr)高。例如，结合蛋白可以具有比已知的t细胞受体(例如，本文所述的fred hutchinson tcr)高至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍、5000倍、10000倍、50000倍、100000倍、500000倍、1000000倍或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如1.2倍至2倍的对ha-1肽-mhc(pmhc)的结合亲和力。
[0151]
在一些实施方案中，当与ha-1表达处于一定水平或以下的靶细胞接触时，结合蛋白与已知的t细胞受体(例如，本文所述的fred hutchinson tcr)相比诱导更高的t细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤。例如，在本文所述的任何方面的一些实施方案中，ha-1水平可以用每百万转录物来表示，并且可以例如小于或等于约1,000个转录物/百万个转录物(tpm)、950tpm、900tpm、850tpm、800tpm、750tpm、700tpm、650tpm、600tpm、550tpm、500tpm、450tpm、400tpm、350tpm、300tpm、250tpm、200tpm、150tpm、100tpm、95tpm、90tpm、85tpm、80tpm、75tpm、70tpm、65tpm、60tpm、55tpm、50tpm、45tpm、40tpm、35tpm、34tpm、33tpm、32tpm、31tpm、30tpm、29tpm、28tpm、27tpm、26tpm、25tpm、24tpm、23tpm、22tpm、21tpm、20tpm、19tpm、18tpm、17tpm、16tpm、15tpm、14tpm、13tpm、12tpm、11tpm、10tpm、9tpm、8tpm、7tpm、6tpm、5tpm、4tpm、3tpm、2tpm和1tpm，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如小于或等于约1,000tpm至小于或等于约35tpm。在一些实施方案中，低ha-1表达水平称为“杂合表达”，意指在约1tpm和约35tpm之间，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如32tpm或1-32tpm。较高的表达是36tpm和更高。如本文进一步描述的，tpm是根据众所周知的技术，诸如rna-seq测量的，并且对于多种细胞系、组织类型以及等等，基因表达tpm数据在本领域是众所周知的(参见，例如，万维网上portals.broadinstitute.org下的broad研究所癌细胞系百科全书(broad institute cancer cell line encyclopedia，ccle))。在一些实施方案中，当与具有ha-1的杂合表达的靶细胞接触时，结合蛋白与已知的t细胞受体(例如本文所述的fred hutchinson tcr)相比诱导t细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤的至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90
倍、100倍、1000倍或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如1.2倍至2倍增加。
[0152]
在一些实施方案中，使用rna测序(rna-seq)检测ha-1的表达。rna-seq一般包括以下步骤：获得含有遗传物质的样品，从获得的样品中分离总rna，从总rna制备扩增的cdna文库，对扩增的cdna文库进行测序，以及对扩增的cdna进行分析和概况分析(profiling)以评估不同转录物的表达水平。样品可以是细胞群、组织样品、生检样品、细胞培养物或单个细胞。可以使用本领域已知的任何方法从生物样品中分离总rna。在某些实施方案中，总rna是从血浆中提取的。血浆rna提取描述于enders et al.,“the concentration of circulating corticotropin-releasing homer mrnain material plasma is inclined in preclampsia,”clinr中。如其中所述，将离心步骤后收集的血浆与trizol ls试剂(invitrogen)和氯仿混合。将混合物离心并将水层转移到新管中。向该水层中添加乙醇。然后将混合物置于rneasy微型柱(qiagen)中并根据制造商的建议进行处理。
[0153]
在一些实施方案中，本文所述的rna-seq包括从总rna制备扩增的cdna的步骤。例如，制备cdna并在不稀释的情况下随机扩增分离的rna样品，或者将分离的rna中的遗传物质的混合物分散到各个反应样品中。在某些实施方案中，样品的中扩增在3’末端和整个转录组中随机启动，以扩增mrna和非聚腺苷酸化转录物两者。通过这种方式，双链cdna扩增产物经优化用于下一代测序平台的测序文库的生成。适用于通过本发明所涵盖的方法扩增cdna的试剂盒包括，例如，rna-seq system。
[0154]
在一些实施方案中，本文所述的rna-seq包括对扩增的cdna进行测序的步骤。可以使用任何已知的测序方法对扩增的cdna混合物进行测序，包括单个分子测序方法。在某些实施方案中，扩增的cdna通过全转录组鸟枪法测序进行测序。全转录组鸟枪法测序可以使用各种下一代测序平台诸如genome analyzer平台、abi solid
tm sequencing平台或life science的454 sequencing平台执行。
[0155]
在一些实施方案中，本文所述的rna-seq进一步包括对cdna进行数字计数和分析。扩增的样品中的每个转录物的扩增序列数量可以通过序列读段(每个扩增链一个读段)进行量化。在一些实施方案中，使用每百万转录物(tpm)来量化特定转录物的表达水平。tpm可以如wagner et al.(2012)theory in biosciences 131:281-285中所示进行计算，其内容通过引用整体并入本文。
[0156]
在一些实施方案中，结合蛋白不与ha-1r肽-mhc(pmhc)复合物结合，其中ha-1r肽包含氨基酸序列vlrddllea。
[0157]
在一些实施方案中，结合蛋白不与ccdc114肽-mhc(pmhc)复合物结合。
[0158]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括(例如包含、基本上由以下组成或由以下组成)：a)tcrα链序列，其与选自由表1中所列tcrα链序列组成的组的tcrα链序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性；和/或b)tcrβ链序列，其与选自由表1中所列tcrβ链序列组成的组的tcrβ链序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
[0159]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括(例如包含、基本上由以下组成或由以下组成)：a)选自由表1中所列的tcrα链序列组成的组的tcrα链序列；和/或b)选自由表1中所列的tcrβ链序列组成的组的tcrβ链序列。
[0160]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括(例如包含、基本上由以下组成或由以下组成)：a)tcrα链可变(v
α
)域序列，其与选自由表1中所列tcr v
α
域序列组成的组的tcrα链可变(v
α
)域序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性；和/或b)tcrβ链可变(v
β
)域序列，其与选自由表1中所列tcr v
β
域序列组成的组的tcrβ链可变(v
β
)域序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
[0161]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：a)tcrα链可变(v
α
)域序列，其选自由表1中所列的tcr v
α
域序列组成的组；和/或b)tcrβ链可变(v
β
)域序列，其选自由表1中所列的tcr v
β
域序列组成的组。
[0162]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括(例如，包含至少一种(例如，一种、两种或三种，诸如单独或与cdr1和cdr2组合的cdr3)、基本上由其组成或由其组成)tcrα链互补决定区(cdr)序列，其与选自由表1中所列tcrα链cdr序列组成的组的tcrα链cdr序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。cdr3被认为是负责识别经加工抗原的主要cdr并且cdr1和cdr2主要与mhc相互作用，因此，在一些实施方案中，提供了结合蛋白，其包含来自tcrα链的单独cdr3和/或来自表1中所列的tcrβ链的单独cdr3，每个cdr3具有如本段中所述的序列同源性。
[0163]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白还可以包括(例如，包含至少一种(例如，一种、两种或三种，例如单独与cdr1和cdr2组合的cdr3)、基本上由其组成或由其组成)tcrβ链互补决定区(cdr)序列，其与选自由表1中所列tcrβ链cdr序列组成的组的tcrβ链cdr序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。如上所述，cdr3被认为是负责识别经加工抗原的主要cdr并且cdr1和cdr2主要与mhc相互作用，因此，在一些实施方案中，提供了结合蛋白，其包含来自tcrβ链的单独cdr3和/或来自表1中所列的tcrα链的单独cdr3，每个cdr3具有如本段中所述的序列同源性。
[0164]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括(例如，包含至少一个(例如，一个、两个或三个)、基本上由其组成或由其组成)表1中所列的tcrα链互补决定区(cdr)。
[0165]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白还可以包括(例如，包含至少一个(例如，一个、两个或三个)、基本上由其组成或由其组成)表1中所列的tcrβ链互补决定区(cdr)。
[0166]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：tcrα链恒定区(c
α
)序列，其与表1中所列的tcr cα序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
[0167]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白还可以包括(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：tcrβ链恒定区(c
β
)序列，其与表1中所列的tcr c
β
序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
[0168]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括(例如，包含、基本上由以下组成或
由以下组成)：tcrα链恒定区(c
α
)序列，其选自由tcr c
α
表1中所列的序列组成的组。
[0169]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白还可以包括(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：tcrβ链恒定区(c
β
)序列，其选自由tcr c
β
表1中所列的序列组成的组。
[0170]
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包含嵌合的、人源化的、人的、灵长类动物或啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)的恒定区。例如，人可变区可以与鼠恒定区嵌合，或者鼠可变区可以与人恒定区和/或人框架区人源化。在一些实施方案中，可以突变恒定区以修饰功能(例如，在tcrα和β链的相对残基位置引入非天然存在的半胱氨酸取代以提供对增加tcrα和β链之间的亲和力有用的二硫键)。类似地，可以在恒定区的跨膜域中进行突变以修饰功能(例如，通过引入非天然存在的具有疏水性氨基酸的残基取代来增加疏水性)。在一些实施方案中，可以对恒定区进行突变以增加细胞表面表达。
[0171]
表1
[0172]
ha1-tsc-100野生型序列(与“tcr-100a”相同的cdr)：
[0173]
α链：
[0174]
trav21/traj40/trac
[0175][0175][0176]
β链：
[0177]
trbv7-9/trbj2-3/trbc1
[0178][0179]
ha1-tsc-100 cdtm序列(也称为“tcr-100a”)：
[0180]
α链：
[0181]
trav21/traj40
[0182][0183]
β链：
[0184]
trbv7-9/trbj2-3
[0185][0186]
ha1-1-12 cdtm序列：
[0187]
α链：
[0188]
trav20/traj52
[0189][0190]
β链：
[0191]
trbv5-5/trbj1-2
[0192][0193]
ha1-9-46 cdtm序列：
[0194]
α链：
[0195]
trav13-1/traj43
[0196][0197]
β链：
[0198]
trbv7-9/trbj2-1
[0199][0200]
ha1-9-105 cdtm序列：α链：
[0201]
trav13-1/traj26
[0202][0203]
β链：
[0204]
trbv7-9/trbj1-1
[0205][0206]
ha1-10-104 cdtm序列：
[0207]
α链：
[0208]
trav8-3/traj52
[0209][0210]
β链：
[0211]
trbv6-2/trbj2-1
[0212][0213]
ha1-10-93 cdtm序列：
[0214]
α链：
[0215]
trav13-1/traj49
[0216][0217]
β链：
[0218]
trbv7-9/trbj2-3
[0219][0220]
ha1-2-23 cdtm序列：
[0221]
α链：
[0222]
trav21/traj40
[0223][0223][0224]
β链：
[0225]
trbv7-9/trbj1-1
[0226][0227]
ha1-10-34野生型序列(与“tcr-100b”相同的cdr)：
[0228]
α链：
[0229]
trav13-1/traj40
[0230][0231]
β链：
[0232]
trbv7-9/trbj2-1
[0233][0234]
ha1-10-34 cdtm序列(也称为“tcr-100b”)：tcr-100b
[0235]
α链：
[0236]
trav13-1/traj40
[0237][0238]
β链：
[0239]
trbv7-9/trbj2-1
[0240][0241][0242]
ha1-10-26野生型序列(与“tcr-100c”相同的cdr)：
[0243]
α链：
[0244]
trav13-1/traj28
[0245][0246]
β链：
[0247]
trbv7-9/trbj1-4
[0248][0249]
ha1-10-26 cdtm序列(也称为“tcr-100c”)：
[0250]
α链：
[0251]
trav13-1/traj28
[0252][0253]
β链：
[0254]
trbv7-9/trbj1-4
[0255][0256]
ha1-2-21 cdtm序列：
[0257]
α链：
[0258]
trav25/traj29
[0259][0260]
β链：
[0261]
trbv7-9/trbj2-1
[0262][0263]
ha1-6-2 cdtm序列：
[0264]
α链：
[0265]
trav38-1/traj28
[0266][0267]
β链：
[0268]
trbv7-9/trbj2-1
[0269][0270]
表2
[0271]
ha1-fred hutch序列：
[0272]
α链(具有t48c修饰)
[0273]
trav21/traj40/trac
[0274][0275]
β链(具有s57c修饰)
[0276]
trbv7-9/trbj2-3/trbc1
[0277][0278]
*表1提供了代表性的tcr序列，其根据mhc血清型呈递进行分组，并且根据mhc血清型呈递并由亚分组tcr结合的不同肽进行亚分组。描述和要求保护个体tcr，诸如表中代表性实例的那些，以及单独或与mhc形成复合物结合本文所述的肽表位序列的结合蛋白的种类，诸如本文提供的表中分组的那些。此外，提供了本文所述的每条tcrα链的trav、traj和trac基因，以及本文所述的每条tcrβ链的trbv、trbj和trbc基因。本文所述的每个tcr的序列作为每个命名的tcr的关联α链和β链对提供。将本文所述的tcr序列进行注释。可变域序列大写。恒定域序列为小写。cdr1、cdr2和cdr3序列使用粗体和下划线文本进行注释。cdr1、cdr2和cdr3以标准的出现顺序从左(n端)到右(c端)显示。本文所述的每条tcrα链的trav、traj和trac基因，以及本文所述的每条tcrβ链的trbv、trbj和trbc基因，根据本文所述的众所周知的imgt命名法进行注释。
[0279]
表3
[0280]
载体：ptslv102-mscv-ha1-10-30-mgtm-q-cd8：(seq id no:31)
[0281]
[0282]
[0283]
[0284]
[0285][0286]
*mscv启动子为粗体。β链使用粗体和斜体文本进行注释。α链使用粗体和下划线文本进行注释。q标签使用斜体和下划线文本进行注释。cd8-α为斜体。cd8-β带下划线。
[0287]
载体：tsc-100npdna转座子：(seq id no:32)
[0288]
[0289]
[0290][0291]
tsc-100npdna转座子载体盒的示意图：
[0292][0293]
图例：cd：分化簇，itr：反向末端重复，npdna：纳米质粒，mscv：鼠干细胞病毒，tbd：待确定，tcr：t细胞受体，wpre：土拨鼠肝炎病毒tsc-100npdna转座子载体盒的图谱：
[0294][0295]
图例：cd：分化簇，rna-out：针对由sacb编码的细菌果聚糖蔗糖酶的反义rna。sv：猿猴病毒，tcr：t细胞受体，tir：末端反向重复，qbend：小鼠抗人cd34抗体，wpre：土拨鼠肝炎病毒
[0296]
tsc-100npdna转座子是5,709bp的超螺旋nanoplasmid
tm dna(npdna)，携带最小r6k细菌复制起点和基于反义rna的无抗生素选择标志物(rna-out)。粘虫草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)转座子(转座酶介导的整合所需的)的末端反向重复(tir)连接到外源性dna序列的两个末端。将tsc-100 ha-1特异性tcrα和β链基因以及密码子多样化的cd8α和β链基因置于鼠干细胞病毒(mscv)启动子的控制之下。tcrα和β链的恒定区含有稳定它们在工程化t细胞表面的表达的氨基酸取代。这四个开放阅读框与土拨鼠转录后调控元件(wpre)一起在单个mrna分子上编码，该mrna分子已知增强基因表达(loeb，1999)。发生在自切割肽p2a上的核糖体跳跃导致产生四种分开的多肽。由小鼠单克隆抗体qbend/10识别的cd34表位融合至外源性cd8α链的n端，允许纯化表达转基因的细胞以提高药物的安全性和效力。nanoplasmid载体主链(《500个碱基对)比常规质粒(》1500个碱基对)显著更小。它不含有抗生素抗性基因，并且其质粒制备所必需的复制起点(r6k)可以支持在比常用起点(puc)更窄范围的细菌物种中繁殖。
[0297]
表4
[0298]
seq id no:33人ccdc114 cdna序列变体1(nm_001364171.2；cds:358-2481)
[0299][0300][0301]
seq id no:34人ccdc114 cdna序列变体2(nm_144577.4；cds:108-2120)
[0302][0303]
seq id no:35人ccdc114氨基酸序列同等型1(np 001351100.1)
[0304][0305][0306]
seq id no:36人ccdc114氨基酸序列同等型2(np_653178.3)
[0307][0308]
*本文的表1、2和4中包括肽表位，以及包含在其全长上与表1、2和4中列出的任何seq id no的氨基酸序列或其部分具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多的同一性的氨基酸序列的多肽分子。此类多肽可以具有本文进一步描述的全长肽或多肽的功能。
[0309]
*表3和表4中包括rna核酸分子(例如，胸腺嘧啶由尿苷替换)、编码所编码蛋白质的直系同源物的核酸分子，以及包含在其全长上与表3和表4中列出的任何序列或其部分具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多的同一性的核酸序列的dna或rna。此类核酸分子可以具有本文进一步描述的全长核酸的功能。
[0310]
在一些在实施方案中，本文公开的结合蛋白可以包含t细胞受体(tcr)、tcr的抗原结合片段或嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，本文公开的结合蛋白可以包含两条多肽链，其中每条多肽链包含可变区，该可变区包含tcrα链的cdr3和tcrβ链的cdr3，或tcrα链和tcrβ链两者的cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方案中，结合蛋白包含单链tcr(sctcr)，其包含tcr v
α
和tcr v
β
域两者，但仅包含单个tcr恒定域(c
α
或c
β
)。术语“嵌合抗原受体”(car)是指融合蛋白，它经工程化改造为含有以非天然存在或在宿主细胞中非天然存在的方式连接在一起的两个或多个天然存在的氨基酸序列，该融合蛋白在存在于细胞表面时可以作为受体发挥功能。本发明所涵盖的car可以包括与跨膜域和一个或多个细胞内信号传导域(任选地含有共刺激域)连接的包含抗原结合域(即，获得自或衍生自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子诸如抗体或tcr，或从来自nk细胞的杀手免疫受体衍生或获得的抗原结合域)的细胞外部分(参见，例如，sadelain et al.(2013)cancer discov.3:388,harris and kranz(2016)trends pharmacol.sci.37:220，和stone et al.(2014)cancer immunol.immunother.63:1163)。
[0311]
在一些实施方案中，1)tcrα链cdr、tcr v
α
域和/或tcrα链由选自表1中所列的trav、traj和trac基因的组的trav、traj和/或trac基因或其片段编码和/或2)tcrβ链cdr、tcr v
β
域和/或tcrβ链由选自表1中所列的trbv、trbj和trbc基因的组的trbv、trbj和/或trbc基因或其片段编码，和/或3)结合蛋白的每个cdr与表1中所列的关联参考cdr序列相比具有多达五个氨基酸取代、插入、缺失或其组合。
[0312]
在一些实施方案中，本文公开的结合蛋白(例如，tcr、tcr的抗原结合片段或嵌合抗原受体(car))是嵌合的(例如，包含来自多于一个供体或物种的氨基酸残基或基序)、人源化的(例如，包含来自非人生物体的残基，这些残基经改变或取代以降低在人中的免疫原
性的风险)，或人的。
[0313]
用于生产工程化结合蛋白(诸如tcr、car及其抗原结合片段)的方法是本领域众所周知的(例如，bowerman et al.(2009)mol.immunol.5:3000；美国专利号6,410,319；美国专利号7,446,191；美国专利公开号2010/065818；美国专利号8,822,647；pct公开号wo2014/031687；美国专利号7,514,537；以及brentjens et al.(2007)clin.cancer res.73:5426)。
[0314]
在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白是在细胞表面上表达的tcr或其抗原结合片段，其中与内源性tcr相比，细胞表面表达的tcr能够更高效地与cd3蛋白缔合。当在细胞如t细胞的表面上表达时，本发明所涵盖的结合蛋白诸如tcr与内源性结合蛋白诸如内源性tcr相比也可以具有更高的在细胞上的表面表达。在一些实施方案中，本文提供了car，其中car的结合域包含抗原特异性tcr结合域(参见，例如，walseng et al.(2017)scientific reports 7:10713)。
[0315]
还提供了修饰的结合蛋白(例如，tcr、tcr的抗原结合片段或car)，其可以根据众所周知的方法使用本文公开的具有v
α
和/或v
β
序列中的一个或多个的结合蛋白作为起始材料来制备，以工程化改造与起始结合蛋白相比可以具有改变特性的修饰的结合蛋白。结合蛋白可以通过修饰一个或两个可变区(即v
α
和/或v
β
)内的一个或多个残基，例如一个或多个cdr区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来工程化改造。另外地或替代地，结合蛋白可以通过修饰恒定区内的残基来工程化改造。
[0316]
另一种类型的可变区修饰是突变v
α
和/或v
β
cdr1、cdr2和/或cdr3区内的氨基酸残基，从而改善感兴趣结合蛋白的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以执行定点诱变或pcr介导的诱变以引入突变，并且可以在如本文所述且在实施例中提供的体外、离体或体内测定中评价对蛋白质结合或其他感兴趣的功能特性的影响。在一些实施方案中，可以引入保守修饰(如上所讨论)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，突变是取代。此外，典型地cdr区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基经修饰。
[0317]
在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白(例如，tcr、tcr的抗原结合片段或car)相对于天然存在的tcr可以具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。在一些实施方案中，与表1中所列的关联参考cdr序列相比，结合蛋白的每个cdr具有多达五个氨基酸取代、插入、缺失或其组合。氨基酸的保守取代是众所周知的并且可以天然存在或可以在重组产生结合蛋白时引入。可以使用本领域已知的诱变方法将氨基酸取代、缺失和添加引入蛋白质中(参见，例如，sambrook et al.(2001)molecular cloning:a laboratory manual,第3版,cold spring harbor laboratory press,ny)。可以采用寡核苷酸定向的位点特异性(或区段特异性)诱变规程来提供改变的多核苷酸，其具有根据期望的取代、缺失或插入而改变的特定密码子。替代地，可以使用随机或饱和诱变技术，诸如丙氨酸扫描诱变、易错聚合酶链反应诱变和寡核苷酸定向诱变来制备免疫原多肽变体(参见，例如，sambrook et al.，同上)。
[0318]
普通技术人员已知的多种标准指示在肽或多肽中特定位置处的取代的氨基酸是否保守(或相似)。例如，相似氨基酸或保守氨基酸取代是其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。相似氨基酸可以包括在以下类别中：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有不带
电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。认为更难分类的脯氨酸与具有脂肪族侧链的氨基酸(例如，亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和丙氨酸)共享相同的特性。在一些实施方案中，谷氨酰胺对谷氨酸的取代或天冬酰胺对天冬氨酸的取代可以被认为是相似的取代，因为谷氨酰胺和天冬酰胺分别是谷氨酸和天冬氨酸的酰胺衍生物。如本领域所理解的，两个多肽之间的“相似性”是通过将多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列进行比较来确定的(例如，使用geneworks
tm
、align、blast算法或本文描述和本领域实践的其他算法)。
[0319]
在一些实施方案中，编码的结合蛋白(例如，tcr、tcr的抗原结合片段或car)可以包含“信号肽”(也称为前导序列、前导肽或转运肽)。信号肽将新合成的多肽靶向细胞内外的适当位置。在完成定位或分泌期间或完成后，可以从多肽中除去信号肽。具有信号肽的多肽在本文中称为“前蛋白”，并且其信号肽已除去的多肽在本文中称为“成熟”蛋白质或多肽。在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白(例如，tcr、tcr的抗原结合片段或car)包含成熟v
α
域、成熟v
β
域或两者。在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白(例如，tcr、tcr的抗原结合片段或car)包含成熟tcrβ链、成熟tcrα链或两者。
[0320]
在一些实施方案中，结合蛋白是融合蛋白，其包含：(a)包含tcr或其抗原结合片段的细胞外组分；(b)包含效应物域或其功能部分的细胞内组分；和(c)连接细胞外和细胞内组分的跨膜域。在一些实施方案中，融合蛋白能够与肽-mhc(pmhc)复合物结合(例如，特异性和/或选择性地)，该肽-mhc(pmhc)复合物包含在mhc分子(例如，mhc i类)背景下的ha-1免疫原性肽分子。在一些实施方案中，mhc分子包含为hla血清型hla-a*02的mhcα链。在一些实施方案中，hla等位基因选自由hla-a*0201、hla-a*0202、hla-a*0203、hla-a*0205、hla-a*0206和hla-a*0207等位基因组成的组。在具体实施方案中，hla等位基因是hla-a*0201。
[0321]
如本文所用，“效应物域”或“免疫效应物域”是融合蛋白或受体的细胞内部分或域，当接收到合适的信号时，其可以直接或间接地促进细胞中的免疫应答。在一些实施方案中，效应物域来自免疫细胞蛋白或其部分或免疫细胞蛋白复合物，其在结合时接收信号(例如，cd3ζ)，或当免疫细胞蛋白或其部分或免疫细胞蛋白复合物直接结合靶分子并触发免疫细胞中效应物域的信号转导时接收信号。
[0322]
当效应物域含有一个或多个信号传导域或基序，诸如细胞内基于酪氨酸的激活基序(itam)，诸如在共刺激分子中发现的那些时，它可以直接促进细胞应答。不希望受理论的束缚，据信itam可用于由t细胞受体或由包含t细胞效应物域的融合蛋白的配体接合后的t细胞活化。在一些实施方案中，细胞内组分或其功能部分包含itam。示例性免疫效应物域包括但不限于来自cd3ε、cd3δ、cd3ζ、cd25、cd79a、cd79b、card11、dap10、fcrα、fcrβ、fcrγ、fyn、hvem、icos、lck、lag3、lat、lrp、nkg2d、notch1、notch2、notch3、notch4、wnt、ror2、ryk、slamf1、slp76、ptα、tcrα、tcrβ、trim、zap70、ptch2或其任何组合的那些。在一些实施方案中，效应物域包含淋巴细胞受体信号传导域(例如，cd3ζ或其功能部分或变体)。
[0323]
在进一步的实施方案中，融合蛋白的细胞内组分包含共刺激域或其功能部分，选自cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd2、cd5、icam-l(cd54)、lfa-l(cd11a/cd18)、
icos(cd278)、gitr、cd30、cd40、baff-r、hvem、light、mkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3、与cd83结合(例如特异性和/或选择性地)的配体，或其功能变体，或其任何组合。在一些实施方案中，细胞内组分包含cd28共刺激域或其功能部分或变体(其可以任选地包括在天然cd28蛋白的位置186-187的ll-gg突变)(例如，nguyen et al.(2003)blood 702:4320)、4-1bb共刺激域或其功能部分或变体，或两者。
[0324]
在一些实施方案中，效应物域包含cd3ε胞内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在进一步的实施方案中，效应物域包含cd27胞内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在进一步的实施方案中，效应物域包含cd28胞内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在更进一步的实施方案中，效应物域包含4-1bb胞内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在进一步的实施方案中，效应物域包含ox40胞内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在进一步的实施方案中，效应物域包含cd2胞内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在进一步的实施方案中，效应物域包含cd5胞内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在进一步的实施方案中，效应物域包含icam-1胞内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在进一步的实施方案中，效应物域包含lfa-1胞内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在进一步的实施方案中，效应物域包含icos内域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。
[0325]
本发明所涵盖的细胞外组分和细胞内组分通过跨膜域连接。如本文所用，“跨膜域”是可以插入细胞膜中或跨越细胞膜的跨膜蛋白的部分。跨膜域具有三维结构，该结构在细胞膜中是热力学稳定的并且长度范围通常为约15个氨基酸至约30个氨基酸。跨膜域的结构可以包含α螺旋、β桶、β折叠、β螺旋或其任何组合。在一些实施方案中，跨膜域包含或衍生自已知的跨膜蛋白(例如cd4跨膜域、cd8跨膜域、cd27跨膜域、cd28跨膜域或其任何组合)。
[0326]
在一些实施方案中，融合蛋白的细胞外组分进一步包含位于结合域和跨膜域之间的接头。如本文所用，当提及连接结合域和跨膜域的融合蛋白的组分时，“接头”可以是具有约两个氨基酸至约500个氨基酸的氨基酸序列，其可以为由接头连接的两个区、域、基序、片段或模块之间的构象移动提供柔性和空间。例如，本发明所涵盖的接头可以将结合域定位在远离表达融合蛋白的宿主细胞表面的位置，以实现宿主细胞和靶细胞之间的正确接触、抗原结合和激活(patel et al.(1999)gene therapy 6:412-419)。基于所选择的靶分子、所选择的结合表位或抗原结合域捕获和亲和力，可以改变接头长度以最大化抗原识别(参见，例如，guest et al.(2005)immunother.28:203-11和pct公开号wo 2014/031687)。示例性接头包括具有甘氨酸-丝氨酸氨基酸链的接头，该氨基酸链具有gly
x
sery的1至约10个重复，其中x和y各自独立地为0至10的整数，前提是x和y不均为0(例如，(gly4ser)2、(gly3ser)2、gly2ser，或其组合，诸如((gly3ser)2gly2ser))。
[0327]
在一些实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白可以共价连接至部分。在一些实施方案中，共价连接的部分包含亲和标签或标记物。亲和标签可以选自由谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、钙调蛋白结合蛋白(cbp)、蛋白c标签、myc标签、halotag、ha标签、flag标签、his标签、生物素标签和v5标签组成的组。标记物可以是荧光蛋白。在一些实施方案中，共价连接的部分选自由炎性剂、抗炎剂、细胞因子、毒素、细胞毒性分子、放射性同位素或抗体诸如单链fv组成的组。
[0328]
结合蛋白可以与用于成像、研究、治疗、治疗诊断学、药物、化学疗法、螯合疗法、靶向药物递送和放射疗法的剂缀合。在一些实施方案中，结合蛋白可以与可检测剂缀合或融合，诸如荧光团、近红外染料、造影剂、纳米颗粒、含金属的纳米颗粒、金属螯合物、x射线造影剂、pet剂、金属、放射性同位素、染料、放射性核素螯合剂或可以用于成像的其他合适材料。在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个可检测部分可以与结合蛋白连接。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施方案中，金属或放射性同位素选自由锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇组成的组。在一些实施方案中，金属是锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施方案中，放射性同位素是锕-225或铅-212。在一些实施方案中，近红外染料不易被生物组织和体液淬灭。在一些实施方案中，荧光团是在650nm和4000nm之间的波长处发射电磁辐射的荧光剂，此类发射用来检测此类剂。可以用作缀合分子的荧光染料的非限制性实例包括dylight-680、dylight-750、vivotag-750、dylight-800、irdye-800、vivotag-680、cy5.5、zq800或吲哚菁绿(icg)。在一些实施方案中，近红外染料通常包括花青染料(例如，cy7、cy5.5和cy5)。根据本发明用作缀合分子的荧光染料的其他非限制性实例包括吖啶橙或吖啶黄、alexa(例如alexa790、750、700、680、660和647)和其任何衍生物、7-放线菌素d、8-苯胺萘-1-磺酸、染料及其任何衍生物、金胺-罗丹明染色剂及其任何衍生物、bensantrhone、bimane、9-10-双(苯乙炔基)蒽、5,12-双(苯乙炔基)并四苯(naththacene)、双苯酰亚胺、脑彩虹(brainbow)、钙黄绿素、羧基荧光素(carbodyfluorescein)及其任何衍生物、1-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽及其任何衍生物、dapi、dioc6、及其任何衍生物、艾吡可酮(epicocconone)、溴化乙锭、fluo染料及其任何衍生物、及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、及其任何衍生物、及其任何衍生物、及其任何衍生物、荧光蛋白及其任何衍生物，m同等型蛋白及其任何衍生物(诸如例如mcherry)、hetamethine染料及其任何衍生物、赫斯特(hoeschst)染色剂、亚氨基香豆素(iminocoumarin)、印度黄、indo-1及其任何衍生物、laurdan、萤光黄及其任何衍生物、萤光素及其任何衍生物、萤光素酶及其任何衍生物、巯基花青(mercocyanine)及其任何衍生物、尼罗染料及其任何衍生物、苝、焰红燃料(phloxine)、phyco染料及其任何衍生物、碘化丙锭、羟基芘磺酸(pyranine)、罗丹明及其任何衍生物、ribogreen、rogfp、红荧烯、茋及其任何衍生物、磺胺罗丹明及其任何衍生物、sybr及其任何衍生物、synapto-phluorin、四苯基丁二烯、四钠tris、得克萨斯红(texas red)、达旦黄(titan yellow)、tsq、伞形酮、蒽酮紫(violanthrone)、黄色荧光蛋白和yoyo-1。其他合适的荧光染料包括但不限于荧光素和荧光素染料(例如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanine)或fitc、萘并荧光素、4’,5
’‑
二氯-2’,7
’‑
二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或fam等)、羰花青、部花青、苯乙烯基染料、氧喏(oxonol)染料、藻红蛋白、赤藓红、曙红、罗丹明染料(例如，羧基四甲基-罗丹明或tamra、羧基罗丹明6g、羧基-x-罗丹明(rox)、丽丝胺罗丹明b、罗丹明6g、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(tmr)等)、香豆素和香豆素染料(例如甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨基甲基香豆素(amca)等)、oregon green
tm
染料(例如oregon green
tm
488、500、514.,等)、texas-x、spectrum
花青染料(例如cy-3,cy-5,cy-3.5,cy-5.5等)、alexa染料(例如，alexa350、488、532、546、568、594、633、660、680等)、染料(例如，fl、r6g、tmr、tr、530/550、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650、650/665等)、ird染料(例如ird40
tm
、ird700
tm
、ird800
tm
等)，以及等等。其他合适的可检测剂是本领域众所周知的(例如，pct公开号pct/us14/56177)。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施方案中，金属或放射性同位素选自由锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇组成的组。在一些实施方案中，金属是锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施方案中，放射性同位素是锕-225或铅-212。
[0329]
结合蛋白可以与放射增敏剂或光敏剂缀合。放射增敏剂的实例包括但不限于：abt-263、abt-199、wehi-539、紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、依他硝唑、米索硝唑、替拉扎明和核酸碱基衍生物(例如卤代嘌呤或嘧啶，诸如5-氟脱氧尿苷)。光敏剂的实例包括但不限于：当被照射时生成热的荧光分子或珠、纳米颗粒、卟啉和卟啉衍生物(例如，二氢卟酚、菌绿素(bacteriochlorin)、异菌绿素(isobacteriochlorin)、酞菁(phthalocyanine)和萘酞菁(naphthalocyanine))、金属卟啉、金属酞菁、当归素、chalcogenapyrrillium染料、叶绿素、香豆素、黄素和相关化合物(例如咯嗪和核黄素)、富勒烯、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸、花青(例如部花青540)、脱镁叶绿素、sapphyrin、texaphyrin、红紫素、卟啉烯(porphycene)、吩噻嗪(phenothiazinium)、亚甲基蓝衍生物、萘酰亚胺、尼罗蓝衍生品、醌、苝醌(例如金丝桃素、竹红菌素和尾孢菌素)、补骨脂素、醌、类视黄醇、罗丹明、噻吩、verdin、呫吨染料(例如，曙红、赤藓红、孟加拉玫瑰红(rose bengal))、卟啉的二聚体和寡聚体形式，以及前药诸如5-氨基乙酰丙酸。有利地，该方法允许并行使用治疗剂(例如药物)和电磁能(例如辐射或光)两者来高度特异性地靶向感兴趣的细胞(例如免疫细胞)。在一些实施方案中，结合蛋白与剂融合，或共价或非共价连接至剂，例如，直接或经由接头。
[0330]
在一些实施方案中，结合蛋白可以经化学修饰。例如，可以突变结合蛋白以改变肽特性，诸如可检测性、稳定性、生物分布、药代动力学、半衰期、表面电荷、疏水性、缀合位点、ph、功能以及等等。n-甲基化是可以发生在本发明所涵盖的结合蛋白中的甲基化的一个实例。在一些实施方案中，结合蛋白可以通过对游离胺的甲基化，诸如通过用甲醛和氰基硼氢化钠进行还原甲基化进行修饰。
[0331]
化学修饰可以包括聚合物、聚醚、聚乙二醇、生物聚合物、两性离子聚合物、聚氨基酸、脂肪酸、树状聚合物、fc区、简单的饱和碳链诸如棕榈酸酯或肉豆蔻酸酯，或白蛋白。具有fc区的结合蛋白的化学修饰可以是融合fc蛋白。聚氨基酸可以包括，例如，具有重复的单个氨基酸的聚氨基酸序列(例如聚甘氨酸)，以及具有可能遵循或可能不遵循某种模式的混合聚氨基酸序列的聚氨基酸序列，或前述的任何组合。
[0332]
在一些实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白可以经修饰。在一些实施方案中，修饰与亲本结合蛋白具有实质或显著的序列同一性以生成维持亲本结合蛋白的一种或多种生物物理学和/或生物学活性(例如，维持pmhc结合特异性)的功能变体。在一些实施方案中，突变是保守氨基酸取代。
[0333]
在一些实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白可以包含合成氨基酸以替换一种或
多种天然存在的氨基酸。此类合成氨基酸是本领域众所周知的，并且包括例如氨基环己烷甲酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、s-乙酰氨基甲基半胱氨酸、反式3-和反式4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、n
’‑
苄基-n
’‑
甲基-赖氨酸、n’,n
’‑
二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷甲酸、α-氨基环己烷甲酸、α-氨基环庚烷甲酸、a-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸。
[0334]
本发明所涵盖的结合蛋白可以是糖基化的、酰胺化的、羧化的、磷酸化的、酯化的、n-酰化的、环化的(例如，经由二硫桥)，或转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合的，或缀合的。
[0335]
在一些实施方案中，疏水部分，诸如与n-末端、c-末端或内部氨基酸的附接可以用于延长本发明所涵盖的肽的半衰期。在其他实施方案中，结合蛋白可以包括翻译后修饰(例如，甲基化和/或酰胺化)，其可以影响例如血清半衰期。在一些实施方案中，简单碳链(例如，通过豆蔻酰化和/或棕榈酰化)可以缀合至结合蛋白。在一些实施方案中，简单碳链可以使结合蛋白易于与未缀合的材料分开。例如，可以用于将结合蛋白与未缀合材料分开的方法包括但不限于溶剂萃取和反相色谱法。亲脂性部分可以通过与血清白蛋白的可逆结合来延长半衰期。缀合的部分可以是亲脂性部分，其通过与血清白蛋白的可逆结合来延长肽的半衰期。在一些实施方案中，亲脂性部分可以是胆固醇或胆固醇衍生物，包括胆甾烯、胆甾烷、胆甾二烯和氧甾醇。在一些实施方案中，结合蛋白可以缀合至肉豆蔻酸(十四烷酸)或其衍生物。在其他实施方案中，结合蛋白可以偶联(例如缀合)至半衰期调节剂。半衰期调节剂的实例包括但不限于：聚合物、聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)、脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物、含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物、fc区、脂肪酸、棕榈酸或与白蛋白结合的分子。在一些实施方案中，间隔物或接头可以偶联至结合蛋白，诸如1、2、3、4或更多个氨基酸残基，充当间隔物或接头以促进与另一分子的缀合或融合，以及促进肽从此类缀合或融合的分子中切割。在一些实施方案中，结合蛋白可以缀合至其他部分，例如可以修饰或影响结合蛋白的性质的变化。
[0336]
结合蛋白可以重组或合成地产生，诸如通过固相肽合成或液相肽合成。多肽合成可以通过已知的合成方法执行，诸如使用芴基甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl，fmoc)化学或通过叔丁氧羰基(butyloxycarbonyl，boc)化学。多肽片段可以酶促或合成地连接在一起。
[0337]
在本发明所涵盖的方面中，本文提供了产生本文所述的结合蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)在如下条件下培养转化的宿主细胞，该细胞已经由包含编码本文所述的结合蛋白的序列的核酸转化，该条件适合允许所述结合蛋白表达；(ii)回收表达的结合蛋白。
[0338]
举例来说，用于分离和纯化重组产生的结合蛋白的方法可以包括从将结合蛋白分泌到培养基中的合适的宿主细胞/载体系统获得上清液，然后使用市售过滤器浓缩培养基。浓缩后，可以将浓缩物应用于单一合适纯化基质或一系列合适基质，诸如亲和基质或离子交换树脂。可以采用一个或多个反相hplc步骤来进一步纯化重组多肽。当从自然环境中分
离免疫原时，也可以采用这些纯化方法。用于大规模生产本文所述的结合蛋白中的一种或多种的方法包括分批细胞培养，对其进行监测和控制以维持适当的培养条件。可以根据本文所述的和本领域已知的方法执行结合蛋白的纯化。
[0339]
在本文公开的实施方案的任一者中，编码的结合蛋白能够与肽-mhc(pmhc)复合物结合，该肽-mhc(pmhc)复合物包含在mhc分子(例如，mhc i类分子)背景下的ha-1免疫原性肽。在一些实施方案中，mhc分子包含为hla血清型hla-a*02的mhcα链。在一些实施方案中，hla等位基因选自由hla-a*0201、hla-a*0202、hla-a*0203、hla-a*0205、hla-a*0206和hla-a*0207等位基因组成的组。
[0340]
用于评估结合亲和力和/或确定结合分子是否与特定配体(例如，肽抗原-mhc复合物)结合(例如，特异性和/或选择性地)的多种测定法是众所周知的。确定结合蛋白对靶标(诸如靶多肽的t细胞肽表位)的结合亲和力在技术人员的水平内，诸如通过使用本领域中众所周知的许多结合测定中的任一种。例如，在一些实施方案中，biacore
tm
机器可以用于确定两种蛋白质之间的复合物的结合常数。复合物的解离常数(kd)可以通过监测缓冲液通过芯片时折射率随时间的变化来确定。用于测量一种蛋白质与另一种蛋白质的结合的其他合适测定包括例如免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(elisa)和放射免疫测定(ria)，或通过凭借荧光、紫外吸收、圆二色性或核磁共振(nmr)监测蛋白质的光谱或光学性质的变化的结合确定。其他示例性测定包括但不限于蛋白质印迹、elisa、分析超速离心、光谱学和表面等离子体共振(biacore
tm
)分析(参见，例如，scatchard et al.(1949)ann.n.y.acad.sci.51:660,wilson(2002)science 295:2103,wolff et al.(1993)cancer res.53:2560，和美国专利号5,283,173和5,468,614)、流式细胞术、测序和用于检测表达核酸的其他方法。在一个实例中，对靶标的表观亲和力通过评估与各种浓度的四聚体的结合来测量，例如，通过流式细胞术使用标记的多聚体，诸如mhc-抗原四聚体。在一个代表性的实例中，结合蛋白的表观kd使用一定浓度范围内的标记的四聚体的2倍稀释物进行测量，然后通过非线性回归确定结合曲线，表观kd被确定为产生半数最大结合的配体的浓度。
[0341]
iii.核酸和载体
[0342]
在本发明所涵盖的方面中，本文提供编码本文所述的结合蛋白(例如tcr、tcr的抗原结合片段、car以及等等)、肽及其片段的核酸分子。
[0343]
在一些实施方案中，核酸分子在严格条件下与以下序列的互补物杂交，该序列与编码选自由表1中所列多肽序列组成的组的多肽的核酸具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性(诸如在全长上)。
[0344]
在一些实施方案中，核酸分子在严格条件下与编码选自由表1中所列多肽序列组成的组的多肽的核酸的互补物杂交。
[0345]
在一些实施方案中，核酸分子包含(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：编码选自由表1中所列多肽序列组成的组的多肽的核苷酸序列。
[0346]
在一些实施方案中，核酸包含(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：编码表1中所列的至少一个(例如，一个、两个或三个)tcrα链cdr的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：编码具有与表1中所列的tcr v
α
域序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的tcr v
α
域的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：编码具有与表1中所列的tcrα链序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的tcrα链的核苷酸序列。
[0347]
在一些实施方案中，核酸包含(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：编码表1中所列的至少一个(例如，一个、两个或三个)tcrβ链cdr的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：编码具有与表1中所列的tcr v
β
域序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的tcr v
β
域的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含(例如，包含、基本上由以下组成或由以下组成)：编码具有与表1中所列的tcrβ链序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的tcrβ链的核苷酸序列。
[0348]
术语“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常是指dna或rna的聚合物，其可以是单链或双链的、合成的或从天然来源获得的(例如，分离的和/或纯化的)，其可能含有天然、非天然或改变的核苷酸，并且其可能含有天然、非天然或改变的核苷酸间键联，诸如氨基磷酸酯键联或硫代磷酸酯键联，而不是在未修饰寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。在一个实施方案中，核酸包含互补dna(cdna)。
[0349]
在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸是重组的。如本文所用，术语“重组”是指(i)通过将天然或合成核酸区段连接到可以在活细胞中复制的核酸分子而在活细胞外构建的分子，或(ii)由上述(i)中所述那些复制产生的分子。出于本文的目的，复制可以是体外/离体复制或体内复制。
[0350]
可以使用本领域已知的规程基于化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。参见，例如，green and sambrook et al.同上。例如，可以使用天然存在的核苷酸或设计用于增加分子的生物稳定性或增加杂交后形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)来化学合成核酸。可以用于产生核酸的修饰核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基辫苷、肌苷、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-取代腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基奎因、5
’‑
甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫氧嘧啶、2-硫氧嘧啶、4-硫氧嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-n-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。替代地，本发明所涵盖的核酸中的一种或多种可以从公司，诸如integrated dna technologies(coralville,ia)购买。
[0351]
在一个实施方案中，核酸包含密码子优化的核苷酸序列。不受特定理论或机制的
束缚，据信核苷酸序列的密码子优化增加mrna转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可能涉及将天然密码子替换为编码相同氨基酸的另一个密码子，但可以通过细胞内更容易获得的trna进行翻译，从而提高翻译效率。核苷酸序列的优化还可以减少干扰翻译的二级mrna结构，从而提高翻译效率。在一些实施方案中，本文所述的核苷酸序列针对在宿主细胞(例如，免疫细胞，诸如t细胞)中的表达进行密码子优化。
[0352]
本发明还提供了核酸，其包含与本文所述核酸中的任一者的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文所述核酸中的任一者的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
[0353]
在严格条件下杂交的核苷酸序列可以在高严格条件下杂交。“高严格条件”是指核苷酸序列以可检测地比非特异性杂交更强的量与靶序列(本文所述核酸中的任一者的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括区分具有精确互补序列的多核苷酸，或仅含有少量分散错配的多核苷酸与恰好具有匹配核苷酸序列的几个小区(例如，3-10个碱基)的随机序列的条件。此类小的互补区比14-17个或更多碱基的全长互补物更容易解链，并且高度严格杂交使它们易于区分。相对高的严格条件将包括例如低盐和/或高温条件，诸如在约50-70℃的温度下由约0.02-0.1m nacl或等同物提供。此类高度严格条件几乎不能容忍核苷酸序列与模板或靶链之间的错配(如果有的话)，并且特别适用于检测本发明tcr中的任一者的表达。普遍认为，通过添加渐增量的甲酰胺可以使条件更加严格。
[0354]
本发明还提供了核酸，其包含与本文所述的核酸中的任一者至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。
[0355]
典型地，所述核酸是dna或rna分子，其可以包含在合适的载体中，诸如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体中。
[0356]
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可以将dna或rna序列(例如外来基因)引入宿主细胞以转化宿主并促进表达(例如，引入序列的转录和翻译)的载体。因此，本发明所涵盖的另一个目的涉及包含本发明所涵盖的核酸的载体。
[0357]
此类载体可以包含调控元件，诸如启动子、增强子、终止子以及等等，以在施用于受试者时引起或指导所述多肽的表达。用于动物细胞表达载体中的启动子和增强子的实例包括sv40的早期启动子和增强子(mizukami t.et al.1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒的ltr启动子和增强子(kuwana y et al.1987)、免疫球蛋白h链的启动子(mason j o et al.1985)和增强子(gillies s d et al.1983)以及等等。
[0358]
可以使用用于动物细胞的任何表达载体。合适载体的实例包括page107(miyaji h et al.1990)、page103(mizukami t et al.1987)、phsg274(brady g et al.1984)、pkcr(o'hare k et al.1981)、psg1beta d2-4-(miyaji h et al.1990)以及等等。质粒的其他代表性实例包括包含复制起点的复制质粒，或整合质粒，诸如puc、pcdna、pbr以及等等。病毒载体的代表性实例包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒和aav载体。此类重组病毒可以通过本领域已知的技术，诸如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒瞬时转染来产生。病毒包装细胞的典型实例包括pa317细胞、psicrip细胞、gpenv阳性细胞、293细胞等。用于产生此类复制缺陷型重组病毒的详细方案是本领域众所周知的，并且可以在例如pct公开wo 95/14785、pct公开wo 96/22378、美国专利号5,882,877、美国专利号6,013,516、美国专利号4,861,719、美国专利号5,278,056和pct公开wo 94/19478中找到。
[0359]
在一些实施方案中，组合物包含表达载体，该表达载体包含编码本文所述的结合蛋白或多肽或其片段的开放阅读框。在一些实施方案中，核酸包括表达开放阅读框所必需的调控元件。此类元件可以包括例如启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，可以包括增强剂。这些元件可以可操作地连接至编码结合蛋白、多肽或其片段的序列。
[0360]
在一些实施方案中，载体进一步包括编码cd8α和/或cd8β的核酸序列。在某些实施方案中，编码cd8α或cd8β的核酸序列可操作地连接至编码标签(例如，cd34富集标签)的核酸。在具体实施方案中，编码cd8α和/或cd8β的核酸序列与内部核糖体进入位点或编码自切割肽(诸如p2a、e2a、f2a或t2a等)的核酸序列相互连接。
[0361]
在一些实施方案中，本文提供的表达载体包含与seq id no.27中所列的核酸中的任一者至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。
[0362]
启动子的实例包括但不限于来自猿猴病毒40(sv40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、人免疫缺陷病毒(hiv)诸如hiv长末端重复(ltr)启动子、莫洛尼病毒、巨细胞病毒(cmv)诸如cmv直接早期启动子、epstein barr病毒(ebv)、rous肉瘤病毒(rsv)以及来自人基因的启动子，诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白。合适的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于sv40聚腺苷酸化信号和ltr聚腺苷酸化信号。
[0363]
除了表达所需的调节元件外，核酸分子中还可以包含其他元件。此类额外的元件包括增强子。增强子包括本文所述的启动子。在一些实施方案中，增强子/启动子包括例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子，诸如来自cmv、rsv和ebv的增强子。
[0364]
在一些实施方案中，核酸可以可操作地掺入如下文进一步描述的载剂或递送载体中。有用的递送载体包括但不限于可生物降解的微胶囊、免疫刺激复合物(iscom)或脂质体，以及遗传工程化减毒活载剂，诸如病毒或细菌。
[0365]
在一些实施方案中，载体是病毒载体，诸如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、杆状病毒、禽痘、av-痘、修饰的安卡拉痘苗(vaccinia ankara，mva)和其他重组病毒。例如，慢病毒载体可以用于感染t细胞。
[0366]
在一些实施方案中，重组表达载体能够将多核苷酸递送至合适的宿主细胞，例如t细胞或抗原呈递细胞，即在其细胞表面展示肽/mhc复合物且缺乏cd8的细胞(例如，树突状细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。例如，免疫系统细胞可以是cd4
+ t细胞、cd8
+ t细胞、cd4/cd8双阴性t细胞、gdt细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞或其任何组合。在一些实施方案中，其中t细胞是宿主，t细胞可以是初始的、中央记忆t细胞、效应记忆t细胞，或其任何组合。因此，重组表达载体还可以包括例如淋巴组织特异性转录调节元件(tre)，诸如b淋巴细胞、t淋巴细胞或树突状细胞特异性tre。淋巴组织特异性tre是本领域已知的(参见，例如，thompson et al.(1992)mol.cell.biol.72:1043,todd et al.(1993)j.exp.med.777:1663，和penix et al.(1993)j.exp.med.775:1483)。
[0367]
在一些实施方案中，重组表达载体包含编码tcrα链、tcrβ链和/或接头肽的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，重组表达载体包含编码结合蛋白的全长tcrα和tcrβ链以及
位于它们之间的接头的核苷酸序列，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’。在一些实施方案中，核苷酸序列编码全长tcrα和tcrβ链与位于它们之间的接头，其中编码tcrβ链的核苷酸序列位于编码tcrα链的核苷酸序列的3’。在一些实施方案中，全长tcrα和/或tcrβ链由其片段替换。
[0368]
如下文进一步描述的，本发明所涵盖的另一方面涉及已由根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的细胞。宿主细胞可以包括可以接受载体或掺入核酸和/或蛋白质的任何个体细胞或细胞培养物，以及任何后代细胞。该术语还涵盖宿主细胞的后代，无论是在遗传上还是表型上相同或不同。合适的宿主细胞可以取决于载体并且可以包括哺乳动物细胞、动物细胞、人细胞、猿猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。可以通过使用病毒载体、经由磷酸钙沉淀转化、deae-葡聚糖、电穿孔、显微注射或其他方法来诱导这些细胞以掺入载体或其他材料(参见，例如，sambrook el al.(1989)molecular cloning:a laboratory manual第2版(cold spring harbor laboratory))。术语“转化”是指将“外来”(即非固有的或细胞外的)基因、dna或rna序列引入到宿主细胞，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生期望物质，典型地由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并表达引入的dna或rna的宿主细胞已被“转化”。
[0369]
本发明所涵盖的核酸可以用于在合适的表达系统中产生本发明所涵盖的重组多肽。术语“表达系统”是指在合适条件下的宿主细胞和相容载体，例如，用于表达由载体携带的外来dna编码并引入宿主细胞的蛋白质。
[0370]
常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(诸如细菌)和真核细胞(诸如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母属(kluyveromyces)或酵母菌属(saccharomyces)酵母、哺乳动物细胞系(例如，vero细胞、cho细胞、3t3细胞、cos细胞等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如，从淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生的)。实例还包括小鼠sp2/0-ag14细胞(atcc crl1581)、小鼠p3x63-ag8.653细胞(atcc crl1580)、二氢叶酸还原酶基因(以下称为“dhfr基因”)缺陷的cho细胞(urlaub g et al(1980))，大鼠yb2/3hl.p2.g11.16ag.20细胞(atcc crl1662，以下称为“yb2/0细胞”)以及等等。在一些实施方案中，使用yb2/0细胞，因为嵌合或人源化结合蛋白的adcc活性在该细胞中表达时增强。
[0371]
本发明还涵盖产生表达本发明所涵盖的结合蛋白、肽及其片段的重组宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)体外或离体引入如上所述重组核酸或载体转化至感受态宿主细胞中，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞，和(iii)任选地，选择表达所述结合蛋白、肽及其片段的细胞。此类重组宿主细胞可以用于本发明所涵盖的诊断、预后和/或治疗方法。
[0372]
另一方面，本发明提供分离的核酸，其在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交。因此，该实施方案的多核苷酸可以用于分离、检测和/或定量包含此类多核苷酸的核酸。例如，本发明所涵盖的多核苷酸可以用于鉴定、分离或扩增保藏文库中的部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的基因组或cdna序列，或另外地与来自人或哺乳动物核酸文库的cdna互补的基因组或cdna序列。在一些实施方案中，cdna文库包含至少约
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如在至少约80％-100％全长序列。cdna文库可以经归一化以增加稀有序列的代表性。低或中等严格性杂交条件典型地为，但不限于与相对于互补序列具有降低的序列同一性的序列一起使用。中度和高度严格条件可以任选地用于更大同一性的序列。低严格条件允许选择性杂交具有约70％序列同一性的序列，并可以用于鉴定直系同源或旁系同源序列。任选地，本发明所涵盖的多核苷酸将编码由本文所述的多核苷酸编码的结合蛋白的至少部分。本发明所涵盖的多核苷酸包含可以用于与编码本发明所涵盖的结合蛋白的多核苷酸选择性杂交的核酸序列(参见，例如ausubel，同上和colligan，同上)。
[0373]
iv.宿主细胞
[0374]
在本发明所涵盖的一个方面中，本文提供表达本文所述的结合蛋白(例如，tcr、tcr的抗原结合片段、car或包含tcr和效应物域的融合蛋白)的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包含本文所述的核酸或载体。
[0375]
在一些实施方案中，编码结合蛋白的多核苷酸用于转化、转染或转导宿主细胞(例如，t细胞)以用于过继性转移疗法。已经描述核酸测序和特定tcr测序的进展(例如，robins et al.(2009)blood 114:4099；robins et al.(2010)sci.translat.med.2:47ra64,robins et al.(2011)j.imm.meth.，和warren et al.(2011)genome res.21:790)，并且可以在实施本发明所涵盖的实施方案的过程中使用。类似地，用于用期望核酸转染或转导t细胞的方法是本领域众所周知的(例如，美国专利公开号us2004/0087025)，因为具有使用具有期望抗原特异性的t细胞的过继性转移规程(例如，schmitt et al.(2009)hum.gen.20:1240,dossett et al.(2009)mol.ther.77:742,till et al.(2008)blood 772:2261,wang et al.(2007)hum.gene ther.18:112,kuball et al.(2007)blood 709:2331，美国专利公开2011/0243972，美国专利公开2011/0189141，和leen et al.(2007)ann.rev.immunol.25:243)。
[0376]
任何合适的免疫细胞均可以经修饰以包括本发明所涵盖的异源多核苷酸，包括例如t细胞、nk细胞或nk-t细胞。在一些实施方案中，细胞可以是原代细胞或细胞系的细胞。在一些实施方案中，修饰的免疫细胞包含cd4
+ t细胞、cd8
+ t细胞或两者。出于本文的目的，t细胞可以是任何t细胞，诸如培养的t细胞，例如原代t细胞，或来自培养的t细胞系的t细胞，例如jurkat、suptl等，或从哺乳动物中获得的t细胞。如果从哺乳动物获得，t细胞可以从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体。t细胞也可以富集或纯化。在一些实施方案中，t细胞是人t细胞。在一些实施方案中，t细胞是分离自人的t细胞。t细胞可以是任何类型的t细胞，并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性淋巴细胞前体细胞、细胞毒性淋巴细胞祖细胞、细胞毒性淋巴细胞干细胞、cd4
+
/cd8
+
双阳性t细胞、cd4
+
辅助性t细胞，例如th1和th2细胞、cd4
+ t细胞、cd8
+ t细胞(例如细胞毒性t细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、记忆t细胞(例如中央记忆t细胞和效应记忆t细胞)、初始t细胞以及等等。
[0377]
可以使用任何合适的方法来转染或转导细胞，例如t细胞，或施用本文所述方法所涵盖的核苷酸序列或组合物。用于将多核苷酸递送至宿主细胞的方法包括，例如，使用阳离子聚合物、脂质样分子和某些商业产品，诸如体内-其他方法包括离体转导、注
射、电穿孔、deae-葡聚糖、声处理加载、脂质体介导的转染、受体介导的转导、微粒轰击、转座子介导的转移以及等等。转染或转导宿主细胞的又进一步方法使用载体，如本文进一步详细描述。
[0378]
如本文所述的修饰的免疫细胞可以使用用于测定t细胞活性的方法学来进行功能表征，包括t细胞结合、激活或诱导的测定并且还包括为抗原特异性的t细胞应答的测定。实例包括测定t细胞增殖、t细胞细胞因子释放、抗原特异性t细胞刺激、mhc限制性t细胞刺激、ctl活性(例如，通过检测预加载靶细胞释放的
51
cr)、t细胞表型标志物表达的变化和t细胞功能的其他测量。
[0379]
用于执行这些和类似测定的规程可以在例如lefkovits(immunology methods manual:hie comprehensive sourcebook of techniques,1998)，以及current protocols in immunology,weir,(1986)handbook of experimental immunology,blackwell scientific,boston,ma；mishell and shigii(编)(1979)selected methods in cellular immunology,freeman publishing,san francisco,ca；green and reed(1998)science 281:1309，和其中引用的参考文献中找到。
[0380]
在一些实施方案中，可以通过评估与各种浓度的mhc多聚体的结合来测量对结合蛋白诸如tcr或其抗原结合部分的表观亲和力。“mhc-肽多聚体染色”是指用于检测抗原特异性t细胞的测定，在一些实施方案中，其特征在于mhc分子的四聚体，每个分子包含具有为关联(例如，与之相同或相关的)至少一种抗原(例如，ha-1免疫原性肽)的氨基酸序列的相同肽，其中复合物能够与识别关联抗原的结合蛋白，诸如tcr或其抗原结合部分结合。mhc分子中的每一者可以用生物素分子标签化。生物素化mhc/肽可以通过添加可以经荧光标记的链霉亲和素而多聚化(例如，四聚化)。
[0381]
多聚体可以经由荧光标记物通过流式细胞术检测。在一些实施方案中，pmhc多聚体测定用于检测或选择增强的亲和力结合蛋白，诸如本发明所涵盖的tcr或其抗原结合部分。在一些实例中，结合蛋白(诸如tcr或其抗原结合部分)的表观kd使用一定浓度范围内的标记的多聚体的2倍稀释物进行测量，然后通过非线性回归确定结合曲线，表观kd被确定为产生半数最大结合的配体的浓度。
[0382]
细胞因子的水平可以使用本文所述的方法来确定，诸如elisa、elispot、细胞内细胞因子染色和流式细胞术及其组合(例如，细胞内细胞因子染色和流式细胞术)。
[0383]
由抗原特异性引发或刺激免疫应答引起的免疫细胞增殖和克隆扩增可以通过分离淋巴细胞来确定，诸如外周血细胞或淋巴结细胞样品中的循环淋巴细胞，用抗原刺激细胞，并测量细胞因子产生、细胞增殖和/或细胞存活力，诸如通过掺入氚化胸苷或非放射性测定，诸如mtt测定以及等等。本文所述的免疫原对th1免疫应答和th2免疫应答之间平衡的影响可以通过例如测定th1细胞因子诸如ifn-g、il-12、il-2和tnf-b以及2型细胞因子诸如il-4、il-5、il-9、il-10和il-13的水平来检验。
[0384]
本发明所涵盖的宿主细胞可以包含编码如本文所述的结合蛋白的单个多核苷酸，或者结合蛋白可以由多于一个多核苷酸编码。换言之，结合蛋白的组分或部分可以由两个或更多个多核苷酸编码，其可以包含在单个核酸分子上或可以包含在两个或更多个核酸分子上。
[0385]
在一些实施方案中，编码本发明所涵盖的结合蛋白的两个或更多个组分或部分的
多核苷酸包含在单个开放阅读框中可操作地缔合的两个或更多个编码序列。此类排列可以有利地允许期望基因产物的协调表达，诸如，例如tcr的α链和β链的同时期表达，使得它们以约1:1的比率产生。在一些实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白，诸如tcr(例如，α-和β-链)或car的两个或多个取代基基因产物，被表达为单独的分子并在翻译后缔合。在进一步的实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白的两个或更多个取代基基因产物被表达为具有由可切割或可除去的区段分开的部分的单个肽。例如，可用于表达由单个多核苷酸或载体编码的可分离多肽的自切割肽在本领域中是已知的，并且包括例如猪特殊病毒(porcine teschovirus)-1 2a(p2a)肽、thaseaasigna病毒2a(t2a)肽、马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)肽和口蹄疫病毒2a(f2a)肽。
[0386]
在一些实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白包含一个或多个接界氨基酸。“接界氨基酸”或“接界氨基酸残基”是指多肽的两个相邻基序、区或域之间，诸如在结合域和相邻恒定域之间或tcr链与相邻的自切割肽之间的一个或多个(例如，2至约10个)氨基酸残基。接界氨基酸可以由编码融合蛋白的构建体的设计产生(例如，在构建编码融合蛋白的核酸分子期间由使用限制性酶切位点产生的氨基酸残基)，或由例如编码本发明所涵盖的结合蛋白的一个或多个域相邻的自切割肽的切割产生(例如，位于tcrα链和tcrβ链之间的p2a肽，其自切割可以在a链、tcrβ链或两者中留下一个或多个接界氨基酸)。
[0387]
本发明所涵盖的工程化免疫细胞可以作为用于例如以表达ha-1抗原为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的疗法来施用。在一些情况下，可能期望减少或停止与细胞免疫疗法相关联的活性。因此，在一些实施方案中，本发明所涵盖的工程化免疫细胞包含编码结合蛋白和辅助蛋白(诸如安全开关蛋白)的异源多核苷酸，当期望时可以使用关联药物或其他化合物靶向这些辅助蛋白以选择性调节此类细胞的活性(例如，减少或消融)。在这方面使用的安全开关蛋白包括，例如，截短的egf受体多肽(huegfrt)，它没有细胞外n端配体结合域和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但保留天然氨基酸序列，i型跨膜细胞表面定位，以及药物级抗egfr单克隆抗体、西妥昔单抗(erbitux)tegf受体(tegfr；wang et al.(2011)blood 118:1255-1263)、半胱天冬酶多肽(例如，icasp9；straathof et al.(2005)blood 105:4247-4254,di stasi et al.(2011)n.engl.j.med.365:1673-1683,zhou and brenner(2016)hematol.pii:s0301-472x:30513-30516)、rqr8(philip et al.(2014)blood124:1277-1287)和人c-myc蛋白标签(kieback et al.(2008)proc.natl.acad.sci.usa 105:623-628)的构象完整的结合表位。
[0388]
可用于治疗性细胞的其他辅助组分包括标签或选择标志物(例如，cd34富集标签)，其允许鉴定、分选、分离、富集或追踪细胞。例如，具有期望特征的标记免疫细胞(例如，抗原特异性tcr和安全开关蛋白)可以从样品中的未标记细胞中分选出来，并更高效地激活和扩增以包含在期望纯度的治疗性产品中。
[0389]
如本文所用，术语“选择标志物”包含核酸构建体，其赋予细胞可鉴定的变化，从而允许检测和阳性选择用包含选择标志物的多核苷酸转导的免疫细胞。例如，rqr是包含cd20的主要细胞外环和两个最小cd34结合位点的选择标志物。在一些实施方案中，rqr编码多核苷酸包含编码16个氨基酸的cd34最小表位的多核苷酸。在一些实施方案中，诸如本文实施例中提供的某些实施方案，cd34最小表位掺入cd8柄(stalk)域(q8)的氨基末端位置。在进一步的实施方案中，cd34最小结合位点序列可以与cd20的靶表位组合以形成t细胞的紧凑
标志物/自杀基因(rqr8)(philip et al.2014)。该构建体允许选择表达该构建体的免疫细胞，其具有例如，结合到磁珠(miltenyi)的cd34特异性抗体，并利用临床上接受的药物抗体利妥昔单抗，其允许选择性删除表达转基因的工程化t细胞(例如，philip et al.(2014)blood 124:1277-1287，美国专利公开2015-0093401和美国专利公开2018-0051089)。
[0390]
进一步的示例性选择标志物包括通常不在t细胞上表达的若干截短的i型跨膜蛋白：截短的低亲和力神经生长因子、截短的cd19和截短的cd34(例如，di stasi et al.(2011)n.engl.j.med.365:1673-1683,mavilio et al.(1994)blood 83:1988-1997，和fehse et al.(2000)mol.ther.7:448-456)。cd19和cd34的特别吸引人的特征是现成的miltenyi clinimacs
tm
选择系统的可用性，该系统可以靶向这些标志物用于临床级分选。然而，cd19和cd34是相对较大的表面蛋白，可能影响整合载体的载体包装能力和转录效率。也可以采用含有细胞外非信号传导域或各种蛋白质(例如，cd19、cd34、lngfr等)的表面标记。任何选择标志物均可以采用并且对于良好生产规范来说应该是可以接受的。在一些实施方案中，选择标志物与编码感兴趣的基因产物(例如，本发明所涵盖的结合蛋白，诸如tcr或car，或其抗原结合片段)的多核苷酸一起表达。选择标志物的进一步实例包括例如报告物，诸如gfp、egfp、β-gal或氯霉素乙酰转移酶(cat)。在一些实施方案中，选择标志物，诸如，例如cd34由细胞表达并且cd34可以用于选择富集或分离(例如，通过免疫磁性选择)感兴趣的转导细胞以用于本文所述的方法中。如本文所用，cd34标志物区别于抗cd34抗体，或例如scfv、tcr或与cd34结合的其他抗原识别部分。
[0391]
在一些实施方案中，选择标志物包含rqr多肽、截短的低亲和力神经生长因子(tngfr)、截短的cd19(tcd19)、截短的cd34(tcd34)或其任何组合。
[0392]
作为背景，在免疫疗法细胞产品中包含cd4
+ t细胞可以提供抗原诱导的il-2分泌并增强转移的细胞毒性cd8
+ t细胞的持久性和功能(例如，kennedy et al.(2008)immunol.rev.222:129和nakanishi et al.nature(2009)52:510)。在一些实施方案中，cd4
+ t细胞中的i类限制性tcr可能需要转移cd8共受体以增强tcr对i类hla肽复合物的敏感性。cd4共受体在结构上与cd8不同，并且不能有效替代cd8共受体(例如，stone&kranz(2013)front.immunol.4:244和cole et al.(2012)immunology 737:139)。因此，用于本发明所涵盖的组合物和方法中的另一种辅助蛋白包括cd8共受体或其组分。在一些实施方案中，包含编码本发明所涵盖的结合蛋白的异源多核苷酸的工程化免疫细胞可以进一步包含编码cd8共受体蛋白或其β链或α链组分的异源多核苷酸。
[0393]
宿主细胞可以高效转导以含有并可以高效表达编码结合蛋白、安全开关蛋白、选择标志物和cd8共受体蛋白的单个多核苷酸。
[0394]
在一个实施方案中，本发明所涵盖的宿主细胞进一步包括编码共刺激分子的核酸，使得修饰的t细胞表达共刺激分子。在一些实施方案中，共刺激域选自cd3、cd27、cd28、cd83、cd86、cd127、4-1bb、4-1bbl、pd1和pd1l。
[0395]
在前述实施方案中的任一者中，表达本文所述的结合蛋白的宿主细胞可以是通用免疫细胞。“通用免疫细胞”包括已经修饰以减少或消除编码多肽产物的一种或多种内源性基因的表达的免疫细胞，该多肽产物选自pd-1、lag-3、ctla4、tim3、tigit、hla分子、tcr分子或其任何组合。不希望受理论的束缚，某些内源性表达的免疫细胞蛋白可能下调修饰的免疫细胞的免疫活性(例如，pd-1、lag-3、ctla4、tigit)，或者可能干扰异源表达的本发明
所涵盖的结合蛋白的结合活性(例如，内源性tcr，其结合非ha-1抗原并干扰与表达ha-1抗原的靶细胞的结合的修饰免疫细胞，诸如ha-1免疫原性肽包含在mhc分子的背景下的氨基酸序列vlhddllea。此外，在供体免疫细胞上表达的内源性蛋白质(例如，免疫细胞蛋白质，诸如hla等位基因)可能由同种异体宿主识别为外来物，这可能导致同种异体宿主消除或抑制修饰的供体免疫细胞。
[0396]
因此，减少或消除此类内源性基因或蛋白质的表达或活性可以改善修饰的免疫细胞在自体或同种异体宿主环境中的活性、耐受性或持久性，并允许普遍施用细胞(例如，至无论hla型的任何接受者)。在一些实施方案中，根据本发明的细胞是同系的，意味着它们在遗传上相同或足够相同且在免疫学上相容以允许移植。在一些实施方案中，通用免疫细胞是供体细胞(例如，同种异体的)或自体细胞。在一些实施方案中，本发明所涵盖的修饰免疫细胞(例如，通用免疫细胞)包含基因中的一个或多个的染色体基因敲除，该基因编码pd-1、lag-3、ctla4、tim3、tigit、hla组分(例如，编码α1巨球蛋白、α2巨球蛋白、α3巨球蛋白、β1微球蛋白或β2微球蛋白的基因)或tcr组分(例如，编码tcr可变区或tcr恒定区的基因)(参见，例如，torikai el al.(2016)nature sci.rep.6:21757；torikai et al.(2012)blood 179:5697；和torikai et al.(2013)blood 722:1341，这也提供根据本发明有用的代表性、示例性基因编辑技术、组合物和过继性细胞疗法)。
[0397]
如本文所用，术语“染色体基因敲除”是指宿主细胞中的遗传改变或引入的抑制剂，其阻止(例如，减少、延迟、抑制或废除)宿主细胞产生功能活性的内源性多肽产物。导致染色体基因敲除的改变可能包括，例如，引入的无义突变(包括过早终止密码子的形成)、错义突变、基因缺失和链断裂，以及抑制宿主细胞中内源性基因表达的抑制性核酸分子的异源表达。
[0398]
在一些实施方案中，染色体基因敲除或基因敲入可以通过宿主细胞的染色体编辑来进行。可以使用例如内切核酸酶执行染色体编辑。如本文所用，“内切核酸酶”是指能够催化多核苷酸链内的磷酸二酯键切割的酶。在一些实施方案中，内切核酸酶能够切割靶基因，从而使靶基因失活或“敲除”。内切核酸酶可以是天然存在的、重组的、遗传修饰的或融合的内切核酸酶。由内切核酸酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(nhej)的不同机制进行修复。在同源重组期间，供体核酸分子可以用于供体基因“敲入”、靶基因“敲除”，以及任选地通过供体基因敲入或靶基因敲除事件使靶基因失活。nhej是易错的修复过程，其通常导致切割位点的dna序列的变化，例如至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。nhej可以用于“敲除”靶基因。内切核酸酶的实例包括锌指核酸酶、tale-核酸酶、crispr-cas核酸酶、大范围核酸酶和megatal。
[0399]
如本文所用，“锌指核酸酶”(zfn)是指包含与非特异性dna切割域诸如fokl内切核酸酶融合的锌指dna结合域的融合蛋白。每个约30个氨基酸的锌指基序与约3个碱基对的dna结合，并且某些残基的氨基酸可以变化以改变三联体序列特异性(例如，desjarlais et al.(1993)proc.natl.acad.sci.90:2256-2260和wolfe et al.(1999)j.mol.biol.255:1917-1934)。多个锌指基序可以串联连接以产生对期望dna序列的结合特异性，诸如长度范围为约9至约18个碱基对的区。作为背景，zfn通过催化基因组中位点特异性dna双链断裂(dsb)的形成来介导基因组编辑，并且通过同源定向修复来促进包含dsb位点上与基因组同源的侧翼序列的转基因的靶向整合。替代地，由zfn生成的dsb可以导致经由通过非同源末
端连接(nhej)的修复的靶基因敲除，这是易错的细胞修复途径，导致在切割位点的核苷酸的插入或缺失。在一些实施方案中，基因敲除包括使用zfn分子进行的插入、缺失、突变或其组合。
[0400]
如本文所用，“转录激活物样效应物核酸酶”(talen)是指包含tale dna结合域和dna切割域诸如fokl内切核酸酶的融合蛋白。“tale dna结合域”或“tale”由一个或多个tale重复域/单元构成，各自通常具有高度保守的33-35个氨基酸序列，其中第12和第13个氨基酸趋异。tale重复域参与tale与靶dna序列的结合。趋异的氨基酸残基，称为重复可变二残基(repeat variablediresidue，rvd)，与特定核苷酸识别相关。已经确定这些tale的dna识别的天然(经典)代码，使得tale的位置12和13处的hd(组氨酸-天冬氨酸)序列导致tale与胞嘧啶(c)结合、ng(天冬酰胺-甘氨酸))与t核苷酸结合、ni(天冬酰胺-异亮氨酸)与a结合、nn(天冬酰胺-天冬酰胺)与g或a核苷酸结合，和ng(天冬酰胺-甘氨酸)与t核苷酸结合。非经典(非典型)rvd也是本领域众所周知的(例如，美国专利公开号us2011/0301073，该非典型rvd通过引用其整体并入本文)。talen可以用于指导t细胞基因组中的位点特异性双链断裂(dsb)。非同源末端连接(nhej)从双链断裂的两侧连接dna，其中很少或没有序列重叠用于退火，从而引入敲除基因表达的错误。或者，同源定向修复可以在dsb的位点引入转基因，前提是转基因中存在同源侧翼序列。在一些实施方案中，基因敲除包括插入、缺失、突变或其组合，并且使用talen分子进行。
[0401]
如本文所用，“成簇的规则间隔短回文重复/cas”(crispr/cas)核酸酶系统是指采用crispr rna(crrna)引导的cas核酸酶经由碱基配对互补性来识别基因组内的靶位点(称为原间隔区)的系统，然后如果短的、保守的原间隔区相关联基序(pam)紧接在互补靶序列的3’之后，则切割dna。crispr/cas系统根据cas核酸酶的序列和结构分类为三种类型(即i型、ii型和iii型)。i型和iii型中的crrna引导的监视复合物需要多个cas亚基。ii型系统是研究最多的，其包含至少三个组分：rna引导的cas9核酸酶、crrna和反式作用crrna(tracrrna)。tracrrna包含双链体形成区。crrna和tracrrna形成双链体，其能够与cas9核酸酶相互作用，并经由crrna上的间隔区和在pam上游的靶dna上的原间隔区之间的watson-crick碱基配对将cas9/crrna:tracrrna复合物引导至靶dna上的特定位点。cas9核酸酶在由crrna间隔物定义的区内切割双链断裂。通过nhej的修复导致插入和/或缺失，从而破坏靶向基因座的表达。替代地，可以经由同源定向修复在dsb位点引入具有同源侧翼序列的转基因。crrna和tracrrna可以经工程化改造为单一向导rna(sgrna或grna)(例如，jinek et al.(2012)science 337:816-821)。此外，可以改变或编程与靶位点互补的向导rna的区以靶向期望序列(xie et al.(2014)plos one 9:el00448、美国专利公开号us2014/0068797、美国专利公开号us2014/0186843、美国专利公开号8,697,359和pct公开号wo2015/071474)。在一些实施方案中，基因敲除包括插入、缺失、突变或其组合，并且使用crispr/cas核酸酶系统进行。
[0402]
示例性grna序列和使用其敲除编码免疫细胞蛋白的内源性基因的方法包括ren et al.(2017)clin.cancer res.23:2255-2266中描述的那些，其提供了代表性的示例性grna、cas9dna、载体和基因敲除技术。
[0403]
如本文所用，“大范围核酸酶”，也称为“归巢内切核酸酶”，是指以大识别位点为特征的内切脱氧核糖核酸酶(约12至约40个碱基对的双链dna序列)。基于序列和结构基序，大
范围核酸酶可以分为五个家族：laglidadg、giy-yig、hnh、his-cys框和pd-(d/e)xk。示例性的大范围核酸酶包括i-scel、i-ceul、pi-pspi、ri-sce、i-scelv、i-csml、i-panl、i-scell、i-ppol、i-sceiii、i-crel、i-tevl、i-tevii和i-teviii，其识别序列是众所周知的(例如，美国专利号5,420,032和6,833,252，belfort et al.(1997)nucl.acids res.25:3379-3388,dujon et al.(1989)gene 52:115-118,perler et al.(1994)nucl.acids res.22:1125-1127,jasin(1996)trends genet.72:224-228,gimble et al.(1996)j.mol.biol.263:163-180，和argast et al.(1998)j.mol.biol.280:345-353)。
[0404]
在一些实施方案中，天然存在的大范围核酸酶可以用于促进感兴趣靶标，诸如免疫检查点、hla编码基因或tcr组分编码基因的位点特异性基因组修饰。
[0405]
在其他实施方案中，对靶基因具有新结合特异性的工程化大范围核酸酶用于位点特异性基因组修饰(参见，例如，porteus et al.(2005)nat.biotechnol.23:967-73,sussman et al.(2004)j.mol.biol.342:31-41,epinat et al.(2003)nucl.acids res.37:2952-2962,chevalier et al.(2002)mol.cell 70:895-905,ashworth et al.(2006)nature 441:656-659,paques et al.(2007)curr.gene ther.7:49-66，以及美国专利公开号us2007/0117128,us2006/0206949,us2006/0153826,us2006/0078552，和us2004/0002092)。在进一步的实施方案中，使用已经用talen的模块化dna结合域修饰的归巢内切核酸酶生成染色体基因敲除以制备称为megatal的融合蛋白。megatal在与编码感兴趣多肽的外源性供体模板组合使用时不仅可以用于敲除一个或多个靶基因，还可以用于引入(敲入)异源或外源性多核苷酸。
[0406]
在一些实施方案中，染色体基因敲除包含引入宿主细胞(例如，免疫细胞)的抑制性核酸分子，该分子包含编码与ha-1抗原结合(例如，特异性和/或选择性地)的抗原特异性受体的异源多核苷酸，其中抑制性核酸分子编码靶标特异性抑制剂并且其中编码的靶标特异性抑制剂抑制宿主免疫细胞中的内源性基因表达(即，免疫检查点、hla成分或tcr成分，或其任何组合的表达)。
[0407]
染色体基因敲除可以在使用敲除规程或剂后通过宿主免疫细胞的dna测序直接确认。
[0408]
染色体基因敲除也可以从敲除后基因表达的缺失(例如，由基因编码的mrna或多肽产物的缺失)推断。
[0409]
在一些实施方案中，本发明所涵盖的宿主细胞能够特异性地和/或选择性地包含肽-mhc(pmhc)复合物的50％或更多的靶细胞，该肽-mhc(pmhc)复合物包含在mhc的背景下的ha-1免疫原性肽分子。
[0410]
在一些实施方案中，修饰的免疫细胞在与包含肽-mhc(pmhc)复合物的靶细胞接触时能够产生细胞因子，该肽-mhc(pmhc)复合物包含在mhc分子的背景下的ha-1免疫原性肽。
[0411]
在一些实施方案中，细胞因子包括ifn-γ或il2。在一些实施方案中，细胞因子包括tnf-α。
[0412]
在一些实施方案中，当与表达ha-1的水平小于或等于约1,000转录物/百万转录物(tpm)、950tpm、900tpm、850tpm、800tpm、750tpm、700tpm、650tpm、600tpm、550tpm、500tpm、450tpm、400tpm、350tpm、300tpm、250tpm、200tpm、150tpm、100tpm、95tpm、90tpm、85tpm、80tpm、75tpm、70tpm、65tpm、60tpm、55tpm、50tpm、45tpm、40tpm、35tpm、34tpm、33tpm、
32tpm、31tpm、30tpm、29tpm、28tpm、27tpm、26tpm、25tpm、24tpm、23tpm、22tpm、21tpm、20tpm、19tpm、18tpm、17tpm、16tpm、15tpm、14tpm、13tpm、12tpm、11tpm、10tpm、9tpm、8tpm、7tpm、6tpm、5tpm、4tpm、3tpm、2tpm和1tpm，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如小于或等于约1,000tpm至小于或等于约35tpm)的靶细胞接触时，宿主细胞能够产生更高水平的细胞因子或细胞毒性分子。在一些实施方案中，低ha-1表达水平称为“杂合表达”，意思是在约1tpm和约35tpm之间，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如1-32tpm。例如，宿主细胞能够产生至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍或更多，或任何介于两者之间的范围(包括端值)，诸如1.2倍至2倍，更高水平的细胞因子或细胞毒性分子。
[0413]
在一些实施方案中，宿主细胞能够特异性和/或选择性地杀伤表达ha-1的靶细胞(例如，表达ha-1的过度增殖细胞)。在某些实施方案中，靶细胞表达：(i)包含氨基酸序列vlhddllea或由其组成的多肽；和(ii)匹配的mhc分子。
[0414]
在一些实施方案中，宿主细胞不表达ha-1抗原、不由权利要求1-30中任一项的结合蛋白识别、不属于血清型hla-a*02，和/或不表达hla-a*02等位基因，诸如hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:05、hla-a*02:06或hla-a*02:07等位基因。例如，患者可能接受来自ha-1阴性或hla-a*02:01阴性的健康供体的宿主细胞。从该供体(或工程化自体细胞)分离的干细胞，诸如造血干细胞，可以用作移植材料的来源。平行地，从同一供体分离的t细胞可以经遗传工程化改造以识别ha-1，诸如通过表达本文所述的ha-1结合蛋白。供体干细胞可以用于将细胞群(诸如重建的免疫系统)移植到患者体内，并且宿主细胞可以输注到患者体内，目的是引发高度特异性的抗肿瘤作用。工程化供体t细胞可以设计用于识别和消除表达ha-1的细胞，诸如患者的所有天然血细胞，包括例如癌细胞，如呈ha-1阳性的残留白血病细胞，从而预防复发和促进完全治愈。由于患者的新健康血细胞衍生自供体，并因此呈ha-1阴性、hla-a*02血清型阴性和/或hla-a*02:01阴性，本文所述的工程化细胞可能具有最小毒副作用。可以根据下文进一步描述的治疗性方法使用此类患者匹配的宿主细胞和治疗方法。
[0415]
在一些实施方案中，杀伤通过杀伤测定来确定。在一些实施方案中，通过以从20:1至0.625:1，例如从15:1至1.25:1、从10:1至1.5:1、从8:1到3:1、从6:1到5:1、20:1到5:1、10:1到2.5:1等的比率共培养宿主细胞和靶细胞来进行杀伤测定。在一些实施方案中，靶细胞用1μg/ml到50pg/ml的ha-1肽进行脉冲，例如，从1ug/ml至10ng/ml、500ng/ml至0.5ng/ml、从10ng/ml至10pg/ml、从250ng/ml至1ng/ml、从50ng/ml至5ng/ml、从20ng/ml至10ng/ml等。
[0416]
在一些实施方案中，当与表达ha-1的水平小于或等于约1,000个转录物/百万转录物(tpm)、950tpm、900tpm、850tpm、800tpm、750tpm、700tpm、650tpm、600tpm、550tpm、500tpm、450tpm、400tpm、350tpm、300tpm、250tpm、200tpm、150tpm、100tpm、95tpm、90tpm、85tpm、80tpm、75tpm、70tpm、65tpm、60tpm、55tpm、50tpm、45tpm、40tpm、35tpm、34tpm、33tpm、32tpm、31tpm、30tpm、29tpm、28tpm、27tpm、26tpm、25tpm、24tpm、23tpm、22tpm、21tpm、20tpm、19tpm、18tpm、17tpm、16tpm、15tpm、14tpm、13tpm、12tpm、11tpm、10tpm、9tpm、
8tpm、7tpm、6tpm、5tpm、4tpm、3tpm、2tpm和1tpm，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如小于或等于约1,000tpm至小于或等于约35tpm)的靶细胞接触时，宿主细胞能够杀死更高数量的靶细胞。在一些实施方案中，低ha-1表达水平被称为“杂合表达”，意思是在约1tpm和约35tpm之间，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，诸如1-32tpm。例如，宿主细胞可能能够杀伤至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍或更多，或任何介于两者之间的范围(包括端值)，诸如1.2倍到2倍，更高数量的靶细胞。
[0417]
本发明进一步提供包含至少一种本文所述宿主细胞的细胞群。细胞群可以是异质群，其包含含有所描述的重组表达载体中的任一者的宿主细胞，以及至少一种其他细胞，例如宿主细胞(例如，t细胞)，其不包含重组表达载体中的任一者，或不同于t细胞的细胞，例如b细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等。替代地，细胞群可以是基本上同质的群，其中该群主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如，基本上由其组成)。该群也可以是细胞的克隆群，其中该群的所有细胞是包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，使得该群的所有细胞包含重组表达载体。在本发明所涵盖的一个实施方案中，细胞群是包含宿主细胞的克隆群，该宿主细胞包含如本文所述的重组表达载体。
[0418]
在本发明所涵盖的实施方案中，群体中的细胞数量可以迅速扩增。t细胞数量的扩增可以通过本领域众所周知的多种方法中的任一种来实现(例如，美国专利号8,034,334和8,383,099，美国专利公开号2012/0244133，dudley et al.(2003)j.immunother.26:332-242，和riddell et al.(1990)j.immunol.methods 128:189-201)。例如，可以通过将t细胞与okt3抗体、il-2和饲养pbmc(例如，经照射的同种异体pbmc)一起培养来实现t细胞数量的扩增。
[0419]
v.药物组合物
[0420]
在本发明所涵盖的另一方面中，本文提供药物组合物，其包含本文所述的组合物(例如，结合蛋白、核酸、细胞等)和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
[0421]
术语“药学上可接受的”是指那些在合理的医学判断范围内适用于与人和动物组织接触而没有过度毒性、刺激性、变态反应，或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
[0422]
本发明所涵盖的药剂和其他组合物可以专门配制用于以固体或液体形式施用，包括适合于各种施用途径的那些，诸如(1)口服施用，例如，灌注(水溶液或非水溶液或混悬剂)、片剂、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂；(2)胃肠外施用，例如通过皮下、肌内或静脉内注射，例如作为无菌溶液或混悬剂；(3)局部应用，例如作为霜剂、软膏剂或喷雾剂应用于皮肤；(4)阴道内或直肠内，例如作为子宫托、霜剂或泡沫剂；或(5)气雾剂，例如，作为含有化合物的水性气雾剂、脂质体制剂或固体颗粒。考虑了用于本文所述的药剂或组合物的任何合适的形式因素，诸如但不限于片剂、胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂和灌肠剂。
[0423]
本发明所涵盖的药物组合物可以呈现为离散的剂型，诸如胶囊剂、小药囊(sachet)或片剂，或液体剂或气雾喷雾剂，每种剂型均含有预定量的活性成分，如粉末或颗
粒剂、溶液剂、溶液剂、或在水性或非水性液体中的混悬剂、水包油乳剂、油包水液体乳剂、用于重构的粉末、用于口服的粉末、瓶(包括瓶中的粉末或液体)、口服溶解薄膜、锭剂、糊剂、管剂、胶质(gum)和包装。此类剂型可以通过药学方法中的任一者制备。
[0424]
合适的赋形剂包括水、盐水、葡萄糖、甘油或类似物及其组合。在一些实施方案中，包含如本文所公开的宿主细胞、结合蛋白或融合蛋白的组合物进一步包含合适的输注介质。合适的输注介质可以是任何等渗介质配制剂，典型地可以利用生理盐水、normosol
tm-r(abbott)或plasma-lyte
tm a(baxter)、水中的5％右旋糖、林格乳酸盐。输注介质可以补充有人血清白蛋白或其他人血清成分。还考虑了包含有效量的宿主细胞或组合物的单位剂量。
[0425]
本文还提供了包含有效量的宿主细胞或有效量的包含宿主细胞的组合物的单位剂量。如本文所述，宿主细胞包括免疫细胞、t细胞(cd4
+ t细胞和/或cd8
+ t细胞)、细胞毒性淋巴细胞(例如细胞毒性t细胞和/或自然杀伤(nk)细胞)以及等等。例如，在一些实施方案中，单位剂量包含组合物，其包含单独或与其他细胞，诸如包括至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％的其他细胞组合的至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％，或至少约95％的工程化细胞。在一些实施方案中，不期望的细胞以降低的量存在或基本上不存在，诸如小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％，或小于约1％的组合物中的细胞群。
[0426]
组合物或单位剂量中的细胞的量是至少一种细胞(例如，至少一种工程化cd8
+ t细胞、工程化cd4
+ t细胞和/或nk细胞)或更典型地大于102个细胞，例如，多达106、多达107、多达108个细胞、多达109个细胞，或多于10
10
个细胞。在一些实施方案中，细胞以约106至约10
10
个细胞/m2的范围，诸如以约105至约109个细胞/m2的范围施用。细胞的数量将取决于组合物预期的最终用途以及其中包含的细胞类型。例如，经修饰以含有对特定抗原具有特异性的结合蛋白的细胞将包含含有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多此类细胞的细胞群。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少、500ml或更少、250ml或更少、或100ml或更少。在实施方案中，期望细胞的密度通常大于104个细胞/ml并且通常大于107个细胞/ml，通常为108个细胞/ml或更大。这些细胞可以在一段时间内以单次输注或多次输注的形式施用。可以将临床相关数量的免疫细胞分配到累积等于或超过106、107、108、109、10
10
或10
11
个细胞的多次输注中。在一些实施方案中，单位剂量的工程化免疫细胞可以与来自同种异体供体的造血干细胞共同施用(例如，同时或同时期)。
[0427]
药物组合物可以按照医学领域技术人员确定的适合待治疗(或预防)的疾病或病况的方式施用。组合物的适当剂量和合适持续时间和施用频率将由诸如患者的健康状况、患者的体型(即体重、质量或身体面积)、疾病的类型和严重程度、活性成分的特点形式和施用方法等因素决定。一般而言，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗性和/或防治性益处的量提供组合物(如本文所述，包括改善的临床结局，诸如更频繁的完全或部分缓解，或更长时间无病生存和/或总体生存，或症状严重程度的减轻)。
[0428]
药物组合物的有效量是指在所需剂量和时间段内足以实现本文所述的期望临床结果或有益治疗的量。可以在一次或多次施用中递送有效量。如果施用对象是已知或确认
患有疾病或疾病状态，则术语“治疗有效量”可以用于治疗，而“防治有效量”可以用于描述施用有效量至易患或处于发展疾病或疾病状态(例如，复发)风险中的受试者作为预防性过程。
[0429]
本文所述的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，诸如密封的安瓿或小瓶。此类容器可以冷冻以保持配制剂的稳定性，直到输注到患者体内。在一些实施方案中，单位剂量包含约107个细胞/m2至约10
11
个细胞/m2的剂量下的如本文所述的宿主细胞。开发合适的给药和治疗方案以在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物，包括例如胃肠外或静脉内施用或配制。
[0430]
如果胃肠外施用主题组合物，则该组合物还可以包括无菌水性或油性溶液或悬浮剂。合适的无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂包括水、林格氏溶液、等渗盐溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或聚乙二醇与水的混合物。水溶液或悬浮剂可以进一步包含一种或多种缓冲剂，诸如乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或酒石酸钠。当然，用于制备任何剂量单位配制剂的任何材料应该是药学纯的并且在所采用的量上基本上无毒。此外，活性化合物可以掺入缓释制剂和配制剂中。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位可能含有计算的预定数量的工程化免疫细胞或活性化合物，以与适当的药物载剂缔合产生期望的作用。
[0431]
在一些实施方案中，所描述的药物组合物在施用于受试者时可以引发针对表达ha-1的感兴趣细胞的免疫应答。此类药物组合物可以用作疫苗，用于防治性和/或治疗性治疗以表达ha-1抗原为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发。
[0432]
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含生理学上可接受的佐剂。在一些实施方案中，所采用的佐剂提供增加的药物组合物的免疫原性。此类进一步的免疫应答刺激化合物或佐剂可以是(i)在重构肽和任选与如上所定义的油基佐剂乳化之后混合到根据本发明的药物组合物中，(ii)可以是如上所定义的本发明所涵盖的重构组合物的部分，(iii)可以与待重构的肽物理连接或(iv)可以单独施用于待治疗的受试者、哺乳动物或人。佐剂可以是提供用于缓慢释放抗原的佐剂(例如，佐剂可以是脂质体)，或者其可以是本身具有免疫原性从而与抗原协同发挥功能的佐剂。例如，佐剂可以是已知的佐剂或促进抗原摄取、将免疫系统细胞募集到施用位点或促进应答淋巴样细胞的免疫激活的其他物质。佐剂包括但不限于免疫调节分子(例如细胞因子)、油和水乳剂、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、海藻酸钠、细菌佐剂、合成聚合物诸如聚氨基酸和辅酶氨基酸、皂苷、石蜡油和胞壁酰二肽的聚合物。在一些实施方案中，佐剂是佐剂65、α-galcer、磷酸铝、氢氧化铝、磷酸钙、β-葡聚糖肽、cpg dna、gm-csf、gpi-0100、ifa、ifn-γ、il-17、脂质a、脂多糖、lipovant、montanide
tm
、n-乙酰基-胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺、pam3csk4、quil a、海藻糖二霉菌酸酯或酵母聚糖。
[0433]
在一些实施方案中，佐剂是免疫调节分子。例如，免疫调节分子可以是重组蛋白细胞因子、趋化因子或免疫刺激剂或编码细胞因子、趋化因子或免疫刺激剂的核酸，旨在增强免疫应答。
[0434]
免疫调节细胞因子的实例包括干扰素(例如，ifnα、ifnβ和ifnγ)、白细胞介素(例如，il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、il-17和il-20)、肿瘤坏死因子(例如tnfα和tnfβ)、促红细胞生成素(epo)、flt-3配体、gip10、tca-3、mcp-1、
mif、mip-1.alpha.、mip-1β、rantes、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，以及前述任一者的功能片段。
[0435]
在一些实施方案中，与趋化因子受体即cxc、cc、c或cx3c趋化因子受体结合的免疫调节趋化因子也可以包括在本文提供的组合物中。趋化因子的实例包括但不限于mip1α、mip-1β、mip-3α(larc)、mip-3β、rantes、hcc-1、mpif-1、mpif-2、mcp-1、mcp-2、mcp-3、mcp-4、mcp-5、eotaxin、tarc、elc、i309、il-8、gcp-2gro-α、gro-β、gro-γ、nap-2、ena-78、gcp-2、ip-10、mig、i-tac、sdf-1和bca-1(blc)，以及前述任一者的功能片段。
[0436]
在一些实施方案中，组合物包含本文所述的结合蛋白(例如，tcr、tcr的抗原结合片段、car或包含tcr和效应物域的融合蛋白)、tcrα和/或tcrβ多肽。在一些实施方案中，组合物包含编码本文所述的结合蛋白、tcrα和/或tcrβ多肽的核酸，例如编码结合蛋白、tcrα和/或tcrβ多肽的dna分子。在一些实施方案中，组合物包含表达载体，该表达载体包含编码结合蛋白、tcrα和/或tcrβ多肽的开放阅读框。
[0437]
当由细胞(例如，t细胞、nk细胞等)摄取时，dna分子可以作为染色体外分子存在于细胞中和/或可以整合到染色体中。dna可以以质粒的形式引入细胞中，该质粒可以作为单独的遗传物质保留。替代地，可以将可以整合到染色体中的线性dna引入细胞中。任选地，当将dna引入细胞时，可以添加促进dna整合到染色体中的试剂。
[0438]
vi.用途和方法
[0439]
本文所述的组合物可以用于多种诊断、预后和治疗应用。在本文所述的任何方法中，诸如诊断方法、预后方法、治疗方法或其组合，方法的所有步骤可以由单个参与者或替代地由多于一个参与者执行。例如，诊断可以由提供治疗性治疗的参与者直接执行。替代地，提供治疗剂的人可以请求执行诊断测定。诊断师和/或治疗干预师可以解释诊断测定结果以确定治疗策略。类似地，此类替代过程可以应用于其他测定，诸如预后测定。
[0440]
在本发明所涵盖的一些用途和方法中，使用受试者或受试者样品。在一些实施方案中，受试者是动物。动物可以是任何性别，也可以处于任何发育阶段。在一些实施方案中，动物是脊椎动物，诸如哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是家养动物，诸如犬、猫、牛、猪、马、绵羊或山羊。在一些实施方案中，受试者是伴侣动物，诸如犬或猫。在一些实施方案中，受试者是家畜，诸如牛、猪、马、绵羊或山羊。在一些实施方案中，受试者是动物园动物。在一些实施方案中，受试者是研究动物，诸如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、犬、猪或非人灵长类动物。在一些实施方案中，动物是遗传工程动物。在一些实施方案中，动物是转基因动物(例如，转基因小鼠和转基因猪)。在一些实施方案中，受试者是鱼或爬行动物。
[0441]
在一些实施方案中，受试者是啮齿动物，诸如小鼠。在一些此类实施方案中，小鼠是转基因小鼠，诸如表达人mhc(即hla)分子的小鼠(例如，nicholson et al.(2012)adv.hematol.2012:404081)。在一些实施方案中，受试者是表达人tcr的转基因小鼠或抗原阴性小鼠(例如，li et al.(2010)nat.med.16:1029-1034和obenaus et al.(2015)nat.biotechnol.33:402-407)在一些实施方案中，受试者是表达人hla分子和人tcr的转基因小鼠。在一些实施方案中，诸如在受试者是转基因hla小鼠的情况下，鉴定的tcr经修饰，例如以嵌合或人源化。在一些实施方案中，tcr支架经修饰，诸如类似于已知的结合蛋白人源化方法。
[0442]
在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是以ha-1表达为特征的病症(例如，以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症的复发)的动物模型。例如，动物模型可以是人衍生癌症的原位异种移植动物模型。
[0443]
在一些实施方案中，受试者是人，诸如患有以ha-1表达为特征的病症的人。
[0444]
本文所述的方法可以用于治疗有此需要的受试者。如本文所用，“有此需要的受试者”包括患有以ha-1表达为特征的病症、以ha-1表达为特征的病症复发和/或易患以ha-1表达为特征的病症的任何受试者。如本文所述，以ha-1表达为特征的病症可以是以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症的复发。
[0445]
在本发明所涵盖的方法的一些实施方案中，受试者尚未经历以ha-1表达为特征的病症的治疗，诸如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法。在一些实施方案中，受试者已经经历以ha-1表达为特征的病症的治疗，诸如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法。
[0446]
在一些实施方案中，受试者已进行手术以除去癌性或癌前组织。在一些实施方案中，癌性组织尚未被移除，例如，癌性组织可能位于身体的不可手术区中，诸如在对生命至关重要的组织中，或在外科手术会对患者造成伤害的风险相当大的区中。
[0447]
在一些实施方案中，受试者或其细胞对相关疗法具有抗性，诸如对护理标准疗法、免疫检查点抑制剂疗法以及等等具有抗性。例如，调节本发明所涵盖的一种或多种生物标志物可以克服对免疫检查点抑制剂疗法的抗性。
[0448]
在一些实施方案中，受试者需要根据本文所述的组合物和方法进行调节，诸如已鉴定为具有不想要的不存在、存在或异常的ha-1表达。
[0449]
a.诊断方法
[0450]
在本发明所涵盖的一个方面，本文提供了用于检测ha-1抗原和/或表达ha-1的感兴趣细胞的存在或不存在的诊断方法，其包括通过使用本文所述的至少一种结合蛋白或至少一种宿主细胞检测样品中所述ha-1抗原的存在或不存在。在一些实施方案中，该方法进一步包括获得样品(例如，来自受试者)。在一些实施方案中，至少一种结合蛋白或至少一种宿主细胞在mhc分子的背景下与ha-1肽表位形成复合物，并且该复合物以荧光激活细胞分选(facs)、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、免疫化学、蛋白质印迹或细胞内流动测定的形式进行检测。
[0451]
在本发明所涵盖的一个方面，本文提供了用于检测受试者中的以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的水平的诊断方法，其包括：a)将从受试者获得的样品与本文所述的至少一种结合蛋白、至少一种宿主细胞或宿主细胞群接触；和b)检测反应性水平，其中与对照水平相比更高水平的反应性指示受试者中的以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的水平。
[0452]
在一些实施方案中，反应性水平由t细胞活化或效应物功能指示，诸如但不限于t细胞增殖、杀伤或细胞因子释放。对照水平可以是尚未暴露于以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的健康受试者的参考数字或水平。
[0453]
可以从受试者获得生物样品，用于确定针对本文所述的肽抗原(例如，ha-1抗原)的免疫应答的存在和水平。如本文所用，“生物样品”可以是血液样品(可以从中制备血清或血浆)、生检标本、体液(例如，血液、分离的pbmc、分离的t细胞、肺灌洗液、腹水、粘膜洗液、
滑液体液等)、骨髓、淋巴结、组织外植体、器官培养物或来自受试者或生物来源的任何其他组织或细胞制剂。生物样品也可以在接受任何药物组合物之前从受试者获得，该生物样品作为建立基线数据的对照是有用的。
[0454]
抗原特异性t细胞应答通常通过比较观察到的t细胞应答来确定，根据本文所述的t细胞功能参数(例如增殖、细胞因子释放、ctl活性、改变的细胞表面标志物表型等)中的任一者，这些参数可以在适当的背景下暴露于关联抗原(例如，当由免疫相容性抗原呈递细胞呈递时用于启动或激活t细胞的抗原)的t细胞和暴露于结构不同或不相关对照抗原的来自同一来源群体的t细胞之间进行。对关联抗原的应答大于对对照抗原的应答(具有统计学意义)，表示抗原特异性。
[0455]
免疫应答，诸如细胞毒性t淋巴细胞(ctl)免疫应答的水平可以通过本文所述的和本领域常规实践的众多免疫学方法中的任一者来确定。例如，ctl免疫应答的水平可以在施用由例如t细胞表达的本文所述的结合蛋白中的任一者之前和之后确定。可以使用本领域常规实践的若干技术和方法中的任一者来执行用于确定ctl活性的细胞毒性测定(例如，henkart el al.,"cytotoxic t-lymphocytes"in fundamental immunology,paul(ed.)(2003lippincott williams&wilkins,philadelphia,pa)，第1127-50页，以及其中引用的参考文献)。
[0456]
本发明部分地提供了用于准确分类生物样品是否与感兴趣的输出，诸如感兴趣的靶标的表达，例如ha-1相关联的方法、系统和代码。在一些实施方案中，本发明有助于使用统计算法和/或经验数据，将样品(例如，来自受试者)分类为与以ha-1表达为特征的病症的疗法相关联或处于对以ha-1表达为特征的病症的疗法有响应或无响应的风险。
[0457]
用于检测ha-1的量或活性并因此用于分类样品是否可能或不可能响应于以ha-1表达为特征的病症的疗法的示例性方法包括使生物样品与能够检测生物样品中ha-1的量或活性的药剂，诸如本文所述的ha-1免疫原性肽或结合剂接触。在一些实施方案中，该方法进一步包括获得生物样品，诸如来自测试受试者。在一些实施方案中，使用至少一种药剂，其中两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种此类药剂可以组合使用(例如，在夹心elisa中)或连续使用。在某些情况下，统计算法是单一学习统计分类器系统。例如，单一学习统计分类器系统可以用于基于预测或概率值以及生物标志物的存在或水平将样品分类为a。使用单一学习统计分类器系统通常以至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确性对样品进行分类。
[0458]
其他合适的统计算法是本领域技术人员所熟知的。例如，学习统计分类器系统包括能够适应复杂数据集(例如，感兴趣的标志物组)并基于此类数据集做出决策的机器学习算法技术。在一些实施方案中，使用单一学习统计分类器系统诸如分类树(例如，随机森林)。在其他实施方案中，使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个学习统计分类器系统的组合，优选串联使用。学习统计分类器系统的实例包括但不限于使用归纳学习(例如，决策/分类树，诸如随机森林、分类和回归树(c&rt)、提升树等)、可能近似正确(pac))学习、连接主义学习(例如，神经网络(nn)、人工神经网络(ann)、神经模糊网络(nfn)、网络结构、感知器诸如多层感知器、多层前馈网络、神经网络的应用、信念网络中的贝叶斯学习等)、强化学习
(例如，诸如朴素学习、自适应动态学习和时序差分学习的已知环境中的被动学习、未知环境中的被动学习、未知环境中的主动学习、学习动作-价值函数、强化学习的应用等)，以及遗传算法和进化编程的那些系统。其他学习统计分类器系统包括支持向量机(例如核方法)、多元自适应回归样条(mars)、levenberg-marquardt算法、gauss-newton算法、高斯混合、梯度下降算法和学习向量量化(lvq)。在某些实施方案中，本发明所涵盖的方法进一步包括将样品分类结果发送给临床医师，例如肿瘤学家。
[0459]
在一些实施方案中，受试者的诊断之后是基于诊断向个体施用治疗有效量的定义的治疗。
[0460]
在一些实施方案中，该方法进一步涉及获得对照生物样品(例如，来自未患有以ha-1表达为特征的病症的受试者、处于缓解期的受试者、其病症对治疗易感的受试者、疾病进展的受试者，或其他感兴趣的受试者的生物样品)。
[0461]
在本文所述的分析方法的一些实施方案中，将ha-1表达(例如，在来自受试者的样品中)与预定对照(标准)样品进行比较。来自受试者的样品典型地来自患病组织，诸如癌细胞或组织。对照样品可以来自同一受试者或来自不同受试者。对照样品典型地是正常的、未患病的样品。然而，在一些实施方案中，诸如用于疾病分期或用于评价治疗功效，对照样品可以来自患病组织。对照样品可以是来自若干不同受试者的样品的组合。在一些实施方案中，将来自受试者的ha-1表达测量与预定水平进行比较。这个预定水平典型地从正常样品中获得。如本文所述，“预定”表达可以用于(仅举例来说)评价可以选择用于治疗的受试者、评价对癌症的响应和/或评价对联合癌症疗法的响应。可以在具有或不具有以ha-1表达为特征的病症的患者群体中确定预定生物标志物量和/或活性测量。预定生物标志物量和/或活性测量可以是同样适用于每个患者的单个数字，或者预定生物标志物量和/或活性测量可以根据具体患者亚群而变化。受试者的年龄、体重、身高和其他因素可能影响个体的预定生物标志物量和/或活动测量。此外，可以针对每个受试者个别地确定预定生物标志物量和/或活性。在一个实施方案中，在本文所述的方法中确定和/或比较的量是基于绝对测量。
[0462]
在另一个实施方案中，在本文所述的方法中确定和/或比较的量是基于相对测量，诸如比率(例如，治疗前与治疗后此类生物标志物测量相对于加标或人造对照、此类生物标志物测量相对于管家基因的表达等的生物标志物拷贝数、水平和/或活性)。例如，相对分析可以基于治疗前生物标志物测量与治疗后生物标志物测量值的比率。可以在开始疗法之前的任何时间进行治疗前生物标志物测量。可以在开始疗法之后的任何时间进行治疗后生物标志物测量。在一些实施方案中，治疗后生物标志物测量在开始疗法之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周或更长时间，甚至更长时间无限期地进行，用于持续监测。治疗可以包括单独或与其他药剂(诸如抗癌剂如化学疗法或免疫检查点抑制剂)组合的治疗以ha-1表达为特征的病症的疗法。
[0463]
预定的ha-1表达可以是任何合适的标准。例如，预定的ha-1表达可以从正在评估受试者选择的相同或不同受试者获得。在一个实施方案中，预定生物标志物量和/或活性测量可以从同一患者的先前评估中获得。以此类方式，可以随时间监测患者选择的进展。此外，如果受试者是人，则对照可以从对另一人或多个人例如选定的人组的评估中获得。以此类方式，可以将正在评估选择的人的选择范围与合适的其他人，例如，与感兴趣的人处于类似情况的其他人，诸如患有类似或相同的病况和/或属于相同种族的那些人进行比较。
[0464]
在一些实施方案中，ha-1表达相对于预定水平的变化为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍或更大，或介于两者之间的任何范围(包括端值)。当测量是基于相对变化，诸如基于治疗前生物标志物测量值与治疗后生物标志物测量的比率时，此类截止值同样适用。
[0465]
在一些实施方案中，ha-1表达可以通过检测或定量ha-1多肽或其抗原，诸如通过使用本文所述的组合物来检测和/或定量。多肽可以通过本领域技术人员熟知的多种方法中的任一者，诸如通过免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定(ria)、酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫荧光测定、蛋白质印迹、结合剂-配体测定、免疫组织化学技术、凝集、补体测定、高效液相色谱(hplc)、薄层色谱(tlc)、超扩散色谱等来检测和定量(例如，basic and clinical immunology,sites and terr编,appleton and lange,norwalk,conn.pp 217-262,1991)。
[0466]
b.治疗方法
[0467]
在本发明所涵盖的一个方面，本文提供了用于预防和/或治疗以表达ha-1抗原为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发，和/或用于诱导针对感兴趣细胞，诸如表达ha-1抗原的过度增殖细胞的免疫应答的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含表达本文所述的至少一种结合蛋白的细胞的组合物。本发明所涵盖的方法也可以用于确定受试者中对针对以ha-1表达为特征的许多不同病症的疗法，诸如本文所述的那些的响应性。
[0468]
在一些实施方案中，本文提供用于预防和/或治疗某些过度增殖性病症(例如，血液恶性肿瘤)的方法。在某些实施方案中，血液恶性肿瘤包括白血病(例如，急性白血病或慢性白血病)。在具体实施方案中，白血病包括急性髓性白血病(aml)、急性淋巴细胞性白血病(all)、混合表型急性白血病(mpal)、慢性髓性白血病(cml)、b细胞幼淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性淋巴细胞性白血病(慢性淋巴细胞性白血病)。在某些实施方案中，血液恶性肿瘤包括淋巴瘤。在某些实施方案中，淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤(hl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、中枢神经系统淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、cd37+树突状细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜相关淋巴组织(malt)的结外边缘区b细胞淋巴瘤、结边缘区b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、恶性潜能不确定的b细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿和移植后淋巴增生性疾病。在某些实施方案中，血液恶性肿瘤包括骨髓增生异常病症(mds)，诸如，例如难治性血细胞减少症伴单系发育异常(难治性贫血、难治性中性粒细胞减少症和难治性血小板减少症)、难治性贫血伴环状铁粒幼细胞(rars)、难治性贫血伴环状铁粒幼细胞-血小板增多症(rars-t)、难治性血细胞减少伴多细胞发育不良(rcmd)、难治性血细胞减少伴多细胞发育不良和环状铁粒幼细胞(rcmd-rs)、难治性贫血伴原始细胞过多(raeb)、不可分类的骨髓增生异常、难治性儿童血细胞减少症、mds伴孤立del(5q)和其他众所周知的mds亚型(例如，参见万维网nbci.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc655460/上的2016年世界卫生组织mds分类)。在某些实施方案中，血液恶性肿瘤包括骨髓增生性赘生物(mpn)，诸如例如骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、慢性粒单核细胞白血病、慢性骨髓增生性疾病-不可分类、慢性中性粒细胞白
血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病和mpn-无具体指定。在进一步的实施方案中，血液恶性肿瘤包括骨髓瘤。
[0469]
在一些实施方案中，本文提供用于预防和/或治疗非恶性病症的方法。在某些实施方案中，患有这些非恶性病症的受试者已经经历或正在经历造血细胞移植。在一些实施方案中，非恶性病症选自下组：非恶性血液学(例如，镰状细胞贫血、地中海贫血、再生障碍性贫血、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(hlh)、严重再生障碍性贫血、骨髓衰竭综合征(包括范可尼贫血、diamond-blackfan贫血、shwachman diamond综合征以及其他)；免疫缺陷病症(例如，严重联合免疫缺陷(scid)、wiskott-aldrich综合征、omenn综合征、x连锁淋巴增生综合征、慢性肉芽肿病、白细胞粘附缺陷、digeorge综合征和其他众所周知的疾病，诸如造血干细胞移植(hct)的适应症，如在bethematchclinical.org/workarea/downloadasset.aspx？id-3545中列出的那些)；以及自身免疫性疾病(例如，系统性硬化症、肾小球肾炎、关节炎、扩张型心肌病样疾病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、克罗恩病、系统性红斑、慢性类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、过敏性接触性皮炎、多发性肌炎、厚皮病、结节性动脉周围炎、风湿热、寻常性白斑、胰岛素依赖性糖尿病、白塞病、桥本病、艾迪生病、皮肌炎、重症肌无力、赖特综合征、格雷夫斯病、恶性贫血、古德帕斯彻综合征、不育症、慢性活动性肝炎、天疱疮、自身免疫性血小板减少性紫癜，和自身免疫性溶血性贫血、活动性慢性肝炎、艾迪生病、抗磷脂综合征、特应性变态反应、自身免疫性萎缩性胃炎、胃酸缺乏自身免疫(achlorhydra autoimmune)、乳糜泻、库欣综合征、皮肌炎、盘状红斑狼疮、古德帕斯彻综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肾上腺萎缩、特发性血小板减少症、胰岛素依赖性糖尿病、lambert-eaton综合征、狼疮样肝炎、淋巴细胞减少症的一些病例、混合性结缔组织病、类天疱疮、寻常性天疱疮、恶性贫血、晶状体源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis)、结节性多动脉炎、多腺性自体综合征(polyglandular autosyndrome)、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、雷诺综合征、复发性多软骨炎、施密特综合征、局限性硬皮病(或crest综合征)、交感性眼炎、系统性红斑狼疮、takayasu动脉炎、颞动脉炎、甲状腺毒症、b型胰岛素抵抗、溃疡性结肠炎和韦格纳肉芽肿病)。在具体实施方案中，自身免疫病症是系统性硬化症或多发性硬化症。
[0470]
此外，本文所述的组合物也可以在联合疗法中施用以进一步调节期望活性。额外的药剂包括但不限于化学治疗剂、激素、抗血管生成剂、放射性标记的化合物，或伴随手术、冷冻疗法和/或放射疗法。前述治疗方法可以与其他形式的常规疗法(例如，本领域技术人员熟知的癌症护理标准疗法)结合，与常规疗法相继地、在常规疗法之前或之后施用。例如，这些调节剂可以与治疗有效剂量的化学治疗剂一起施用。在另一个实施方案中，这些调节剂与化学疗法结合施用以增强化学治疗剂的活性和功效。医师桌上手册(physicians’desk reference(pdr)，pdr)公开了已用于治疗各种癌症的化学治疗剂的剂量。治疗有效的这些上述化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定黑素瘤、疾病的程度和本领域技术人员熟悉的其他因素并且可以由医师确定。
[0471]
单独或与其他疗法(诸如癌症疗法)组合的使用本文所述的一种或多种组合物的疗法，可以用于接触表达ha-1的细胞和/或施用于期望的受试者，诸如指示为对疗法的可能响应者的受试者。在另一个实施方案中，一旦指示受试者不为对疗法的可能响应者(例如，如根据本文所述的诊断或预后方法评估的)，可以避免此类疗法，并且可能推荐和/或施用
替代治疗方案，诸如靶向和非靶向癌症疗法。
[0472]
术语“靶向疗法”是指与选定的生物分子选择性相互作用从而治疗癌症的药剂的施用。例如，关于抑制免疫检查点抑制剂的靶向疗法联合本发明所涵盖的方法是有用的。
[0473]
术语“免疫疗法”通常是指以有益方式调节免疫应答的任何策略，并涵盖通过以下方法治疗患有疾病或有风险感染疾病或遭受疾病复发的受试者，该方法包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答，以及使用受试者免疫系统的某些部分来对抗疾病(诸如癌症)的任何治疗。在有或没有为此目的施用一种或多种药剂的情况下，受试者自身的免疫系统受到刺激(或抑制)。旨在引发或放大免疫应答的免疫疗法称为“激活免疫疗法”。旨在减少或抑制免疫应答的免疫疗法称为“抑制免疫疗法”。在一些实施方案中，免疫疗法对感兴趣的细胞诸如癌细胞具有特异性。在一些实施方案中，免疫疗法可以是“非靶向的”，这是指不与免疫系统细胞选择性相互作用但仍调节免疫系统功能的药剂的施用。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。
[0474]
一些形式的免疫疗法是靶向疗法，其可以包括例如使用癌症疫苗和/或致敏的抗原呈递细胞。例如，溶瘤病毒是能够感染和裂解癌细胞，同时不伤害正常细胞的病毒，这使得它们在癌症疗法中潜在有用。溶瘤病毒的复制既促进肿瘤细胞的破坏，又在肿瘤部位产生剂量放大。它们还可以充当抗癌基因的载体，使它们能够特异性地递送到肿瘤部位。免疫疗法可能涉及用于短期保护宿主的被动免疫，其通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的预成形抗体来实现(例如，施用针对肿瘤抗原的单克隆抗体，任选地连接至化学治疗剂或毒素)。免疫疗法也可能侧重于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别的表位。替代地，反义多核苷酸、核酶、rna干扰分子、三螺旋多核苷酸以及等等可以用于选择性调节与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病理相关的生物分子。类似地，免疫疗法也可以采用基于细胞的疗法的形式。例如，过继性细胞免疫疗法是使用免疫细胞(诸如t细胞)的免疫疗法，生成对患者的癌症具有天然或遗传工程化反应性的免疫细胞，然后将其转移回癌症患者体内。注射大量活化的肿瘤特异性t细胞可能导致癌症的完全和持久消退。
[0475]
免疫疗法可能涉及用于短期保护宿主的被动免疫，其通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的预成形抗体来实现(例如，施用针对肿瘤抗原的单克隆抗体，任选地连接至化学治疗剂或毒素)。免疫疗法也可能侧重于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别的表位。替代地，反义多核苷酸、核酶、rna干扰分子、三螺旋多核苷酸以及等等可以用于选择性调节与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病理相关的生物分子。
[0476]
在一些实施方案中，免疫治疗剂是免疫刺激分子的激动剂；免疫抑制分子的拮抗剂；趋化因子的拮抗剂；刺激t细胞活化的细胞因子的激动剂；拮或抑制抑制t细胞活化的细胞因子的剂；和/或结合b7家族的膜结合蛋白的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是免疫抑制分子的拮抗剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂可以是针对细胞因子、趋化因子和生长因子的药剂，例如中和肿瘤相关细胞因子、趋化因子、生长因子和其他可溶性因子(包括il-10、tgf-β和vegf)的抑制作用的中和抗体。
[0477]
在一些实施方案中，免疫疗法包括一种或多种免疫检查点的抑制剂。术语“免疫检查点”是指cd4+和/或cd8+ t细胞细胞表面的一组分子，它们通过调节抗癌免疫应答，诸如下调或抑制抗肿瘤免疫应答来微调免疫应答。免疫检查点蛋白是本领域众所周知的，包括但不限于ctla-4、pd-1、vista、b7-h2、b7-h3、pd-l1、b7-h4、b7-h6、icos、hvem、pd-l2、
cd200r、cd160、gp49b、pir-b、krlg-1、kir家族受体、tim-1、tim-3、tim-4、lag-3(cd223)、ido、gitr、4-ibb、ox-40、btla、sirpalpha(cd47)、cd48、2b4(cd244)、b7.1、b7.2、ilt-2、ilt-4、tigit、hhla2、嗜乳脂蛋白和a2ar(参见，例如，wo 2012/177624)。该术语进一步涵盖生物活性蛋白质片段，以及编码全长免疫检查点蛋白质的核酸。
[0478]
一些免疫检查点是“免疫抑制性免疫检查点”，涵盖抑制、下调或抑制免疫系统功能(例如免疫应答)的分子(例如蛋白质)。例如，pd-l1(程序性死亡配体1)，也称为cd274或b7-h1，是传递抑制性信号的蛋白质，其降低t细胞的增殖以抑制免疫系统。ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4)，也称为cd152，是抗原呈递细胞表面的蛋白质受体，其充当免疫检查点(“关闭”开关)以下调免疫应答。tim-3(t细胞免疫球蛋白和含粘蛋白域-3)，也称为havcr2，是细胞表面蛋白，其充当免疫检查点以调节巨噬细胞活化。vista(t细胞活化的v域ig阻抑物)是i型跨膜蛋白，其作为免疫检查点发挥功能以抑制t细胞效应物功能并维持外周耐受性。lag-3(淋巴细胞激活基因3)是免疫检查点受体，其负向调节t细胞的增殖、激活和稳态。btla(b和t淋巴细胞衰减物)是经由与肿瘤坏死家族受体(tnf-r)的相互作用来展示t细胞抑制的蛋白质。kir(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)是在nk细胞和少数t细胞上表达的蛋白质家族，其抑制nk细胞的细胞毒活性。在一些实施方案中，免疫治疗剂可以是对免疫抑制酶具有特异性的药剂，诸如可以阻断精氨酸酶(arg)和吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)活性的抑制剂，arg和ido是抑制t细胞和nk细胞的免疫检查点蛋白，其改变免疫抑制肿瘤微环境中氨基酸精氨酸和色氨酸的分解代谢。抑制剂可以包括但不限于靶向表达arg的m2巨噬细胞的n-羟基-l-arg(noha)、同时阻断arg和一氧化氮合酶(nos)的硝基阿司匹林或西地那非和ido抑制剂，诸如1-甲基色氨酸。该术语进一步涵盖活性蛋白片段，以及编码全长免疫检查点蛋白及其生物活性蛋白片段的核酸。在一些实施方案中，该术语进一步涵盖根据本文提供的同源性描述的任何片段。
[0479]
相比之下，其他免疫检查点是“免疫刺激性，涵盖激活、刺激或促进免疫系统功能(例如免疫应答)的分子(例如蛋白质)。在一些实施方案中，免疫刺激分子是cd28、cd80(b7.1)、cd86(b7.2)、4-1bb(cd137)、4-1bbl(cd137l)、cd27、cd70、cd40、cd40l、cd122、cd226、cd30、cd30l、ox40、ox40l、hvem、btla、gitr及其配体gitrl、light、ltβr、ltαβ、icos(cd278)、icosl(b7-h2)和nkg2d。cd40(分化簇40)是在抗原呈递细胞上发现的共刺激蛋白，是抗原呈递细胞激活所必需的。ox40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf4)或cd134，其通过防止t细胞死亡并随后增加细胞因子的产生而参与激活后免疫应答的维持。cd137是肿瘤坏死因子受体(tnf-r)家族的成员，其共刺激活化t细胞以增强增殖和t细胞生存。cd122是白细胞介素2受体(il-2)蛋白的亚基，其促进未成熟t细胞分化为调节性、效应性或记忆性t细胞。cd27是肿瘤坏死因子受体超家族的成员并且充当共刺激免疫检查点分子。cd28(分化簇28)是在t细胞上表达的蛋白质，其提供t细胞活化和生存所需的共刺激信号。gitr(糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白)，也称为tnfrsf18和aitr，是在由调节性t细胞维持的显性免疫自身耐受中起关键作用的蛋白质。icos(诱导性t细胞共刺激物)，也称为cd278，是cd28超家族共刺激分子，其活化t细胞上表达并且在t细胞信号传导和免疫应答中发挥作用。
[0480]
免疫检查点及其序列在本领域中是众所周知的，并且代表性实施方案在下文进一步描述。免疫检查点通常与抑制性受体和天然结合配偶体(例如配体)对有关。例如，pd-1多
肽是抑制性受体，能够将抑制性信号传递给免疫细胞，从而抑制免疫细胞效应物功能，或者能够促进免疫细胞的共刺激(例如，通过竞争性抑制)，例如，当以可溶性单体形式存在时。优选的pd-1家族成员与pd-1共享序列同一性并结合至一个或多个b7家族成员，例如b7-1、b7-2、pd-1配体和/或抗原呈递细胞上的其他多肽。术语“pd-1活性”包括pd-1多肽调节活化免疫细胞中的抑制性信号的能力，例如，通过接合抗原呈递细胞上的天然pd-1配体。免疫细胞中抑制性信号的调节导致免疫细胞增殖和/或免疫细胞的细胞因子分泌的调节。因此，术语“pd-1活性”包括pd-1多肽结合其天然配体的能力、调节免疫细胞抑制性信号的能力和调节免疫应答的能力。术语“pd-1配体”是指pd-1受体的结合配偶体，并且包括pd-l1(freeman et al.(2000)j.exp.med.192:1027-1034)和pd-l2(latchman et al.(2001)nat.immunol.2:261)两者。术语“pd-1配体活性”包括pd-1配体多肽结合其天然受体(例如pd-1或b7-1)的能力、调节免疫细胞抑制性信号的能力，以及调节免疫应答的能力。
[0481]
如本文所用，术语“免疫检查点疗法”是指使用抑制免疫抑制性免疫检查点，诸如抑制它们的核酸和/或蛋白质的药剂。抑制一个或多个此类免疫检查点可以阻断或以其他方式中和抑制性信号传导，从而上调免疫应答以便更有效地治疗癌症。用于抑制免疫检查点的示例性药物包括可以结合和/或灭活或抑制免疫检查点蛋白或其片段的抗体、小分子、肽、肽模拟物、天然配体和天然配体的衍生物；以及可能下调免疫检查点核酸或其片段的表达和/或活性的rna干扰、反义、核酸适体等。用于上调免疫应答的示例性药物包括针对一种或多种免疫检查点蛋白的抗体，这些抗体阻断蛋白与其天然受体之间的相互作用；一种或多种免疫检查点蛋白的非激活形式(例如显性失活多肽)；阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间相互作用的小分子或肽；与其天然受体结合的融合蛋白(例如，与抗体或免疫球蛋白的fc部分融合的免疫检查点抑制蛋白的胞外部分)；阻断免疫检查点核酸转录或翻译的核酸分子；以及等等。此类药剂可以直接阻断一个或多个免疫检查点与其天然受体(例如抗体)之间的相互作用以防止抑制性信号传导并上调免疫应答。替代地，药剂可以间接阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用，以防止抑制性信号传导并上调免疫应答。例如，免疫检查点蛋白配体的可溶性形式(诸如稳定化细胞外域)可能与其受体结合，从而间接降低受体与适当配体结合的有效浓度。在一个实施方案中，单独或组合使用抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和/或抗pd-l2抗体来抑制免疫检查点。用于阻断pd-1途径的治疗剂包括拮抗性抗体和可溶性pd-l1配体。针对pd-1和pd-l1/2抑制性途径的拮抗剂可以包括但不限于针对pd-1或pd-l1/2的拮抗性抗体(例如，美国专利号8,008,449中公开的17d8、2d3、4h1、5c4(也称为纳武单抗或bms-936558)、4a11、7d3和5f4)；amp-224、匹地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、派姆单抗(pembrolizumab)和美国专利号8,779,105；8,552,154；8,217,149；8,168,757；8,008,449；7,488,802；7,943,743；7,635,757；和6,808,710中公开的抗体。类似地，额外的代表性检查点抑制剂可以是但不限于针对抑制性调节剂ctla-4的抗体(抗细胞毒性t淋巴细胞抗原4抗细胞毒性t淋巴细胞抗原4)的抗体，诸如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)(完全人源化)、抗cd28抗体、抗ctla-4adnectin、抗ctla-4域抗体、单链抗ctla-4抗体片段、重链抗ctla-4片段、轻链抗ctla-4片段和其他抗体，诸如美国专利号8,748,815；8,529,902；8,318,916；8,017,114；7,744,875；7,605,238；7,465,446；7,109,003；7,132,281；6,984,720；6,682,736；6,207,156；和5,977,318以及ep专利号1212422、美国专利公开号2002/0039581和2002/086014，以及
hurwitz et al.(1998)proc.natl.acad.sci.u.s.a.95:10067-10071中公开的抗体。
[0482]
针对pd-1、pd-l1、pd-l2和ctla-4例举的免疫检查点活性、配体、阻断等的代表性定义通常适用于其他免疫检查点。
[0483]
术语“非靶向治疗”是指不与选定的生物分子选择性相互作用但仍治疗癌症的药剂的施用。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。
[0484]
在一个实施方案中，使用化学疗法。化学疗法包括施用化学治疗剂。这样的化学治疗剂可以是但不限于选自以下化合物组的那些：铂化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、烷化剂、砷化合物、dna拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、核苷类似物、植物生物碱和毒素；及其合成衍生物。示例性试剂包括但不限于烷化剂：氮芥(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、曲磷酰胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥、雌莫司汀和美法仑)、亚硝基脲类(例如卡莫司汀(bcnu)和洛莫司汀(ccnu))、烷基磺酸盐(例如白消安和苏消安(treosulfan))、三氮烯(例如达卡巴嗪、替莫唑胺)、顺铂、苏消安和曲磷酰胺；植物生物碱：长春花碱、紫杉醇、多西紫杉醇(docetaxol)；dna拓扑异构酶抑制剂：替尼泊苷、克利那托(crisnatol)和丝裂霉素；抗叶酸剂：甲氨蝶呤、麦考酚酸和羟基脲；嘧啶类似物：5-氟尿嘧啶、去氧氟尿苷(doxifluridine)和胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)；嘌呤类似物：巯基嘌呤和硫鸟嘌呤；dna抗代谢物：2
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脱氧-5-氟尿嘧啶核苷、阿非迪霉素甘氨酸盐(aphidicolin glycinate)和pyrazoloimidazole；和抗有丝分裂剂：软海绵素、秋水仙碱和根瘤菌素(rhizoxin)。类似地，另外的示例性药剂包括含铂化合物(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂)、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨)、紫杉烷类(例如，紫杉醇或紫杉醇等效物，诸如纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇(abraxane)、二十二碳六烯酸结合型紫杉醇(dha-紫杉醇、taxoprexin)、聚谷氨酸结合型紫杉醇(pg-紫杉醇、paclitaxelpoliglumex、ct-2103、xyotax)、肿瘤激活前药(tap)ang1005(结合到三个紫杉醇分子的angiopep-2)、紫杉醇-ec-1(结合到erbb2-识别肽ec-1的紫杉醇)和葡萄糖缀合的紫杉醇，例如2
’‑
紫杉醇甲基2-吡喃葡萄糖基琥珀酸酯；多西他赛(docetaxel)、紫杉酚(taxol))、表鬼臼素(epipodophyllin)(例如，依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、托泊替康、9-氨基喜树碱、开普拓伊立替康(camptoirinotecan)、伊立替康、克利那托、丝裂霉素c)、抗代谢物、dhfr抑制剂(例如，甲氨蝶呤、二氯甲氨蝶呤、三甲曲沙(trimetrexate)、依达曲沙)、imp脱氢酶抑制剂(例如麦考酚酸、噻唑呋林、利巴韦林和eicar)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如羟基脲和去铁胺)、尿嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶(5-fu)、氟尿苷、去氧氟尿苷、ratitrexed、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、卡培他滨)、胞嘧啶类似物(例如阿糖胞苷(cytarabine，ara c)、胞嘧啶阿拉伯糖苷和氟达拉滨)、嘌呤类似物(例如巯基嘌呤和硫鸟嘌呤)、维生素d3类似物(例如eb 1089、cb 1093和kh 1060)、异戊二烯化抑制剂(例如洛伐他汀)、多巴胺能神经毒素(例如1-甲基-4-苯基吡啶离子)、细胞周期抑制剂(例如星形孢菌素(staurosporine))、放线菌素(例如放线菌素d、更生霉素(dactinomycin))、博来霉素(例如博来霉素a2、博来霉素b2、培洛霉素(peplomycin))、蒽环类药物(例如柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、聚乙二醇脂质体多柔比星、伊达比星、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星、米托蒽醌(mitoxantrone))、mdr抑制剂(例如维拉帕米(verapamil))、ca
2+
atp酶抑制剂(例如毒胡萝卜素)、伊马替尼、沙利度胺、来那度胺、酪氨酸激酶抑制剂(例如阿昔替尼(ag013736)、博舒替尼(ski-606)、西地尼布(recentin
tm
、
azd2171)、达沙替尼(bms-354825)、厄洛替尼吉非替尼伊马替尼(cgp57148b、sti-571)、拉帕替尼来他替尼(cep-701)、来那替尼(hki-272)、尼洛替尼司马沙尼(semaxinib，su5416)、舒尼替尼(su11248)、托拉尼布(toceranib)凡德他尼(zd6474)、瓦他拉尼(vatalanib)(ptk787、ptk/zk)、曲妥珠单抗(trastuzumab)贝伐珠单抗(bevacizumab)利妥昔单抗西妥昔单抗帕尼单抗雷珠单抗(ranibizumab)尼洛替尼索拉非尼依维莫司阿仑单抗吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)替西罗莫司(temsirolimus)enmd-2076、pci-32765、ac220、多韦替尼乳酸盐(dovitinib lactate)(tki258、chir-258)、bibw 2992(tovok
tm
)、sgx523、pf-04217903、pf-02341066、pf-299804、bms-777607、abt-869、mp470、bibf 1120ap24534、jnj-26483327、mgcd265、dcc-2036、bms-690154、cep-11981、替沃扎尼(tivozanib)(av-951)、osi-930、mm-121、xl-184、xl-647和/或xl228)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、mtor抑制剂(例如，雷帕霉素、替西罗莫司(cci-779)、依维莫司(rad-001)、利达氟奥司(ridaforolimus)、ap23573(ariad)、azd8055(astrazeneca)、bez235(novartis)、bgt226(norvartis)、xl765(sanofiaventis)、pf-4691502(pfizer)、gdc0980(genentech)、sf1126(semafoe)和osi-027(osi))、奥利默森(oblimersen)、吉西他滨、洋红霉素(carminomycin)、亚叶酸(leucovorin)、培美曲塞、环磷酰胺、达卡巴嗪、甲基苄肼(procarbizine)、泼尼松龙、地塞米松、喜树碱(campathecin)、普卡霉素、天冬酰胺酶、氨基蝶呤、甲氨蝶呤(methopterin)、泊非霉素(porfiromycin)、美法仑(melphalan)、异长春碱(leurosidine)、环氧长春碱(leurosine)、苯丁酸氮芥、曲贝替定(trabectedin)、甲基苄肼(procarbazine)、圆皮海绵内酯(discodermolide)、洋红霉素、氨基蝶呤和六甲基三聚氰胺(hexamethyl melamine)。还可以使用包含一种或多种化学疗法剂(例如，flag、chop)的组合物。flag包含氟达拉滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(ara-c)和g-csf。chop包括环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松。在另一个实施方案中，使用parp(例如，parp-1和/或parp-2)抑制剂，并且此类抑制剂是本领域熟知的(例如，olaparib、abt-888、bsi-201、bgp-15(n-gene research laboratories,inc.)；ino-1001(inotek pharmaceuticals inc.)；pj34(soriano et al.,2001；pacher et al.,2002b)；3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide)(trevigen)；4-氨基-1,8-萘酰亚胺(4-amino-1,8-naphthalimide)；(trevigen)；6(5h)-菲啶酮(trevigen)；苯甲酰胺(美国专利re.36,397)；和nu1025(bowman et al.)。作用机制通常与parp抑制剂结合parp的能力相关并降低其活性。parp催化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)转化为烟酰胺和聚-adp-核糖(par)。聚(adp-核糖)和parp两者与转录调节、细胞增殖、基因组稳定性和致癌作用有关(bouchard et.al.(2003)exp.hematol.31:446-454)；
herceg(2001)mut.res.477:97-110)。聚(adp-核糖)聚合酶1(parp1)是dna单链断裂(ssb)修复中的关键分子(de murcia j.et al.(1997)proc.natl.acad.sci.u.s.a.94:7303-7307；schreiber et al.(2006)nat.rev.mol.cell biol.7:517-528；wang et al.(1997)genes dev.11:2347-2358)。通过抑制parp1功能敲除ssb修复诱导dna双链断裂(dsb)，这可能在同源定向dsb修复缺陷的癌细胞中触发合成致死性(bryant et al.(2005)nature 434:913-917；farmer et al.(2005)nature434:917-921)。化学治疗剂的前述实例是说明性的而不旨在限制。
[0485]
在另一个实施方案中，使用放射疗法。放射疗法中使用的辐射可以是电离辐射。放射疗法也可以是伽马射线、x射线或质子束。放射疗法的实例包括但不限于外射束放射疗法、放射性同位素(i-125、钯、铱)的间质植入、放射性同位素诸如锶89、胸部放射疗法、腹膜内p-32放射疗法、和/或全腹部和盆腔放射疗法。有关放射疗法的一般综述，参见hellman,chapter 16:principles of cancer management:radiation therapy,第6版,2001,devita等人编,j.b.lippencott company,philadelphia。放射疗法可以作为外射束放射或远距离放射疗法(teletherapy)进行施用，其中放射是从远程源引导的。放射治疗也可以作为内部疗法或近距离放射疗法(brachytherapy)进行施用，其中将放射源放置在靠近癌细胞或肿瘤块的身体内部。还涵盖使用光动力疗法，包括施用光敏剂，诸如血卟啉及其衍生物、维托泊芬(vertoporfin)(bpd-ma)、酞菁、光敏剂pc4、去甲氧基-竹红菌素a(demethoxy-hypocrellin a)；和2ba-2-dmha。
[0486]
在另一个实施方案中，使用激素疗法。激素治疗性治疗可以包括，例如，激素激动剂、激素拮抗剂(例如，氟他胺、比卡鲁胺、他莫昔芬、雷洛昔芬、醋酸亮丙瑞林(lupron)、lh-rh拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂，以及类固醇(例如，地塞米松、类视黄醇、deltoids、倍他米松、皮质醇、可的松、泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕激素)、维生素a衍生物(例如，全反式维甲酸(atra))；维生素d3类似物；抗孕激素(antigestagens)(例如米非司酮、奥那司酮)或抗雄激素(例如醋酸环丙孕酮)。
[0487]
在一方面，本文提供了在受试者中引发针对表达ha-1抗原的细胞的免疫应答的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用本文所述的药物组合物，其中该药物组合物在施用于受试者时引发针对表达ha-1抗原的细胞的免疫应答。
[0488]
在一些实施方案中，免疫应答可以包括细胞介导的免疫应答。细胞免疫应答是涉及t细胞的应答，并且可以在体外、离体或体内确定。例如，一般细胞免疫应答可以确定为在施用药物组合物后的合适时间从受试者采样的细胞(例如，外周血白细胞(pbl))中的t细胞增殖活性。在将例如pbmc与刺激物温育适当时间后，可以测定[3h]胸苷掺入。可以使用流式细胞术确定正在增殖的t细胞子集。
[0489]
在本发明所涵盖的另一方面，本文提供的方法包括如上所述施用于人和非人哺乳动物施两者。还考虑了兽医应用。在一些实施方案中，受试者可以是可以在其中引发免疫应答的任何活生物体。
[0490]
在一些实施方案中，药物组合物可以在任何合适的时间施用。例如，可以在治疗患有以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的受试者之前或期间进行施用，并且在以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症的复发在临床上变得不可检测之后继续施用。还可以在显示复发迹象的受
试者中继续施用。
[0491]
在一些实施方案中，药物组合物可以治疗或防治有效量施用。可以使用已知的规程并且以足以实现期望效果的剂量和时间段向受试者施用药物组合物。
[0492]
在一些实施方案中，药物组合物可在任何合适的部位施用于受试者。施用可以使用本领域公知的方法来完成。药剂(包括细胞)可以通过直接注射或通过本领域使用的任何其他手段引入期望位点，该手段包括但不限于血管内、脑内、胃肠外、腹膜内、静脉内、硬膜外、脊柱内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内或肌内施用。例如，感兴趣的受试者可以通过各种途径用经移植细胞进行移植。此类途径包括但不限于静脉内施用、皮下施用、至特定组织的施用(例如灶移植)、至股骨骨髓腔中的注射、至脾脏中的注射、胎肝肾囊下施用以及等等。在某些实施方案中，将本发明所涵盖的癌症疫苗瘤内或皮下注射给受试者。细胞可以在一次输注中施用，或通过在足以生成期望效果的规定时间段内连续输注施用。用于经移植细胞的移植、植入评估和标志物表型分析的示例性方法在本领域是众所周知的(参见，例如，pearson et al.(2008)curr.protoc.immunol.81:15.21.1-15.21.21；ito et al.(2002)blood100:3175-3182；traggiai et al.(2004)science 304:104-107；ishikawa et al.blood(2005)106:1565-1573；shultz et al.(2005)j.immunol.174:6477-6489；和holyoake et al.(1999)exp.hematol.27:1418-1427)。在一些实施方案中，剂量可以以有效产生期望响应的量和时间段施用，无论是引发免疫应答还是以ha-1抗原的表达和/或与之相关联的症状为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的防治性或治疗性治疗。
[0493]
药物组合物可以在其他疗法之后、之前或同时期给予，该其他疗法包括也在受试者中引发免疫应答的疗法。例如，受试者可以先前或并行地由其他形式的免疫调节剂治疗，此类其他疗法可以以不干扰本文所述组合物的免疫原性的方式提供。
[0494]
施用可以由护理人员(例如，医师、兽医)适当地定时，并且可以取决于受试者的临床状况、施用的目的和/或还在考虑或施用的其他疗法。在一些实施方案中，可以施用初始剂量，并且监测受试者的免疫学和/或临床响应。合适的免疫学监测方法包括使用患者的外周血淋巴细胞(pbl)作为响应物，并且使用本文所述的免疫原性肽或肽-mhc复合物作为刺激物。免疫应答也可以通过施用部位处的延迟炎症应答来确定。可以视情况在初始剂量之后给予一剂或多剂，典型地每月一次、每半个月一次或每周一次，直到达到期望效果。此后，可以根据需要给予额外的加强剂量或维持剂量，特别是当免疫学或临床益处似乎消退时。
[0495]
通常，合适的剂量和治疗方案以足以提供益处的量提供活性分子或细胞。此类响应可以通过在治疗的受试者中建立与未治疗的受试者相比改善的临床结局(例如，更频繁的缓解、完全或部分或更长的无病生存)来监测。对病毒蛋白的预先存在的免疫应答的增加通常与改善的临床结局相关。通常可以使用常规的标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定来评估此类免疫应答。
[0496]
对于防治性使用，剂量应足以预防疾病或病症相关的疾病、延迟与疾病或病症相关的疾病的发作或减轻疾病或病症相关的疾病的严重程度。根据本文所述方法施用的免疫原性组合物的防治性益处可以通过执行临床前(包括体外、离体和体内动物研究)和临床研究以及通过适当的统计、生物学和生物学分析从中获得的数据来确定临床方法和技术，其中所有均可以很容易地由普通技术人员实践。
[0497]
如本文所用，组合物的施用是指将其递送给受试者，而不考虑递送的途径或方式。施用可以连续或间歇地和胃肠外地实现。施用可以用于治疗已经确认为具有公认病症、疾病或疾病状态的受试者，或用于治疗易患或有风险发展此类病症、疾病或疾病状态的受试者。与辅助疗法的共同施用可以包括以任何次序和按任何给药方案同时和/或序贯递送多种药剂(例如，具有一种或多种细胞因子的工程化免疫细胞；免疫抑制疗法，诸如钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、微管抑制剂、低剂量的麦考酚酸前药，或其任何组合)。
[0498]
在一些实施方案中，将本文所述的多个剂量的宿主细胞(例如，工程化免疫细胞)施用于受试者，其可以以约两周至约四个周的施用间隔施用。
[0499]
本发明所涵盖的治疗或预防方法可以作为治疗过程或方案的一部分施用于受试者，该治疗过程或方案可以包括在施用本公开的单位剂量、细胞或组合物之前或之后的额外治疗。例如，在一些实施方案中，接受单位剂量的宿主细胞(例如，工程化免疫细胞)的受试者正在接受或先前已经接受造血细胞移植(hct；包括清髓性和非清髓性hct)。在前述实施方案中的任一者中，用于hct中的造血细胞可以是“通用供体”细胞，其经修饰以减少或消除编码选自mhc、抗原和结合蛋白的内源性蛋白的一种或多种内源性基因的表达(例如，根据本文所述的方法通过染色体基因敲除)。
[0500]
用于执行细胞移植的技术和方案是本领域已知的并且可以包括任何合适的供体细胞的移植，诸如衍生自脐带血、骨髓或外周血的细胞、造血干细胞、动员的干细胞或来自羊水中细胞。因此，在一些实施方案中，本发明所涵盖的宿主细胞(例如，工程化免疫细胞)可以与干细胞疗法一起施用或在干细胞疗法之后不久施用。
[0501]
在一些实施方案中，本发明所涵盖的方法可以进一步包括在联合疗法中施用一种或多种额外的药剂来治疗疾病或病症(例如，以表达ha-1抗原为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症的复发)。例如，在一些实施方案中，联合疗法包括将本发明所涵盖的宿主细胞或结合蛋白与抗病毒剂一起施用(并行地、同时地或序贯地)。在一些实施方案中，联合疗法包括将本发明所涵盖的宿主细胞或结合蛋白与洛匹那韦/利托那韦、氯喹、利巴韦林、类固醇药物、羟氯喹和/或干扰素α一起施用。在一些实施方案中，联合疗法包括将本发明所涵盖的宿主细胞、组合物或单位剂量的宿主细胞与二级疗法，诸如手术、抗体、疫苗或其任何组合一起施用。
[0502]
在一些实施方案中，受试者是人，诸如患有以表达ha-1抗原为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的人。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物，诸如小鼠。在一些此类实施方案中，小鼠是转基因小鼠，诸如表达人mhc(即hla)分子诸如hla-a2的小鼠(例如，nicholson et al.(2012)adv.hematol.2012:404081)。
[0503]
在一些实施方案中，受试者是表达人tcr的转基因小鼠或抗原阴性小鼠(例如，li et al.(2010)nat.med.16:1029-1034和obenaus et al.(2015)nat.biotechnol.33:402-407)。在一些实施方案中，受试者是表达人hla分子和人tcr的转基因小鼠。
[0504]
在一些实施方案中，诸如在受试者是转基因hla小鼠的情况下，鉴定的tcr经修饰，例如经嵌合或人源化。在一些实施方案中，tcr支架经修饰，诸如类似于已知的结合蛋白人源化方法。
[0505]
c.筛选方法
[0506]
本发明所涵盖的另一方面涵盖筛选测定。
[0507]
本发明涵盖用于筛选结合至ha-1或其抗原或调节ha-1或其抗原的活性的剂诸如测试蛋白的测定。此类剂包括但不限于抗体、蛋白质、融合蛋白、小分子和核酸。在一些实施方案中，用于鉴定调节免疫应答的剂的方法需要确定候选剂调节ha-1活性并进一步调节感兴趣的免疫应答，诸如调节的细胞毒性t细胞活化和/或活性、癌细胞对免疫检查点疗法的敏感性以及等等的能力。
[0508]
在一些实施方案中，测定是无细胞或基于细胞的测定，其包括使靶标，与测试剂接触，并确定测试剂调节(例如，上调或下调)靶标的量和/或活性的能力，诸如通过如下所述测量直接或间接参数。
[0509]
在一些实施方案中，测定是基于细胞的测定，诸如包括使(a)感兴趣的细胞与测试剂接触并确定测试剂调节靶标的量和/或活性(诸如结合特性)的能力的测定。确定多肽彼此结合或相互作用的能力可以通过例如测量直接结合或通过测量免疫细胞活化或功能的参数来完成。
[0510]
在另一个实施方案中，测定是基于细胞的测定，其包括使细胞诸如癌细胞与免疫细胞(例如，细胞毒性t细胞)和测试剂接触，并确定测试剂调节靶标的量和/或活性和/或调节的免疫应答的能力，诸如通过如下所述测量直接或间接参数。
[0511]
上文和本文所述的方法也可以适用于测试已知调节本文所述的一种或多种生物标志物的量和/或活性的一种或多种剂，以确认对一种或多种生物标志物的调节和/或确认剂对期望表型，诸如调节的免疫应答、对免疫检查点封锁的敏感性以及等等的读出的影响。
[0512]
在一些实施方案中，确定测试剂(例如抗体、融合蛋白、肽或小分子)调节给定多肽组之间相互作用的能力可以通过确定该多肽组的一个或多个成员的活性来完成。例如，蛋白质和/或一种或多种结合配偶体的活性可以通过检测细胞第二信使的诱导(例如细胞内信号传导)、检测适当底物的催化/酶促活性、检测报告基因(其包含可操作地连接到编码可检测标志物例如氯霉素乙酰转移酶的核酸的靶标应答性调节元件)的诱导，或检测由蛋白质和/或一种或多种结合配偶体调节的细胞应答来确定。确定测试剂与所述多肽结合或相互作用的能力可以通过例如测量化合物在增殖测定中调节免疫细胞共刺激或抑制的能力，或通过干扰所述多肽与识别其一部分的抗体结合的能力来完成。
[0513]
调节靶标量和/或活性(诸如与一种或多种结合配偶体的相互作用)的剂可以通过它们在添加到体外测定时抑制免疫细胞增殖和/或效应物功能或诱导无变应性、克隆缺失和/或耗竭的能力来鉴定。例如，可以在存在经由激活受体刺激信号转导的剂的情况下培养细胞。可以采用许多公认的细胞活化的读出来测量在该剂存在下的细胞增殖或效应物功能(例如，抗体产生、细胞因子产生、吞噬作用)。测试剂阻断这种激活的能力可以通过使用本领域已知的技术测量该剂实现所测量增殖或效应物功能的降低的能力来容易地确定。
[0514]
例如，可以在t细胞测定中测试本发明所涵盖的剂抑制或增强共刺激的能力，如freeman et al.(2000)j.exp.med.192:1027和latchman et al.(2001)nat.immunol.2:261中所述。cd4+ t细胞可以从人pbmc中分离，并用激活抗cd3抗体进行刺激。t细胞的增殖可以通过3h胸苷掺入来测量。可以在测定中有或没有cd28共刺激的情况下执行测定。可以用来自pbmc的jurkat t细胞和pha母细胞执行类似的测定。
[0515]
替代地，可以测试本发明所涵盖的剂调节细胞因子的细胞产生的能力，该细胞因子由免疫细胞产生或者其产生响应于一种或多种生物标志物的调节而在免疫细胞中增强
hydroxy-1-propane sulfonate，chapso)，或n-十二烷基＝n,n-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐(n-dodecyl＝n,n-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate)。
[0519]
在上述测定方法的一个或多个实施方案中，可能期望使任一多肽固定化以促进蛋白质中的一种或两种的复合形式与未复合形式的分离，以及适应测定的自动化。测试化合物与多肽的结合可以在适合容纳反应物的任何容器中完成。此类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白，其添加允许蛋白质中的一种或两种结合到基质的域。例如，基于谷胱甘肽-s-转移酶的多肽融合蛋白，或谷胱甘肽-s-转移酶/靶标融合蛋白，可以吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠(sigma chemical,st.louis,mo)或谷胱甘肽衍生化微量滴定板上，其然后与测试化合物混合，并且混合物在有利于复合物形成的条件下温育(例如，在盐和ph的生理条件下)。温育后，清洗珠或微量滴定板孔以除去任何未结合的组分，在珠的情况下使基质固定化，直接或间接测定复合物，例如如上所述。替代地，可以将复合物从基质上解离，并使用标准技术测定多肽结合或活性的水平。
[0520]
本发明进一步涉及通过上述筛选测定鉴定的新剂。因此，在适当的模型系统中进一步使用如本文所述鉴定的剂也在本发明的范围内。例如，如本文所述鉴定的剂可以用于模型系统以确定用此类剂治疗的功效、毒性或副作用。替代地，如本文所述鉴定的剂可以用于模型系统以确定此类剂的作用机制。此外，本发明涉及通过上述筛选测定鉴定的新剂用于本文所述治疗的用途。
[0521]
d.临床测定期间的效果监测
[0522]
监测以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的疗法(例如，化合物、药物、疫苗、细胞疗法以及等等)对免疫应答，诸如t细胞应答性(例如，结合和/或t细胞活化和/或效应物功能的存在)的影响，不仅可以应用于基本的候选ha-1抗原结合分子筛选，还可以应用于临床测定。例如，本文所述的结合蛋白和相关组合物(诸如核酸、宿主细胞、药物配制剂以及等等)增强针对表达ha-1抗原的感兴趣细胞(诸如过度增殖细胞)的免疫应答(例如，t细胞免疫应答)的有效性可以在患有以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的受试者的临床测定中进行监测。在此类临床测定中，结合和/或t细胞活化和/或效应物功能(例如，t细胞增殖、杀伤和/或细胞因子释放)的存在可以用作特定细胞、组织或系统的表型的“读出”或标志物。类似地，使用本文所述的经工程化改造以表达结合蛋白(例如，tcr、tcr的抗原结合片段、car或包含tcr和效应物域的融合蛋白)的t细胞进行的过继性t细胞疗法增加对表达ha-1抗原的感兴趣细胞(诸如过度增殖细胞)的免疫应答的有效性可以在患有以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖病症或过度增殖性病症复发的受试者的临床测定中进行监测。在此类临床测定中，结合和/或t细胞活化和/或效应物功能(例如，t细胞增殖、杀伤或细胞因子释放)的存在可以用作特定细胞、组织或系统的表型的“读出”或标志物。
[0523]
例如，增加的以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的疗法的施用可能期望增加从受试者获得的样品和一种或多种结合蛋白或相关组合物之间的反应性的存在或水平，诸如增加以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的疗法的有效性。根据此类实施方案，从受试者获得的样品和一种或多种结合蛋白或相关组合物之间的反应性的存在或水平可以用作以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的疗法的有
效性的指标，即使没有可观察的表型响应。类似地，从受试者获得的样品和一种或多种结合蛋白或相关组合物之间的反应性的存在或水平的分析，诸如通过直接结合测定、荧光激活细胞分选(facs)、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、免疫化学、蛋白质印迹或细胞内流动测定，也可以用于选择将接受以ha-1抗原的表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的疗法的患者。
[0524]
例如，在直接结合测定中，免疫原性肽或抗原肽-mhc(pmhc)复合物可以与放射性同位素或酶促标记物偶联，使得结合可以通过检测标记的免疫原性肽或pmhc复合物来确定。例如，免疫原性肽或pmhc复合物可以用
125
i、
35
s、
14
c或3h直接或间接标记，并且放射性同位素通过放射发射的直接计数或闪烁计数检测。替代地，免疫原性肽或pmhc复合物可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶进行酶促标记，并酶促标记物通过确定适当底物向产物的转化来检测。确定免疫原性肽或pmhc复合物与免疫细胞(诸如t细胞和/或nk细胞)之间的相互作用也可以使用标准结合或酶促分析测定来完成。在上述测定方法的一个或多个实施方案中，可能期望使免疫原性肽或pmhc复合物固定化以适应测定的自动化。
[0525]
在没有标记相互作用物中的任一者的情况下确定剂调节感兴趣参数的能力也在本发明的范围内。例如，微生理计可以用于检测多肽之间的相互作用，而无需标记待监测的多肽(mcconnell et al.(1992)science 257:1906-1912)。如本文所用，“微生理计”(例如，)是使用光可寻址电位式传感器(laps)测量细胞酸化其环境的速率的分析仪器。该酸化速率的变化可以用作化合物与受体之间的相互作用的指标。
[0526]
免疫原性肽或pmhc复合物与免疫细胞(诸如t细胞和/或nk细胞)的结合可以在适合容纳反应物的任何容器中完成。此类容器的非限制性实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。免疫原性肽或pmhc复合物的固定化形式还可以包括结合到固相如多孔、微孔(具有小于约一微米的平均孔径)或大孔(具有大于约10微米的平均孔径)材料，诸如膜、纤维素、硝化纤维素或玻璃纤维；珠，诸如由琼脂糖或聚丙烯酰胺或乳胶制成的珠；或盘、板或孔的表面，诸如聚苯乙烯制成的表面的免疫原性肽或pmhc复合物。
[0527]
在一些实施方案中，从受试者获得的样品和本文所述的一种或多种结合蛋白或对一种或多种宿主细胞的反应性可以通过检测结合和/或t细胞活化和/或效应物功能的存在来测量。术语“t细胞活化”是指选自增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物表达的t淋巴细胞，特别是指细胞毒性t淋巴细胞的一种或多种细胞应答。
[0528]
细胞因子产生和/或释放可以通过本领域熟知的方法，例如，elisa、酶联免疫吸收点(elispot)、测定、细胞内细胞因子染色和流式细胞术，及其组合(例如，细胞内细胞因子染色和流式细胞术)来测量。其可以根据实现的方法来确定。
[0529]
如本文所用，术语“细胞因子”是指介导和/或调节生物或细胞功能或过程(例如，免疫、炎症和造血作用)的分子。如本文所用，术语“细胞因子”包括“淋巴因子”、“趋化因子”、“单核因子”和“白细胞介素”。有用的细胞因子的实例是gm-csf、il-1α、il-1β、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、mip-1α、mip-1β、tgf-β、tnf-α和tnf-β。
[0530]
由抗原特异性诱导或刺激免疫应答引起的t细胞的增殖和克隆扩增可以通过例如掺入非放射性测定法(诸如氚化胸苷测定法或mtt测定法)来确定。
[0531]
可以使用本领域常规实践的若干技术和方法中的任一种来执行确定ctl活性的细胞毒性测定(例如，henkart et al.(2003)fund.immunol.1127-1150)。用于测量抗原特异性t细胞反应性的方法的其他描述可以在例如美国专利号10,208,086和美国专利公开号2017/0209573中找到。
[0532]
e.预测医学
[0533]
本发明还涉及预测医学领域，其中诊断测定、预后测定和监测临床测定用于预后(预测)目的，从而防治性地治疗个体。因此，本发明所涵盖的一个方面涵盖用于在生物样品(例如，血液、血清、细胞或组织)的背景下确定(例如，检测)ha-1的存在、不存在、量和/或活性水平或对ha-1的反应性，从而确定患有以ha-1表达为特征的病症(无论是处于原始状态还是作为复发状态)的个体是否可能对治疗有响应。此类测定可以用于预后或预测目的，从而在以ha-1表达为特征的病症发作之前或复发之后防治性地治疗个体。
[0534]
本文所述的诊断方法可以进一步用于鉴定患有或有风险发展与ha-1的表达或其缺乏相关联的病症的受试者。如本文所用，术语“异常”包括ha-1相对于正常水平的上调或下调。异常表达或活性包括增加或减少的表达或活性，以及不遵循表达的正常发育模式或表达的亚细胞模式的表达或活性。例如，异常水平旨在包括其中生物标志物基因或调控序列的突变，或染色体基因的扩增，导致感兴趣的生物标志物的上调或下调的情况。如本文所用，术语“不需要的”包括生物应答中涉及的不需要的现象，诸如免疫细胞活性。
[0535]
本文所述的测定法，诸如前述诊断测定法或以下测定法，可以用于鉴定患有或有风险发展与ha-1失调相关联的病症的受试者。因此，本发明提供了用于鉴定与异常或不需要的ha-1调节相关联的病症的方法，其中从受试者获得测试样品并检测ha-1表达，其中ha-1表达的存在诊断为患有或有风险发展与异常或不需要的ha-1表达相关联的病症的受试者。如本文所用，“测试样品”是指从感兴趣的受试者获得的生物样品。例如，测试样品可以是生物流体(例如，脑脊液或血清)、细胞样品或组织，诸如肿瘤微环境、瘤周区和/或瘤内区的组织病理学玻片。
[0536]
此外，本文所述的预后测定法可以用于确定是否可以向受试者施用本文所述的药剂以治疗此类与异常或不需要的ha-1表达相关联的病症。例如，此类方法可以用于确定受试者是否可以用药剂中的一种或组合进行有效治疗。因此，本发明提供了用于确定受试者是否可以用一种或多种本文所述的用于治疗与异常或不需要的ha-1表达相关联的病症的药剂有效治疗的方法。
[0537]
本文所述的方法可以例如通过使用包含至少一种本文所述的抗体试剂的预包装诊断试剂盒来执行，其可以方便地用于例如临床环境中以诊断表现出涉及感兴趣的生物标志物的疾病或疾患的症状或家族史的患者。
[0538]
此外，其中表达感兴趣的生物标志物的任何细胞类型或组织均可以用于本文所述的预后测定。
[0539]
此外，本文所述的预后方法可以用于确定是否可以向受试者施用治疗剂以治疗以ha-1表达为特征的病症。
[0540]
f.临床功效
[0541]
可以通过本领域已知的任何方法测量临床功效。例如，对疗法的响应涉及以ha-1表达为特征的病症例如肿瘤对疗法的任何响应，优选地癌细胞数量、肿瘤质量和/或肿瘤体
积的变化，诸如在新辅助或辅助化学疗法开始后。可以在新辅助或辅助情况下评估肿瘤响应，其中可以将系统干预后的肿瘤大小与初始大小和尺寸进行比较，如通过ct、pet、乳房x线照片、超声或触诊所测量的，并且可以在组织学上估计肿瘤的细胞性并与治疗开始前进行的肿瘤生检的细胞性进行比较。还可以通过在生检或手术切除后对肿瘤进行的卡尺测量或病理检查来评估响应。响应可以以定量方式，诸如肿瘤体积或细胞构成的百分比变化记录，或通过使用半定量评分系统诸如残留癌症负荷(symmans et al.(2007)j.clin.oncol.25:4414-4422)或miller-payne评分(ogston et al.(2003)breast(edinburgh,scotland)12:320-327)，以定性方式如“病理完全缓解”(pcr)、“临床完全缓解”(ccr)、“临床部分缓解”(cpr)、“临床疾病稳定”(csd)、“临床进行性疾病”(cpd)或其他定性标准记录。肿瘤响应的评估可以在新辅助或辅助治疗开始后的早期(例如，数小时、数天、数周后或优选地数月后)执行。响应评估的典型终点是新辅助化学疗法终止时或手术除去残留肿瘤细胞和/或瘤床时。上文第i部分所列术语的定义提供了额外的指导。
[0542]
vii.细胞疗法
[0543]
在本发明所涵盖的另一方面，该方法包括过继性细胞疗法，由此表达所提供的靶向mhc限制性表位的分子的遗传工程化细胞(例如，表达结合蛋白(例如，tcr或car)或其抗原结合片段的细胞)施用于受试者。此类施用可以以抗原靶向方式促进免疫细胞的活化(例如，t细胞活化)，使得靶向表达ha-1抗原的感兴趣细胞诸如过度增殖细胞进行破坏。
[0544]
因此，所提供的方法和用途包括过继性细胞疗法的方法和用途。在一些实施方案中，该方法包括将细胞或含有细胞的组合物施用于受试者、组织或细胞，诸如患有、有风险或疑似患有疾病、病况或病症的人。在一些实施方案中，将细胞、群体和组合物施用于患有待治疗的特定疾病或病况的受试者(例如，经由过继性细胞疗法，诸如过继性t细胞疗法)。在一些实施方案中，将细胞或组合物施用于受试者，诸如患有疾病或病况或处于疾病或病况风险中的受试者。在一些实施方案中，该方法由此治疗，例如，改善疾病或病况的一种或多种症状。
[0545]
用于施用用于过继性细胞疗法的细胞的方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用(例如，美国专利公开号2003/0170238，美国专利号4,690,915，rosenberg(2011)nat.rev.clin.oncol.8:577-585,themeli et al.(2013)nat.biotechnol.31:928-933,tsukahara et al.(2013)biochem.biophys.res.commun.438:84-89，和davila et al.(2013)plos one 8:e61338)。
[0546]
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继性细胞疗法，诸如过继性t细胞疗法)可以通过自体转移进行，其中细胞从待接受细胞疗法的受试者中分离和/或以其他方式制备，或衍生自此类受试者的样品。因此，在一些实施方案中，细胞衍生自需要治疗的受试者，例如患者，并且将分离和处理后的细胞施用于同一受试者。
[0547]
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继性细胞疗法，诸如过继性t细胞疗法)可以通过同种异体转移进行，其中细胞是从不同于待接受或最终接受细胞疗法的受试者的受试者(例如第一受试者)中分离和/或以其他方式制备。在此类实施方案中，然后将细胞施用于同一物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上相同(同基因的)。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上相似。在一些实施方案中，第二个受试者表达与第一个受试者相同的hla类别或超类型。
[0548]
在一些实施方案中，经施用细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，诸如人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴子或猿。受试者可以是男性或女性并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，诸如啮齿动物。在一些实例中，患者或受试者是用于疾病、过继性细胞疗法和/或用于评估毒性结局诸如细胞因子释放综合征(crs)的经过验证的动物模型。
[0549]
结合分子，诸如tcr、tcr的抗原结合片段(例如，sctcr)和含有tcr的嵌合受体(例如，car)，以及表达它们的细胞，可以通过任何合适的方式施用，例如通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经间隔(trans-septal)注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、subconjectval注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜下(sub-tenon's)注射、球后注射、球周注射，或后巩膜旁(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过胃肠外、肺内和鼻内施用，并且如果期望用于局部治疗，则病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药和施用可能部分取决于施用是短暂的还是长期的。各种给药方案包括但不限于在各种时间点内的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
[0550]
为了预防或治疗疾病，结合分子或细胞的合适剂量可能取决于待治疗疾病的类型、结合分子的类型、疾病的严重程度和病程、是否施用结合分子用于预防性或治疗性目的、既往治疗、患者的临床病史和对结合分子的响应，以及主治医师的判断。在一些实施方案中，组合物和分子和细胞一次性或在一系列治疗中适当地施用于患者。
[0551]
在一些实施方案中，细胞可以以每公斤受试者体重0.1x 106、0.2x 106、0.3x 106、0.4x 106、0.5x 106、0.6x 106、0.7x 106、0.8x 106、0.9x 106、1.0x 106、5.0x 106、1.0x 107、5.0x 107、1.0x 108、5.0x 108，或更多，或介于两者之间的任何范围或介于两者之间的任何值的细胞施用。经移植细胞数量可以根据给定时间内期望的植入水平进行调整。通常，可以移植1x 105至约1x 109细胞/kg体重、约1x 106至约1x 108细胞/kg体重，或约1x 107细胞/kg体重，或更多的细胞(如有必要)。在一些实施方案中，移植至少约0.1x 106、0.5x 106、1.0x 106、2.0x 106、3.0x 106、4.0x 106或5.0x 106个总细胞相对于平均大小的小鼠是有效的。例如，在一些实施方案中，细胞或细胞亚型的个体群体可以以约100万至约1000亿个细胞和/或每千克体重的细胞量的范围，诸如，例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞，约400亿个细胞，或由前述值中的任何两个定义的范围)，诸如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或由前述值中的任何两个定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞，约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或这些范围和/或每千克体重之间的任何值施用于受试者。剂量可以根据疾病或病症和/或患者和/或其他治疗的特定属性而变化。
[0552]
经移植细胞的植入可以通过各种方法中的任一者来评估，诸如但不限于肿瘤体积、细胞因子水平、施用时间、在移植后的一个或多个时间点从受试者获得的感兴趣细胞的流式细胞术分析，以及等等。例如等待1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28天的基于时间的分析或可能预示肿瘤收获的时间。任何此类指标可以根据众所周知的参数进行调整以确定变量对针对抗癌免疫疗法的响应的影响。此外，经移植细胞可以与其他药剂共同移植，诸如细胞因子、细胞外基质、细胞培养支持物，以及等等。
[0553]
细胞也可以在其他抗癌剂之前、并行或之后施用。
[0554]
可以组合和施用两种或更多种细胞类型，诸如基于细胞的疗法和干细胞的过继性细胞转移、癌症疫苗和基于细胞的疗法，以及等等。例如，基于过继性细胞的免疫疗法可以与本发明所涵盖的基于细胞的疗法组合。在一些实施方案中，基于细胞的药剂可以单独使用或与额外的基于细胞的药剂组合使用，诸如免疫疗法如过继性t细胞疗法(act)。例如，经遗传工程化改造以识别cd19的t细胞用于治疗滤泡性b细胞淋巴瘤。用于act的免疫细胞可以是树突状细胞、t细胞诸如cd8
+ t细胞和cd4
+ t细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞、记忆t细胞、调节性t细胞(treg)、辅助性t细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞及其任何组合。众所周知的基于过继性细胞的免疫治疗方式，包括但不限于经照射的自体或同种异体肿瘤细胞、肿瘤裂解物或凋亡肿瘤细胞、基于抗原呈递细胞的免疫疗法、基于树突状细胞的免疫疗法、过继性t细胞转移、过继性car t细胞疗法、自体免疫增强疗法(aiet)、癌症疫苗和/或抗原呈递细胞。此类基于细胞的免疫疗法可以进一步修饰以表达一种或多种基因产物以进一步调节免疫应答，诸如表达细胞因子如gm-csf，和/或表达肿瘤相关抗原(taa)抗原，诸如mage-1、gp-100等。本发明所涵盖的剂，诸如癌细胞，与本发明所涵盖的另一种剂或其他组合物的比率可以相对于彼此是1:1(例如，等量的2种剂、3种剂、4种剂等)，但可以按期望的任何量进行调制(例如，1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1或更大)。
[0555]
在一些实施方案中，例如，当受试者是人时，剂量包括少于约1x108的总结合蛋白(例如，tcr或car)表达细胞、t细胞或外周血单个核细胞(pbmc)，例如，在约1x106至1x108个此类细胞的范围内，例如2x106、5x106、1x107、5x107或1x108个此类细胞，或总共此类细胞，或前述值的任何两个之间的范围。
[0556]
在一些实施方案中，本文所述的细胞或相关组合物，诸如核酸、宿主细胞、药物配制剂以及等等，可以作为联合治疗的一部分施用，诸如与另一种治疗性干预，诸如另一种抗体或工程化细胞或受体或药剂，诸如细胞毒剂或治疗剂同时或以任何次序序贯施用。
[0557]
在一些实施方案中，细胞或相关组合物可以与一种或多种额外的治疗剂共同施用或与另一种治疗性干预相结合，同时或以任何次序序贯施用。在一些情况下，细胞或相关组合物与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得细胞群增强一种或多种额外的治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方案中，细胞或相关组合物在一种或多种额外的治疗剂之前施用。在一些实施方案中，细胞或相关组合物在一种或多种额外的治疗剂之后施用。
[0558]
在一些实施方案中，一旦将细胞或相关组合物施用于受试者(例如人)，就通过多种已知方法中的任一者来测量细胞或相关组合物的生物活性。待评估的参数包括在体内例如通过成像，或在体外/离体，例如通过elisa或流式细胞术的工程化或天然t细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合。在一些实施方案中，细胞破坏靶细胞的能力(细胞毒性)可以使用本领域已知的任何合适的测定或方法来测量(例如，kochenderfer et al.(2009)
j.immunother.32:689-702和herman et al.(2004)j.immunol.meth.285:25-40)。在一些实施方案中，细胞的生物学活性也可以通过测定某些细胞因子诸如cd107a、ifnγ、il-2和tnfα的表达和/或分泌来测量。在一些实施方案中，生物活性通过评估临床结局，诸如病毒负荷或载量的降低来测量。
[0559]
在一些实施方案中，以多种方式修饰细胞，从而提高它们的治疗性或防治性功效。例如，群体表达的结合蛋白(例如，工程化tcr、car或其抗原结合片段)可以直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物缀合至靶向部分的实践在本领域中是众所周知的(例如，wadwa et al.(1995)j.drug targeting3:111和美国专利号5,087,616)。
[0560]
免疫细胞，诸如细胞毒性淋巴细胞，可以从任何合适的来源获得，诸如外周血、脾脏和淋巴结。免疫细胞可以用作粗制制剂或部分纯化或基本上纯化的制剂，其可以通过标准技术获得，包括但不限于涉及使用抗体的免疫磁性或流式细胞术技术的方法。
[0561]
在本发明所涵盖的另一个方面，本文提供了用于引发对表达ha-1抗原的细胞的免疫应答的方法，该方法包括以足以引发免疫应答的有效量向受试者施用本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化tcr、car，或其抗原结合片段)的细胞。在一些实施方案中，本文提供了用于治疗或防治以表达ha-1抗原为特征的非恶性病症、过度增殖性病症或过度增殖性病症复发的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化tcr、car或其抗原结合片段)的细胞。在一个实施方案中，细胞被全身施用，诸如通过注射。替代地，可以局部施用而不是全身施用，例如，经由直接注射到组织中，诸如在储库或缓释配制剂中。
[0562]
在一些实施方案中，本文所述的表达结合蛋白(例如，工程改造的tcr、car或其抗原结合片段)的细胞可以用作免疫调节组合物中的活性化合物，用于防治或治疗以ha-1抗原表达为特征的非恶性病症、过度增殖性病症，或过度增殖性病症的复发。在一些实施方案中，ha-1引发的抗原呈递细胞可以用于生成淋巴细胞(例如，cd8
+ t淋巴细胞、cd4
+ t淋巴细胞和/或b淋巴细胞)，以进一步用于过继性转移至具有本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化tcr、car或其抗原结合片段)的细胞的受试者。
[0563]
在一些实施方案中，单独或与淋巴细胞组合的本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化tcr、car或其抗原结合片段)的细胞可以施用于受试者以引发免疫应答，特别是用于引发对表达ha-1抗原的细胞的免疫应答。
[0564]
如上所述，单独或与淋巴细胞组合的本文所述的表达结合蛋白(例如，工程改造的tcr、car或其抗原结合片段)的细胞的单次或多次施用可以用由护理提供者(例如，医师)选择的细胞数量和治疗进行。类似地，可以在药学上可接受的载剂中施用单独或与淋巴细胞组合的细胞。合适的载剂可以是细胞在其中生长的生长培养基，或任何合适的缓冲介质诸如磷酸盐缓冲盐水。细胞可以单独施用或作为辅助疗法与其他疗法结合施用。
[0565]
viii.试剂盒和装置
[0566]
本发明还涵盖试剂盒和装置。例如，试剂盒或装置可以包含包装在合适的容器中的结合蛋白、包含编码结合蛋白的序列的核酸或载体、包含核酸或载体和/或表达如本文所述的结合蛋白的宿主细胞、稳定的mhc-肽复合物、佐剂、检测试剂及其组合，并且可以进一步包含使用此类试剂的说明。试剂盒或装置还可以含有其他组件，诸如包装在单独容器中的施用工具。试剂盒或装置可以作为用于执行本发明所涵盖的方法的单元来促销、分发或
销售。
[0567]
本公开通过不应被解释为限制的以下实施例进一步说明。
实施例
[0568]
实施例1：实施例2的材料和方法
[0569]
a.人外周血单个核细胞采集
[0570]
通过hemacare(los angeles,ca)或stemexpress(placerville,ca)使用其irb批准的方案收集hla-a*02:01阳性健康供体白细胞单采(leukopak)。使用淋巴细胞分离介质(corning,corning,ny)通过密度梯度离心从来自hemacare的新鲜白细胞单采中分离外周血单个核细胞(pbmc)。离心后收集淋巴细胞层中含有的pbmc，用dpbs(cytiva,marlborough,ma)清洗3次，并计数。根据制造商的说明，通过如上密度梯度离心或在multimacs cell24 separator plus仪器版本3(miltenyi biotec)上使用custom leukopak pbmc分离试剂盒(miltenyi biotec,auburn,ca)从stemexpress白细胞单采中分离pbmc。分离的pbmc在cryostor cs10(stemcell technologies,cambridge,ma)中冷冻并储存在液氮中。
[0571]
b.ha-1基因型分型
[0572]
根据制造商的说明，使用genejet基因组dna纯化试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma)从表达a*02:01的健康供体的pbmc中提取dna。使用引物(5’aggacatctcccatctgctg 3’和5’ttgagccagtgtacgctcag 3’)执行pcr，以使用phusion high-fidelity pcr master mix(thermo fisher scientific)扩增含有ha-1snp(rs_1801284)的基因组区，循环条件为如下：在98℃变性3分钟，然后在98℃5秒、68℃10秒和72℃30秒进行37个循环，最后在72℃延伸5分钟。根据制造商的说明，使用monarch pcr和dna清除试剂盒(new england biolabs,ipswich,ma)纯化pcr产物。使用qubit 4荧光计(invitrogen,carlsbad,ca)测定dna浓度，并且纯化产物的测序由genewiz,inc.(cambridge,ma)执行。
[0573]
c.tcr发现筛选
[0574]
(i)dc培养
[0575]
使用从hla-a*02:01阳性健康ha-1阴性(rs_1801284，g/g)供体分离的pbmc，根据制造商的说明用easysep人cd14阳性选择试剂盒ii(stemcell technologies)在第4天执行单核细胞分离。使用对cd14(m5e2，biolegend,dedham,ma)、hla-a2(bb7.2，biolegend)、cd80(2d10，biolegend)、cd83(hb15e，biolegend)和cd86(it2.2，biolegend)具有特异性的荧光标记的抗体评估纯度和共刺激分子表达；cd14表达》90％。cd14+单核细胞重悬浮于补充有分别为800iu/ml和1000iu/ml的最终浓度的重组人gm-csf和il-4(r&d systems,minneapolis,mn)的aim-v培养基(thermo fisher scientific)中。第-2天，将重组人tnf-α(10ng/ml)、il-6(1000iu/ml)和il-1β(2ng/ml)(r&d systems)以及pge2(1μg/ml，stemcell technologies)添加到培养的单核细胞中。
[0576]
(ii)cd8初始t细胞分离
[0577]
在第-1天，根据制造商的说明使用easysep人初始cd8+ t细胞分离试剂盒ii(stemcell technologies)从来自表达hla-a*02:01的健康ha-1阴性(rs_1801284，g/g)供
体的pbmc中分离自体cd8初始t细胞。使用对cd8α(hit8a,biolegend)、cd45ro(uchl1,biolegend)、cd45ra(hi100,biolegend)、cd56(5.1h11,biolegend)、cd57(hcd57,biolegend)和ccr7(g043h7,biolegend)具有特异性的荧光标记的抗体评估纯度；初始cd8α
+ t细胞的纯度》90％。细胞在37℃、5％co2下在补充有10ng/ml重组人il-7(r&d systems)的含有10％人血清(sigma aldrich,st.louis,mo)、1％青霉素-链霉素(thermo fisher scientific)和50μmβ-巯基乙醇(mp biomedicals,santa ana,ca)的rpmi-1640(atcc,manassas,va)中静置过夜。
[0578]
(iii)共培养
[0579]
在第0天，使用与第3天相同的抗体组重新评估cd8 t细胞纯度，并通过上调hla-a2、cd80、cd83和cd86以及下调cd14来确认dc成熟。dc在37℃、5％co2下用1μm ha-1肽(vlhddllea，genscript[piscataway,nj])脉冲3小时。脉冲的dc与静息的cd8初始t细胞在补充有重组人il-12(10ng/ml)和il-21(60ng/ml)(r&d systems)的t细胞培养基中共培养。在第3天和第10天之间向共培养物补充重组人il-7和il-15(r&d systems)。根据制造商的说明使用a*02:01 ha-1(vlhddllea)dextramer(immudex,copenhagen,denmark),cd8α和tcrα/β(ip26,biolegend)和dapi(thermo fisher scientific)，在第11天执行针对ha-1特异性细胞的dextramer染色。
[0580]
(iv)快速扩增方案(rep)
[0581]
在鉴定含有ha-1特异性细胞的孔后，在第12天，在100ng/ml抗cd3(okt3，invitrogen)和50iu/ml重组人il-2(sigma aldrich)在t细胞培养基中于37℃、5％co2下培养7天。
[0582]
(v)抗原特异性细胞分选
[0583]
第19天，在rep后收集细胞，与第11天一样用对a*02:01ha-1(vlhddllea)dextramer、用cd8α和tcrα/β具有特异性的抗体以及用dapi进行染色，并且ha-1阳性细胞(cd8α
+
、dapi-、tcrα/β
+
、ha-1
+
)使用sony sh800s细胞分选仪(sony biotechnology,san jose,ca)或bd facsaria细胞分选仪(becton dickinson,franklin lakes,nj)进行分选。分选的细胞经受使用10x genomics平台(pleasanton，ca)的单个细胞tcrα/β测序。
[0584]
(vi)流式细胞术
[0585]
使用cytoflex流式细胞仪(beckman coulter,indianapolis,in)获取细胞，并使用flowjo软件(第10版，treestar，ashland，or)进行分析。使用sony sh800s细胞分选仪(sony biotechnology)或bd facsaria细胞分选仪(becton dickinson)进行细胞分选。
[0586]
d.使用10x genomics平台的单个细胞tcrα/β测序
[0587]
单细胞tcr-seq(sctcr-seq)文库根据10x genomics单细胞v(d)j试剂盒(v1)方案(10x genomics)制备。在经历逆转录之前，10x genomics chromium仪器内的液滴(gem)中捕获每个样品10,000个细胞的靶标数量。逆转录后，gem被破坏，使用硅烷磁珠从样品中纯化条形码化cdna。如下扩增cdna：98℃45秒；98℃20秒、67℃30秒、72℃1分钟进行13个循环；72℃1分钟)。在用0.6x spriselect珠(beckman coulter)纯化样品后，每个文库的2ul用于tcr序列富集。tcr序列富集由2轮pcr组成以扩增tcrα和tcrβ链转录物两者。随后对富含tcr的文库进行片段化、末端修复，并使用索引引物进行扩增。完全组装的文库在illumina nextseq仪器(illumina,sandiego,ca)上使用high output v2.5试剂盒(150个循环)进行
测序，读段长度为：26bp(读段1)、8bp(i7索引)和98bp(读段2)。使用cellranger 3.1.0流水线处理已测序sctcrseq读段。读段与grch38参考基因组进行比对，并使用cellranger vdj模块来注释tcr共有序列。
[0588]
e.慢病毒包装和慢病毒滴度的量化
[0589]
lenti-x细胞以75％的汇合度铺板，并使用jetprime转染试剂(polyplus,illkirch,france)进行转染。简而言之，ha-1构建体与包装质粒(prev/ptat/pvsvg/pgagpol)混合，并根据制造商的方案与jetprime试剂一起温育，并在转染后24小时添加opti-prosfm培养基。转染后48小时收集病毒上清液，并使用vivaspin20离心浓缩器或vivaflow 50盒(sartorius,bohemia,ny)进行浓缩。使用tcr-/-jurkat细胞系通过gfp或tcrα/β表达确定慢病毒滴度。为了量化病毒滴度，tcr-/-jurkat细胞用ha-1特异性tcr表达病毒的连续稀释物转导，并且在转导后48至72小时，通过流式细胞术分析评估gfp或tcrα/β表达。使用cytoflex流式细胞仪(beckman coulter)分析样品。使用以下公式将滴度计算为以tu/ml计的表达gfp或tcrα/β的细胞的百分比：
[0590]
tu/ml＝(gfp
+
或tcrα/β
+
的％)x(转导中使用的细胞数量)x(稀释因子)x1000
[0591]
f.评价ha-1特异性tcr功能
[0592]
(i)工程化改造t细胞以表达ha-1特异性tcr
[0593]
按照制造商的说明使用easysep人t细胞分离试剂盒或easysep人cd4
+
t细胞分离试剂盒(stemcell technologies)从hla-a*02:01阳性健康ha-1阴性(rs_1801284，g/g)供体pbmc中分离泛t细胞或cd4
+ t细胞。分离的t细胞用immunocult cd3/cd28/cd2 t细胞活化剂混合物(stemcell technologies)激活，并在补充有5％人血清[sigma aldrich]、1％青霉素-链霉素[thermo fisher scientific]、1x glutamax补充剂[thermo fisher scientific]、5ng/ml il-7[r&d systems]和50iu/ml il-2[sigma aldrich])的完全t细胞培养基(x-vivo 15[lonza,morristown,nj]中培养过夜。在激活后24小时，用ha-1tcr病毒上清液以5的moi(感染复数)转导t细胞。在转导后24小时，清洗t细胞并转移至g-rex板(wilson wolf,new brighton,mn)或vecell 96孔板(cosmo bio,carlsbad,ca)，并在激活后扩增共7-8天。每2-3天向t细胞培养物补充新鲜的il-2(50iu/ml)和il-7(5ng/ml)。如有指示，cd34
+
转导细胞的富集根据制造商的说明使用miltenyi cd34微珠试剂盒(miltenyi biotec)执行。富集后，t细胞在完全t细胞培养基中进一步扩增2-3天，然后对ha-1特异性tcr的纯度和表达进行流式细胞术分析。
[0594]
(ii)工程化ha-1tcr转导的泛t细胞的流式细胞术
[0595]
工程化泛t细胞按照制造商的说明用ha-1(vlhddllea)dextramer和ha-1(vlrddllea)或mart-1(elagigiltv)(immudex)dextramer、tcrα/βpe-cy7(ip26,biolegend)、cd8percp-cy5.5(hit8a,biolegend)和cd4apc-cy7(okt4,biolegend)、cd34apc(qbend/10,r&d systems)或cd34fitc(qbend/10,invitrogen)和dapi进行染色。然后在cytoflex流式细胞仪(beckman coulter)上分析细胞，并使用flowjo软件(版本10，treestar)或cytexpert软件(beckman coulter)进行分析。
[0596]
(iii)细胞系
[0597]
t淋巴母细胞系t2(atcc crl-1992)、aml细胞系tf-1(atcc crl-2003)和thp-1(atcctib202)、淋巴瘤细胞系su-dhl1(atcc crl2955)和急性t细胞白血病细胞系jurkat
(克隆e6-1，atcc tib-152)购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。淋巴瘤细胞系sup-m2(acc 509)购自德国微生物菌种保藏中心(deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen，dsmz)。lenti-x细胞系(632180)购自takara bio(mountain view,ca)。t2细胞在imdm+20％热灭活fbs中培养。tf-1细胞在rpmi 1640+10％热灭活fbs+2ng/ml重组人gm-csf中培养。thp-1细胞在rpmi 1640+10％热灭活fbs+0.05mm 2-巯基乙醇中维持。su-dhl1和sup-m2细胞分别在rpmi 1640+10％和20％热灭活fbs中维持。jurkat细胞在rpmi 1640+10％热灭活胎牛血清+1％青霉素-链霉素中培养。lenti-x细胞在补充有10％fbs和1％青霉素-链霉素的dmem培养基(thermo fisher scientific)中培养。hek293t细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(fbs)、100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基(gibco)中维持。
[0598]
(iv)表达nuclight red的稳定细胞系的生成
[0599]
t2、tf-1、thp-1、su-dhl1和sup-m2细胞用nuclight red慢病毒试剂(ef-1α启动子，嘌呤霉素选择)(sartorius)在无血清培养基中以3至5的moi进行转导。在转导后24小时，清洗细胞并重悬浮于其各自的细胞系培养基中，并在37℃、5％co2下培养。在转导后3天，将嘌呤霉素(gibco)以预定浓度(范围从0.5ug/ml到1ug/ml)添加到培养物中，以选择转导的细胞。培养物在嘌呤霉素选择下扩增，直到它们为至少98％nuclight red阳性，如通过流式细胞术分析所确定的。
[0600]
(v)tcr敲除jurkat细胞系的生成
[0601]
tcr-/-jurkat细胞系通过电穿孔靶向tcrα链的crispr rnp生成(向导序列：agagtctctcagctggtaca，s.p.cas9核酸酶v3,idt,coralville,ia)(ren j.et.al.clin cancer res.2017)。电穿孔后5天，用抗人tcrα/β(克隆ip26，biolegend)对细胞进行染色，并在sony sh800s细胞分选仪上对tcr-/-细胞群进行分选。
[0602]
(vi)体外细胞毒性测定
[0603]
体外细胞毒性测定在rt下在预包被有聚l-赖氨酸(greiner,monroe,nc)的384孔板或包被有聚l-鸟氨酸(sigma aldrich)的96孔平底组织培养板中执行30分钟，然后除去包被溶液，让板在rt下再干燥30分钟。如有指示，t细胞与表达nuclight red的thp-1、sup-m2、tf-1、su-dhl1或肽脉冲t2细胞(脉冲浓度范围为10ng/ml至10pg/ml的ha-1肽[vlhddllea，genscript]浓度)以范围为20:1至2.5:1的e:t比共培养。在incucyte s3仪器(sartorius)上获取数据，并在incucyte s3上量化细胞生长，作为t细胞细胞毒性的读出。
[0604]
(vii)细胞因子生产测定
[0605]
t细胞与表达nuclight red的thp-1、sup-m2、tf-1、su-dhl1和肽脉冲t2细胞(1ng/ml ha-1肽[vlhddllea，genscript])以1:1的e:t共培养。24小时后收集上清液并在-80℃下冷冻。将上清液解冻并加载到multianalyte盒(proteinsimple，sanjose，ca)上以使用ella仪器(proteinsimple)评价ifn-γ、tnf-α、il-2和颗粒酶b的水平。
[0606]
(viii)增殖测定
[0607]
按照制造商的说明，用2.5μm celltrace
tm violet(thermo fisher scientific)标记t细胞。t细胞与表达nuclight red的thp-1、sup-m2、tf-1、su-dhl1和肽脉冲t2细胞(1ng/ml ha-1肽[vlhddllea，genscript，piscataway，nj])以1:1的e:t共培养。96小时后，收获细胞并用可固定存活力染料efluor 660(fisherscientific)、cd4 percp-cy5.5
(okt4,biolegend)和cd8 apc-cy7(hit8a,biolegend)抗体进行染色。用easysep
tm
缓冲液清洗细胞并用bd cytofix
tm
固定缓冲液(bd biosciences,franklin lakes,nj)固定。countbright绝对计数珠(thermo fisher scientific)在easysep
tm
缓冲液中稀释并添加到样品中，然后在cytoflex流式细胞仪上采集，以评估celltrace
tm violet的稀释度作为t细胞增殖的指标。使用flowjo软件(版本10，treestar)分析数据，并使用以下公式确定分裂的cd8和cd4t细胞的绝对计数：
[0608]
样品中的cd8或cd4t细胞数＝(门控中的cd8或cd4t细胞事件数/门控中的珠事件数)x批次特定分配的珠计数
[0609]
g.同种异体反应性筛选
[0610]
(i)基于96孔的mhc表达阵列的生成
[0611]
使用crispr在hek293t细胞中敲除内源性hla-a/b/c。使用multicrispr.net工具(prykhozhij et al.,plos one,2015)针对在hla-a、hla-b和hla-c基因座间保守的序列设计向导rna。选择了以下向导物：crispr-all-1：cggctactacaaccagagcg、crispr-all-2：agatcacactgacctggcag、crispr-all-3：aggtcagtgtgatctccgca。使用bsmbi位点将grna克隆到lenticrispr v2载体中。hek 293t细胞使用mirus transit(mirus bio,madison,wi)用质粒向导物构建体转染。7天后，使用泛mhc抗体(biolegend)对mhc阴性细胞进行分选。扩增单个细胞克隆，并通过流式细胞术和蛋白质印迹验证mhc的缺失。
[0612]
为了在hek239t细胞中表达ha-1，用表达ha-1的90mer构建体ha-1(phage-cmv-fha-ha1h-ires-puro)转导mhc-空hek293t细胞。用嘌呤霉素选择转导的孔达一周。为了生成mhc表达阵列，然后将具有或不具有ha-1表达的mhc-空hek293t细胞在96孔板的各个孔中用最常见的110种最常见的mhc(phage-ef1a-mhc-ubc-nat)进行转导。用诺尔丝菌素选择转导的细胞达一周。一百零四(104)个mhc已成功建立ha-1-和ha-1+版本，并经受同种异体反应性筛选。将具有或不具有ha-190-mer的表达最常见的108种mhc的细胞传代并储存在96孔板中作为阵列。
[0613]
(ii)同种异体反应性筛选的共培养
[0614]
表达tsc-100的人cd8
+ t细胞按照安全性筛选部分所述生成。
[0615]
在第0天，对96孔阵列中的靶细胞进行传代和接种。在第1天，以3:1的e:t添加表达tsc-100的人cd8 t细胞，并与靶细胞一起温育过夜。第2天，收获上清液并储存在-80℃下。使用ella机器和ifn-γ第3代试剂盒(proteinsimple)通过elisa测定测量样品中的ifn-浓度。
[0616]
h.安全性筛选
[0617]
(i)工程化改造t细胞以表达ha-1特异性tcr
[0618]
根据制造商的说明，使用cd8微珠试剂盒(miltenyi biotec)从ha-1阴性或a*02:01阴性供体中分离cd8
+ t细胞。将分离的细胞冷冻并储存在液氮中。第-1天，将cd8 t细胞解冻并在补充有10％热灭活胎牛血清[fbs]、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、重组人il-2[50u/ml,peprotech,cranbury,nj]、重组人il-15[5ng/ml，r&d systems]和重组人il-7[5ng/ml,(r&d systems])的t细胞培养基(rpmi 1640)静置过夜。在第0天，使用immunocult cd3/cd28/cd2 t细胞活化剂混合物(stemcell technologies)激活cd8 t细胞。在第1天，将细胞清洗并重悬浮于含有il-2、il-7和il-15的t细胞培养基
中，并慢病毒颗粒进行转导以表达ha-1反应性tcr。第2天，将细胞清洗并重悬浮于含有il-2、il-7和il-15的t细胞培养基中进行扩增，直至第5天。第5天，收获细胞并重悬浮于macs缓冲液(miltenyi biotec)中，并与fcr阻断试剂(100ul/ml，stemcell technologies)在室温下温育5分钟。将细胞浓度调整至60e6个细胞/ml并且a*0201 ha-1(vlhddllea)dextramer pe(immudex)以1:25的稀释度在室温下添加10分钟。根据制造商的说明，使用抗pe微珠(miltenyi biotec)分离ha-1 dextramer pe阳性细胞。将分离的细胞重悬浮于含有il-2、il-7和il-15的t细胞培养基中，并扩增直至第12天，此时细胞被冷冻。
[0619]
(ii)用全基因组肽文库转导hek293t细胞
[0620]
mhc-空hek293t细胞经工程化改造以表达hla-a*02:01、荧光报告基因和细胞表面报告物，两者均由t细胞杀伤激活。报告细胞经转导以表达包含》600,000个重叠肽方格的文库，该肽各自包含90个氨基酸，代表人蛋白质组。
[0621]
(iii)共培养后报告细胞的分选
[0622]
在0.1μg/ml抗cd3(okt3,ebioscience)和50u/ml重组il-2(peprotech)的存在下，通过与经丝裂霉素c处理(50μg/ml，30分钟)的同种异体pbmc共培养来扩增用相关tcr工程化改造的cd8
+ t细胞。扩增7天后，收集细胞并与文库转导的报告细胞共培养，并在37℃下温育4小时。温育后，根据制造商的说明，通过胰蛋白酶消化收获细胞并用膜联蛋白v磁性微珠(miltenyi biotec)进行标记。使用automacs pro(miltenyi biotec)分离膜联蛋白标记的细胞，并使用moflo astrios eq细胞分选仪(beckman coulter)分选报告物阳性细胞。
[0623]
(iv)基因组dna分离和测序文库制备
[0624]
使用genejet基因组dna纯化试剂盒(thermo fisher scientific)从分选的细胞中提取基因组dna(gdna)。通过pcr从提取的gdna中扩增抗原盒，然后在第二pcr反应中附加测序衔接物和样品特异性索引序列。使用标准illumina测序引物在illumina nextseq上对扩增子进行测序。
[0625]
(v)序列比对和表位鉴定
[0626]
核苷酸序列定位到个体核苷酸方格。为每个筛选重复(n＝8)和每个转导报告细胞库的输入计算每个方格的读段计数的比例，并通过将筛选重复中方格的比例除以输入文库中方格的比例来计算每个方格的富集。使用8个筛选重复间同一方格的富集的修改几何平均值来鉴定可重现的筛选打击。使用netmhc4.0预测超过2倍富集阈值的每个方格的特定mhc结合表位。每个方格的候选表位通过鉴定在筛选中富集的重叠相邻和冗余方格间共享的预测强结合表位来选择。
[0627]
i.衍生自健康供体和患有癌症(诸如aml或all)的患者的血细胞的体外细胞毒性
[0628]
(i)靶细胞
[0629]
原发性肿瘤样品获得自组织溶液。hla-a*02:01阳性状态通过流式细胞术确认，并且ha-1基因型状态如上所述确定。健康pbmc获得自如上所述处理的健康供体白细胞单采。
[0630]
原代样品在开始共培养前一天解冻，并在补充有5％人血清[sigma aldrich]、1％青霉素-链霉素[thermo fisher scientific]、1x glutamax补充剂[thermo fisher scientific]、5ng/ml il-7[r&d systems]和50iu/ml il-2[sigma aldrich])的完全t细胞培养基(x-vivo15[lonza，morristown，nj])中静置过夜。在共培养的d0，原代癌细胞和健康pbmc用dpbs清洗，并按照制造商的说明用20nm celltrace
tm farred(thermo fisher)标记。
标记的原代靶细胞重悬浮于无细胞因子的t细胞培养基中。
[0631]
(ii)效应细胞
[0632]
使用clinimacs prodigy仪器(myltenyi biotec)从来自discovery life sciences(huntsville,al)的hla-a*02:01阴性健康白细胞单采中分离记忆t细胞。按照标准规程执行cd45ra消减，然后是并行的cd4和cd8阳性选择，以生成记忆泛t细胞。将获得的分离的记忆t细胞冷冻直至进一步处理。将分离的记忆t细胞解冻并用immunocult cd3/cd28/cd2 t细胞活化剂混合物(stemcell technologies)激活，并在补充有5％人血清[sigma aldrich]、1％青霉素-链霉素[thermo fisher scientific]、1x glutamax补充剂[thermo fisher scientific]、5ng/ml il-7[r&d systems]和50iu/ml il-2[sigma aldrich])的完全t细胞培养基(x-vivo15[lonza，morristown，nj])中培养过夜。激活后24小时，t细胞用tsc-100病毒上清液以5的moi(感染复数)进行转导。转导后24小时，清洗t细胞并转移至g-rex板(wilsonwolf，newbrighton，mn)，并在激活后扩增共7天。每2-3天向t细胞培养物补充新鲜的il-2(50iu/ml)和il-7(5ng/ml)。根据制造商的说明使用miltenyi cd34微珠试剂盒(miltenyi biotec)在d7富集cd34+转导细胞。富集后，t细胞在完全t细胞培养基中进一步扩增7天，每2-3天补充新鲜il-2(50iu/ml)和il-7(5ng/ml)，然后进行纯度和ha-1特异性tcr的表达的流式细胞术分析。tsc-100工程化t细胞和非转导的对照t细胞在d14冷冻。
[0633]
(iii)共培养和基于流动的细胞毒性测量
[0634]
效应细胞在共培养开始前一天解冻，并在完全t细胞培养基中静置过夜。在共培养的d0，按照制造商的说明，用dpbs清洗效应细胞并用2.5μmcelltrace
tm violet标记。标记的效应细胞重悬浮于无细胞因子的t细胞培养基中。
[0635]
标记的t细胞(50,000个细胞)和靶细胞(50,000个)在96孔圆底于00ul的共培养24小时。温育后，将细胞离心下来，用easysep缓冲液清洗，并按照制造商的说明用可固定存活力染料活/死近红外(thermo fisher)进行染色。样品在cytoflex s仪器上运行，并且数据使用flowjo v.10软件进行分析。效应细胞和原代靶细胞分别根据celltrace
tm violet和celltrace
tm farred状态进行鉴定。通过对celltrace
tm farred事件进行门控并报告活/死阴性事件的比例来测量靶细胞的相对存活力。数据表示为靶细胞相对于未转导的对照t细胞共培养条件的存活力。
[0636]
j.材料
[0637]
细胞系
[0638]
·
lenti-x：takara，632180
[0639]
·
jurkat：atcc，tib-152
[0640]
·
hek293t细胞：atcc，crl-3216
[0641]
·
t2：atcc，crl-1992
[0642]
·
tf-1：atcc，crl-2003
[0643]
·
thp-1：atcc，tib202
[0644]
·
su-dhl1：atcc crl，2955
[0645]
·
sup-m2：acc509，dsmz
[0646]
培养基和补充剂
[0647]
·
x-vivo15，无血清造血细胞培养基，含l-谷氨酰胺、庆大霉素和酚红：lonza，04-418q
[0648]
·
人男性ab血清(热灭活)：sigma aldrich，h3667-100ml
[0649]
·
青霉素链霉素：gibco，15149-122
[0650]
·
glutamax补充剂：fisherscientific，35050061
[0651]
·
rpmi-1640培养基：atcc，30-2001
[0652]
·
胎牛血清(fbs)，热灭活：gibco，a3840102
[0653]
·
imdm：atcc，30-2005
[0654]
·
rpmi培养基1640(1x)[+]4.5g/l d-葡萄糖，[+]2.383g/l hepes缓冲液、[+]l-谷氨酰胺、[+]1.5g/l碳酸氢钠、[+]110mg/l丙酮酸钠：gibco，a10491-01
[0655]
·
aimv培养基：[+]l-谷氨酰胺、[+]50μg/ml硫酸链霉素、[+]10μg/ml硫酸庆大霉素：gibco，12055-083
[0656]
·
pbs中的30％bsa：sigma aldrich，a9576-50ml
[0657]
·
β-巯基乙醇：mp biomedicals，02190242
[0658]
·
dmem培养基(1x)[+]4.5g/ld-葡萄糖、[+]l-谷氨酰胺、[+]3.7g/l碳酸氢钠：thermo fisher scientific，11965084
[0659]
·
dmem(1x)[+]4.5g/ld-葡萄糖、[+]l-谷氨酰胺、[-]丙酮酸钠：gibco，11965
[0660]
·
optipro sfm培养基：thermo fisher scientific，12309019
[0661]
缓冲液
[0662]
·
easysep缓冲液：stemcell technologies，20144
[0663]
·
dpbs(无ca2+/mg2+)：gibco，14190-122
[0664]
·
dpbs(无ca2+/mg2+)：cytiva，sh30028.03
[0665]
·
automacs运行缓冲液：miltenyi，130-091-221
[0666]
细胞因子
[0667]
·
重组人il-2：sigma aldrich，11147528001
[0668]
·
重组人il-2：peprotech，200-02
[0669]
·
重组人il-12：r&d systems，219-il-005
[0670]
·
重组人il-15：r&d systems，247-ilb-005
[0671]
·
重组人gm-csf：r&d systems，215-gm-050
[0672]
·
重组人il-4：r&d systems，204-il-050
[0673]
·
重组人tnfα：r&d systems，210-ta-050
[0674]
·
重组人il-1β/il-1f2：r&d systems，201-lb-025
[0675]
·
重组人il-6：r&d systems，206-il-050
[0676]
·
pge2：stemcell technologies，72194
[0677]
试剂盒
[0678]
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easysep
tm
人t细胞分离试剂盒：stemcell technologies：17951
[0679]
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easysep
tm
人cd4+ t细胞分离试剂盒：stemcell technologies：17952
[0680]
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easysep
tm
人初始cd8+ t细胞分离试剂盒ii：stemcell technologies，17968
[0681]
·
easysep
tm
人cd14阳性选择试剂盒ii：stemcell technologies，17858
[0682]
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cd8微珠试剂盒：miltenyi biotec，130-117-019
[0683]
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cd34微珠试剂盒：miltenyi biotec，130-046-702
[0684]
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抗pe微珠：miltenyi biotec，130-105-639
[0685]
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ls柱，miltenyi biotec，130-042-401
[0686]
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用于32个样品的ella simple plex试剂盒：proteinsimple：spckc-ps-003027
[0687]
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simple plex人ifn-gamma(第3代)柱：proteinsimple，spckb-ps-002574
[0688]
抗体和染色试剂
[0689]
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抗人cd8αpercp-cy5.5(克隆：hit8a)：biolegend：300924
[0690]
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抗人cd8αapc-cy7(克隆：hit8a)：biolegend：300926
[0691]
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抗人cd4apc-cy7(克隆：okt4)：biolegend：317418
[0692]
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抗人cd4percp-cy5.5(克隆okt4)：biolegend：317428
[0693]
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抗人cd56pe(克隆：5.1h11)：biolegend：362508
[0694]
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抗人cd57pe(克隆：hcd57)：biolegend：322312
[0695]
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抗人tcrα/βpe-cy7(克隆：ip26)：biolegend：306720
[0696]
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抗人cd34fitc(克隆：qbend/10)：invitrogen：ma1-10204
[0697]
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抗人cd34apc：(克隆：qbend/10)：rd systems，fab7227a
[0698]
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抗人cd45ro fitc(克隆：uchl1)：biolegend，304204
[0699]
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抗人cd45ra apc(克隆：hi100)：biolegend，304112
[0700]
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抗人ccr7bv605(克隆：g043h7)：biolegend，353224
[0701]
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抗人cd14alexa fluor(克隆：m5e2)：biolegend，301811
[0702]
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抗人cd83pe-cy7(克隆：hb15e)：biolegend，305326
[0703]
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抗人hla-a2pe(克隆：bb7.2)：biolegend，343306
[0704]
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抗人cd80apc(克隆：2d10)：biolegend，305220
[0705]
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抗人cd86brilliant violet 605
tm
(克隆it2.2)：biolegend，305430
[0706]
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抗人tcrα/βfitc(克隆：ip26)：biolegend，221058
[0707]
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抗人tcrα/βapc(克隆ip26)：biolegend，306718
[0708]
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抗人hla-a、b、c apc抗体：biolegend，311410
[0709]
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抗人cd32(fc gamma rii)阻断剂：stemcell technologies，18520
[0710]
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细胞示踪紫(ctv)：fisher scientific：c34571
[0711]
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可固定存活力染料efluor 660(apc通道)thermo fisher scientific：65-0864-14
[0712]
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live/dead
tm
可固定近红外死细胞染色试剂盒：thermo fisherscientific，l34976a
[0713]
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dapi：thermoscientific：thermo scientific，62248
[0714]
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countbright
tm
绝对计数珠：fisher scientific：c36950
[0715]
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cytofix：bd biosciences，554655
[0716]
肽
[0717]
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mart1(elagigiltv)：genscript
[0718]
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ha-1(vlhddllea)：genscript
[0719]
dextramer
[0720]
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hla-a*02:01 vlhddllean ha-1 dextramer：immudex，wb2622-pe
[0721]
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hla-a*02:01 vlrddllean ha-1 dextramer，wb5421-apc
[0722]
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hla-a*02:01 elagigiltv mart1 dextramer：immudex，wb2162-apc
[0723]
crispr-cas9和电穿孔试剂
[0724]
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s.p.cas9核酸酶v3(lot#0000417827):idt,1081059
[0725]
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crispr-cas9 tracrrna(lot#0000415438):idt,1072534
[0726]
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4d-nucleofector
tm core unit:lonza,aaf-1002b
[0727]
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4d-nucleofector
tm x unit:lonza,aaf-1002x
[0728]
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se cell line 4d-nucleofector
tm x kit l:lonza v4xc-1012
[0729]
组织培养板
[0730]
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g-rex 24孔板：wilson wolf,80192m
[0731]
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g-rex 6孔板：wilson wolf,80240m
[0732]
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vecell 96孔板：cosmo bio,vcl-v96wgpb-10-ex
[0733]
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tc处理的6孔板：corning costar,3506
[0734]
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tc处理的24孔板：corning costar,3524
[0735]
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未处理的6孔板：corning costar,3736
[0736]
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未处理的24孔板：corning costar,3738
[0737]
·
96孔平底板:corning costar,3595
[0738]
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384孔，聚l赖氨酸处理的，平底微孔板：greiner bio-one
tm
,781936.
[0739]
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vecell 96孔板：cosmo bio,vcl-v96wgpb-10-ex
[0740]
leukopak处理试剂：
[0741]
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multi-24柱模块：miltenyi biotec，130-095-692
[0742]
·
单孔深孔板：miltenyi biotec，130-114-966
[0743]
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定制leukopak pbmc分离试剂盒，人：miltenyi biotec，120-051-115
[0744]
·
淋巴细胞分离培养基：corning，25-072-cv
[0745]
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cryostor cs10：stemcell technologies，07930
[0746]
基因型分型试剂
[0747]
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genejet基因组dna纯化试剂盒：thermo fisher scientific，k0722
[0748]
·
含hf缓冲液的phusion高保真pcr预混液：thermo fisher scientific，f531l
[0749]
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monarch pcr&dna cleanup试剂盒(5μg)：new england biolabs，t1030l
[0750]
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无核酸酶水：ambion，am9937
[0751]
10x基因组学试剂
[0752]
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铬单细胞5’文库和凝胶珠试剂盒v1：10x genomics，pn1000006
[0753]
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铬单细胞v(d)j富集试剂盒，人t细胞：10x genomics，pn1000005
[0754]
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铬芯片a单细胞试剂盒：10x genomics，pn1000152
[0755]
·
单一索引试剂盒t组a：10x genomics，pn1000213
[0756]
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spriselect试剂盒：beckman coulter，b23318
[0757]
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高灵敏度d5000screentape：agilent technologies，5067-5592
[0758]
·
高灵敏度d5000试剂：agilent technologies，5067-5593
[0759]
·
qubit
tm dsdna hs测定试剂盒：invitrogen，q32854
[0760]
包装和慢病毒生产试剂
[0761]
·
jetprime转染试剂：polyplus-transfection，114-75
[0762]
·
vivaspin 20：sartorius，vs2041
[0763]
·
vivaflow 50盒：sartorius，vf05p4
[0764]
clinimacs prodigy试剂
[0765]
·
clinimacs cd4微珠：miltenyi bioteck，170-076-702
[0766]
·
clinimacs cd8微珠：miltenyi bioteck，170-076-703
[0767]
·
clinimacs cd45ra微珠：miltenyi bioteck，170-098-025
[0768]
·
clinimacs prodigy ts 520：miltenyi bioteck，170-076-600
[0769]
·
clinimacs pbs/edta缓冲液(2x 3l)：miltenyi bioteck，130-021-201
[0770]
其他试剂
[0771]
·
immunocult
tm
人cd3/cd28/cd2 t细胞活化剂：stemcell technologies，10970
[0772]
·
聚-l-鸟氨酸溶液0.01％：millipore-sigma，p4957-50ml
[0773]
·
pbs中的viastain ao/pi染色溶液：nexcelom bioscience，cs2-0106-5ml
[0774]
·
嘌呤霉素：gibco，a11138-03
[0775]
·
诺尔丝菌素：goldbio，n-500-1
[0776]
实施例2：tsc-100的发现：用于治疗造血干细胞移植疗法后白血病的天然ha-1特异性tcr
[0777]
开发了能够从健康供体中快速克隆抗原特异性tcr的高通量tcr发现平台。然后使用该平台从六个独特的ha-1-(vlrddllea，基因型rs_1801284g/g)供体中筛选1.783亿个初始cd8+ t细胞，并鉴定出329个ha-1特异性tcr(图1)。tcr发现平台中使用的肽浓度为1μg/ml。使用先前发表的临床阶段ha-1特异性tcr作为这些研究的基准，每个tcr均测试了表达和杀伤ha-1肽(vlhddllea)(10ng/ml-10pg/ml)脉冲t2细胞的能力(图2)(dossa et al.(2018)blood 131:108-120)。平行地，测试了tcr恒定区修饰以促进外源性tcrα和β链的表达和正确配对，并且慢病毒载体设计为共同递送cd8辅助受体以及cd34富集标签以能够纯化工程化t细胞(图3a-3d)。将前11个候选物克隆到tscan的优化主链中，并使用一组hla-a*02:01
+ ha-1
+
细胞系评价细胞毒性、细胞因子产生和t细胞增殖(图4a-4f)。使用20:1至2.5:1的e:t比。最后，使用专有全基因组t扫描平台评价前两个tcr的同种异体反应性(图5，包括tsc-100和本文所述的克隆ha1-10-34)和脱靶交叉反应性(图6a和6b)。
[0778]
本文所述的tcr发现和评价平台从总共1.783亿个初始t细胞中鉴定出329个ha-1特异性tcr(图1)，并且tsc-100是最活跃的tcr。tsc-100恒定区中的定义突变增强了其表面表达，同时降低了内源性tcr的表达(图3c)，并且cd8的共同引入使工程化cd4细胞能够高效接合和发挥功能(图3a)。总体而言，当用表达中等至高水平ha-1的细胞系进行攻击时，tsc-100表现出与临床阶段基准tcr相当的活性(图4b)，而当与表达低水平ha-1和mhc-i两者的细胞系一起温育时，tsc-100表现出更优的活性(图4c-4d)(dossa et al.(2018)blood 131:108-120)。来自ccle的ha-1和hla a0201细胞系的rna表达如下表5所示。
[0779]
表5.细胞系表达的参考
[0780][0781]
*来自ccle的表达以每百万转录物(tpm)计
[0782]
此外，tsc-100对测试的108种不同hla类型没有表现出可检测的同种异体反应性(图5)，并且当用表达衍生自人蛋白质的肽的全基因组文库进行攻击时，脱靶效应最小(图6a)。
[0783]
tsc-100表现出与临床阶段治疗性tcr相当或更优的活性，具有最小的同种异体反应性或脱靶效应。
[0784]
完整的数据集，包括来自上述tsc-100的数据以及来自由相同实验和使用相同方法(例如，细胞毒性评价、细胞因子产生、t细胞增殖效应等)克隆到tscan优化主链的其他10个顶级候选物的数据显示于图7a-7q中，这确认了11个最佳候选物的功能。
[0785]
此外，tsc-100已被证明可以杀伤来自各种健康供体和癌细胞类型的ha-1表达细胞。因为人们从每条染色体上遗传两份拷贝，一份来自他们的母亲且一份来自他们的父亲，所以每个人均具有两份arhgap45基因。因此，ha-1阳性患者可以是ha-1(+/+)纯合子，两个基因均编码ha-1阳性肽(vlhddllea)，或者是ha-1(+/-)杂合子，一个基因编码ha-1阳性肽，另一个基因编码ha-1阴性肽(vlrddllea)。为确保tsc-100能够有效消除纯合子ha-1阳性(+/+)或杂合子ha-1阳性(+/-)的健康血细胞和癌细胞，诸如白血病细胞，测定了tsc-100针对衍生自各种健康供体和癌症患者(例如aml和all)的血细胞的活性。如图8所示，tsc-100消除了纯合子和杂合子健康血液和癌细胞。
[0786]
通过引用并入
[0787]
本文提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文，就好像每个个别出版物、专利或专利申请均具体且个别地指示通过引用并入。在冲突的情况下，以本技术，包括本文中的任何定义为准。
[0788]
还通过引用以其整体并入的是任何多核苷酸和多肽序列，其引用与公共数据库中的条目相关的登录号，诸如由基因组研究所(tigr)在万维网tigr.org上，和/或万维网ncbi.nlm.nih.gov上的美国国家生物技术信息中心(ncbi)维护的那些。
[0789]
等同物和范围
[0790]
本发明所涵盖的一个或多个实施方案的细节在上面的描述中阐述。尽管上面已经描述了代表性的、示例性的材料和方法，但是与本文所述的那些相似或等同的任何材料和方法可以用于实践或测试本发明所涵盖的实施方案。与本发明相关的其他特征、目的和优点从描述中显而易见。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在冲突的情况下，以上面提供的本描述为准。
[0791]
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明所涵盖的具体实施方案的许多等同物。本发明所涵盖的范围并不旨在限于本文提供的描述，并且此类等同物旨在被所附权利要求所涵盖。
[0792]
还应注意的是，术语“包含”旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的要素或步骤。当本文使用术语“包含”时，术语“由
……
组成”也因此被涵盖和公开。
[0793]
在给出范围的地方，端点也包括在内。此外，应当理解，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中明显看出，表示为范围的数值可以在本发明所涵盖的不同实施方案中假定所述范围内的任何具体数值或子范围，至范围下限的十分之一的单位，除非上下文另有明确规定。
[0794]
此外，应当理解，落在现有技术范围内的本发明所涵盖的任何特定实施方案可以明确地排除在权利要求中的任何一项或多项之外。由于此类实施方案被认为是本领域的普通技术人员已知的，所以即使排除没有在本文中明确阐述，它们也可以被排除。本发明所涵盖的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗性或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)可以出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除，无论或与现有技术的存在无关。
[0795]
应当理解，所使用的词语是描述性词语而不是限制性词语，并且可以在所附权利要求的范围内进行变化而不脱离本发明在其更广泛方面所涵盖的真实范围和精神。
[0796]
虽然本发明已经相对于若干描述的实施方案以一定的长度和一些特殊性进行描述，但不旨在将其限制于任何此类细节或实施方案或任何特定实施方案，而是应参考以下内容来解释所附权利要求，以便根据现有技术提供对此类权利要求的最广泛可能的解释，并因此有效地涵盖本发明所涵盖的预期范围。