装配式板式塔型贴壁细胞反应器及其肝细胞的培养方法

1.本发明属于医疗机械技术领域，涉及一种细胞反应器，特别的涉及一种装配式板式塔型贴壁细胞反应器及其肝细胞的培养方法。


背景技术：

2.近几十年以来，随着生命科技不断创新和快速发展，人类生命医药科学对生物制品依赖性逐渐增强，传统的通过生物化学技术从动物组织提取生物制品的方法已无法满足市场的需求，目前通过从动物组织中提取细胞在体外大规模培养用以表达单克隆抗体、特定的蛋白、干扰素及病毒疫苗制品已成为普遍的技术。这些生物制品通常需要细胞作为载体繁殖扩大的工厂进行生产，而目前市面上大多数的细胞均为贴壁类型的细胞。当前进行贴壁细胞繁殖主要采用转瓶培养，虽然转瓶培养具有投资少，结构简单，技术成熟，扩增只需加转瓶数量等优点。但是占地空间大，劳动强度大，产率低，细胞生长密度低，瓶间差异较难控制等，因而难以产业化或规模化生产。
3.肝功能衰竭患者病死率高，生物人工肝能为患者提供有效的肝功能支持治疗，具有良好的应用前景。生物反应器是生物型人工肝治疗的核心装置，既为外源性肝细胞和患者血液或血浆提供物质交换的场所，又为肝细胞提供适宜的生长代谢环境。所以能否培养出大量符合生物人工肝要求、具有代谢活力的肝细胞，将对生物人工肝的发展起着决定性作用。理想的生物人工肝反应器应当符合以下要求：1、能为体外肝细胞生长提供充足空间，在有限的空间内至少容纳正常肝脏10％的细胞数；2、良好的生物相容性，能保证肝细胞的活性和功能；3、能保证细胞和培养介质间物质双向传输。目前临床应用较多的是灌流床/支架型生物反应器和中空纤维型生物反应器。但其分别存在：细胞活性和功能维持较差、细胞剪切力差易脱落、细胞密度不均匀、生物相容性差、物质交换能力低和微载体颗粒悬浮效果差、物质交换能力低、易阻塞、细胞活性低下等缺点。因此，要对肝细胞进行大量、高活性及高密度培养，使之具有相当的规模与生物活性仍是目前研究难点。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种装配式板式塔型贴壁细胞反应器，用以解决现有细胞反应器细胞容量有限、反应器不易扩大、供氧困难和物质及气体交换效率低等问题。本发明还提供了一种生物人工肝细胞的培养方法，通过调节反应器灌流流速和氧气浓度，保证肝细胞的氧合，提高肝细胞高活力，实现了肝细胞的大规模生长且高活性。
5.为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种装配式板式塔型贴壁细胞反应器，包括层叠设置的顶层细胞培养层、底层细胞培养层和至少一层的中间细胞培养层，所述顶层细胞培养层上设有培养液入口和多个上通气口，所述底层细胞培养层上设有培养液出口和多个下通气口，所述顶层细胞培养层和底层细胞培养层上还均设置有横板，所述横板将培养液出入口/培养液出口与上通气口/下通气口完全分隔，使培养液不能
流入上通气口/下通气口；所述中间细胞培养层是由底板和与所述底板固定连接的侧板围成的具有储液功能的盒体，所述中间细胞培养层内部设置有多个隔板，所述隔板一端与中间细胞培养层内壁通过弧形的导流板相连接，所述隔板的另一端与中间细胞培养层内壁之间设有缺口且相邻隔板的缺口位置相对设置在中间细胞培养层的两侧形成呈“s型”走向的灌流槽，所述灌流槽的一端设置有用于将细胞培养液流向下一层的贯通口，且任意相邻细胞培养层的贯通口交错设置，在所述灌流槽的底部具有突出设置溢流堰，所述溢流堰沿所述灌流槽的宽度方向贯通设置；所述溢流堰沿所述灌流槽的长度方向间隔设置多个，相邻两个溢流堰之间形成细胞培养室。
6.这样，本发明装配式板式塔型贴壁细胞反应器，用板式塔原理拉开细胞培养层高度，引入气体层，使气体与细胞培养液进行气体交换；再通过调节气体组分含量，为细胞生长提供充分的气体交换需求，为待培养的细胞提供适宜气体环境，保证细胞的氧合，从而实现待培养细胞功能的最大化。弧形导流板的设置更有利于层内“s型”单层灌流槽，确保培养液流型处于层流状态，可控制液体流速和细胞培养基/血液的高效物质(气体、化学物质等)交换。溢流堰的设置，一方面有效避免培养细胞被培养液带走，另外一方面，有利于细胞与细胞培养液的充分接触，进一步保证细胞和细胞培养基/血液的高效物质(气体、化学物质等)交换。
7.作为优选的，所述培养液入口和培养液出口在竖直方向上的倒影也位于灌流槽的一端，且任意相邻细胞培养层的贯通口/培养液入口/培养液出口交错设置。
8.作为优选的，所述中间细胞培养层内的隔板均匀分布，且灌流槽的宽度为10～40mm。这样，确保培养液流速的稳定性。
9.作为优选的，所述细胞培养室的表面设置有tc涂层或鼠胶原蛋白修饰涂层。这样，促进细胞的贴壁黏附和增殖。
10.作为优选的，所述细胞培养室内的细胞密度为1～1.2
×
105个/cm2。这样有效的保障了待培养细胞与细胞培养基/血液之间的物质交换效率。并且可根据细胞培养数量要求，装配不同数量的细胞培养层。
11.作为优选的，所述溢流堰的高度为0.3～1.5mm，且低于中间细胞培养层的高度。这样有助于细胞稳定，且增加了细胞培养液的停留时间，提高物质交换效率；所述贯通口的孔径为8～10mm，保证细胞培养液顺利流入下一层。
12.作为优选的，所述底层细胞培养层表面设有孔径为10～15μm的尼龙纤维膜，防止脱落的细胞随细胞培养液流出；所述下通气口和下通气口处均设有孔径为220nm的滤膜，可以保证气体交换，同时阻止细菌的进入。
13.作为优选的，所述细胞培养层、隔板和细胞培养室的基材独立选自玻璃或聚苯乙烯。采用生物相容性良好的材料，能保证待培养细胞的活性和功能。
14.本发明的另一个目的，还在于提供了上述装配式板式塔型贴壁细胞反应器在用于培养生物人工肝细胞、vero细胞或cho细胞方面的应用。
15.作为优选的，所述生物人工肝细胞为人原代肝细胞、干细胞、永生化人肝细胞和人肝癌细胞中的一种或多种。
16.本发明的另一个目的，还在于提供了一种循环装配式板式塔型贴壁细胞反应系统，包括上述反应器、贮存池、导入管、导出管、蠕动泵和通气装置，所述导入管一端插入贮
存池内的细胞培养液中，另一端与反应器上的培养液入口相连通，所述导入管上还设置有蠕动泵，将贮存池内的细胞培养液输送至反应器中；所述导出管一端与反应器的培养液出口相连通，另一端连接贮存池并置于细胞培养液上方，所述上通气口连接有通气装置，所述通气装置还包括流量计和空气调节阀。
17.本发明的另一个目的，还在于提供了一种生物人工肝细胞的培养方法，包括以下步骤：获取上述的循环装配式板式塔型贴壁细胞反应系统，将灭菌合格的细胞培养液注入所述贮存池中，将待培养的生物人工肝细胞接种至灭菌后的装配式板式塔型贴壁细胞反应器中细胞培养层内的细胞培养室中，打开所述蠕动泵使细胞培养液均匀分布于各层所述细胞培养层，之后将无菌培养气体通过所述上通气口输入反应器中，培养气体通过下通气口排出，然后通过通气装置控制氧气浓度以及通过蠕动泵控制循环流速，再将其置于37℃环境下，静置培养6～12h。
18.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
19.1、本发明装配式板式塔型贴壁细胞反应器，用板式塔原理拉开细胞培养层高度，引入气体层，使气体与细胞培养液进行气体交换。同时，单层“s”型灌流式、溢流堰高度可调、灌流宽度可调、单层细胞培养载体可加工等可使肝细胞所受剪切力均匀、可调，为细胞功能的稳定提供了充分的保证，并且可使待培养细胞更充分的接触空气和培养液。再者，可根据实际需要增加中间细胞培养层的数量，从而倍数扩增培养的细胞量，实现线性放大。从而解决了现有生物反应器存在细胞容量有限、细胞载量少、有效交换面积小、细胞分布不均、供氧困难、代谢交换效率低下等问题，可使培养细胞长时间保持存活和良好的功能状态，培养的细胞数量可大大增加至1～1.2
×
105个/cm2的高密度。另外，将细胞接种在细胞培养板载体上方便细胞的转移和装载，解决了细胞直接培养在生物反应器中而导致肝细胞生长不均、生长不良以及难以观察细胞生长情况的问题。
20.2、本发明提供的生物反应器可用于临床治疗相关疾病的生物反应器，大体量贴壁细胞细胞体外扩增的细胞培养器，规模化、连续性生物药生产的细胞工厂。且设计新颖，结构简单，且制备方法在技术上均能实现，具有广阔的应用前景。
21.3、本发明提供的肝细胞体外循环培养方法，采用了循环装配式板式塔型贴壁细胞反应系统，通过引入的气体层，可提供不同氧气浓度的培养气体，为肝细胞提供适宜气体环境，保证细胞的氧合，从而实现肝细胞功能的最大化；单层灌流式、溢流堰高度可调、灌流宽度可调、单层底部可加工等可使肝细胞所受剪切力均匀、可调，既不损伤肝细胞，又有利于保护肝细胞的性状和功能，为肝细胞功能的稳定提供了充分的保证；单层细胞培养载体可进行修饰，确保细胞的贴壁黏附，保证肝细胞功能最大化；层数和单层面积可调，肝细胞平板上分布均匀且密度可控，微环境一致。与现有的生物反应器相比，培养后的循环液中白蛋白、尿素和cyp450的含量明显增加，并且肝细胞仍保持良好活力，具备生物合成与转化代谢功能，能够满足生物型人工肝对肝细胞材料的数量和质量要求，可为肝衰竭患者提供人工肝支持与治疗的作用，具有良好的应用前景。
附图说明
22.图1为本发明装配式板式塔型贴壁细胞反应器的结构示意图。
23.图2为本发明反应器中中间细胞培养层的俯视图。
24.图3为本发明反应器中顶层/底层细胞培养层的俯视图。
25.图4为本发明循环装配式板式塔型贴壁细胞反应系统的结构示意图。
26.图5为不同培养条件下l02人正常肝细胞的白蛋白的分泌量。
27.图6为不同培养条件下l02人正常肝细胞的尿素的分泌量。
28.图7为不同培养条件下l02人正常肝细胞的细胞色素p450的分泌量。
29.图8为不同培养条件下l02人正常肝细胞的相对活力。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
31.具体实施时：如图1～3所示，一种装配式板式塔型贴壁细胞反应器，包括层叠设置的顶层细胞培养层1、底层细胞培养层2和至少一层的中间细胞培养层3，所述顶层细胞培养层上设有培养液入口6和多个上通气口8，所述底层细胞培养层上设有培养液出口7和多个下通气口9，所述顶层细胞培养层1和底层细胞培养层2上还均设置有横板4，所述横板4将培养液出入口6/培养液出口7与上通气口8/下通气口9完全分隔，使培养液不能流入上通气口8/下通气口9；所述中间细胞培养层3是由底板和与所述底板固定连接的侧板围成的具有储液功能的盒体，所述中间细胞培养层3内部设置有多个隔板10，所述隔板10一端与中间细胞培养层内壁之间通过弧形的导流板5相连，所述隔板10的另一端与中间细胞培养层内壁之间设有缺口11且相邻隔板的缺口11位置相对设置在中间细胞培养层的两侧形成呈“s型”走向的灌流槽12，所述灌流槽12的一端设置有用于将细胞培养液流向下一层的贯通口13，且任意相邻细胞培养层的贯通口13交错设置，在所述灌流槽12的底部具有突出设置溢流堰14，所述溢流堰14沿所述灌流槽12的宽度方向贯通设置；所述溢流堰14沿所述灌流槽12的长度方向间隔设置多个，相邻两个溢流堰14之间形成细胞培养室15。
32.具体实施时，装配式板式塔型贴壁细胞反应器中每层细胞培养层均是长12.5cm、宽8.5cm、高度为1.7cm的盒体，中间细胞培养层3共计5层，各层层叠摆放。中间细胞培养层3内的隔板10为长10cm，宽0.3cm，高0.5cm的玻璃条，且沿反应器的长度方向均匀分布，灌流槽12的宽度为20mm，确保培养液流速的稳定性。方形聚苯乙烯板作为单层细胞培养的底板，溢流堰14的高度为0.3～1.5mm。底层细胞培养层2和顶层细胞培养层1内的横板4为长8.5cm，宽0.2cm，高1cm的聚苯乙烯条，且沿反应器的宽度方向上设置，底层细胞培养层2表面铺满孔径15μm的尼龙纤维膜，防止脱落的细胞随血浆流出。
33.具体实施时，细胞培养层在层间呈板式塔型叠放，每层细胞培养层的贯通口13/培养液入口6/培养液出口7的孔径均为10mm。
34.具体实施时，装配式板式塔型贴壁细胞反应器的培养液入口6和培养液出口7均设有螺纹，可通过旋盖密封。
35.具体实施时，所述上通气口8和下通气口9设有220nm滤膜，滤膜的设置可以保证气体交换，同时阻止细菌的进入。
36.具体实施时，所述细胞培养室的表面设置有tc涂层或鼠胶原蛋白修饰涂层。这样，促进细胞的贴壁黏附和增殖。
37.具体实施时，所述细胞培养室内的细胞密度为1～1.2
×
105个/cm2。这样有效的保障了待培养细胞与细胞培养基/血液之间的物质交换效率。
38.如图4所示，板式塔型灌流式生物人工肝反应器与蠕动泵、贮存池组建循环运行回路，用于循环培养细胞。具体的，包括上述反应器、贮存池16、导入管17、导出管18、蠕动泵19和通气装置，所述导入管一端插入贮存池16内的细胞培养液中，另一端与反应器上的培养液入口6相连通，所述导入管上还设置有蠕动泵19，将贮存池16内的细胞培养液输送至反应器中；所述导出管一端与反应器的培养液出口7相连通，另一端连接贮存池16并置于细胞培养液上方，所述上通气口8连接有通气装置，所述通气装置还包括流量计和气体调节阀。
39.实施例1一种生物人工肝细胞的培养方法
40.1)获取上述的循环装配式板式塔型贴壁细胞反应系统，将灭菌合格的细胞培养液注入所述贮存池中，将待培养的l02细胞种子无菌接入灭菌后的装配式板式塔型贴壁细胞反应器内的细胞培养室中。
41.2)打开所述蠕动泵使细胞培养液均匀分布于各层所述细胞培养层，之后将无菌培养气体通过所述上通气口输入反应器中，培养气体通过下通气口排出，调整反应器内的压力。
42.3)通过通气装置控制培养气体浓度(40％氧气)以及通过蠕动泵控制循环流速为8ml/min，再将其置于37℃环境下，循环培养6h。
43.实施例2一种生物人工肝细胞的培养方法
44.培养气体为无菌空气(常氧条件)，其它步骤同实施例1。
45.对照组
46.采用常规的细胞培养板培养法培养l02细胞，循环流速为0ml/min，氧气浓度为常氧条件，将其置于37℃环境下，培养6h。
47.1、取实施例1、实施例2和对照组培养后的l02细胞培养液，使用人白蛋白酶联免疫吸附试剂盒检测培养液中白蛋白含量，结果如图5所示。
48.从图中可以看出，与细胞培养板培养的对照组相比，实施例1和实施例2中细胞的白蛋白分泌显著提高(p《0.05)。实施例2的反应器中每百万细胞的白蛋白含量是对照组的2.00倍，实施例1的反应器中每百万细胞的白蛋白含量是对照组的3.31倍。
49.2、取实施例1、实施例2和对照组培养后的l02细胞培养液，使用人尿素酶联免疫吸附试剂盒检测培养液中尿素含量，结果如图6所示。
50.从图中可以看出，与细胞培养板培养的对照组相比，装配式板式塔型贴壁细胞反应器中细胞的尿素分泌有显著提高(p《0.05)。实施例2反应器中每百万细胞的尿素含量是对照组的1.69倍，实施例1反应器中每百万细胞的尿素含量是对照组的2.58倍。
51.3、取实施例1、实施例2和对照组培养后的l02细胞培养液，使用人cyp450酶联免疫吸附试剂盒检测培养液中cyp450含量，结果如图7所示。
52.从图中可以看出，与细胞培养板培养的对照组相比，装配式板式塔型贴壁细胞反应器中细胞的细胞色素p450分泌有显著提高(p《0.01)。实施例2反应器中每百万细胞的cyp450含量是对照组的2.47倍，实施例1反应器中每百万细胞的cyp450含量是对照组的2.60倍。
53.4、将实施例1中顶层细胞培养层、中间细胞培养层、底层细胞培养层和对照组培养后的l02细胞进行fda/pi活死染色，再使用mtt法量化细胞活力，结果如图8所示。
54.从图中可以看出，与细胞培养板培养的对照组相比，装配式板式塔型贴壁细胞反
应器的细胞活力有显著提高(p《0.01)。反应器中细胞的细胞活力约为对照组的1.95倍。
55.综上，采用本发明反应器进行l02细胞体外循环实验6小时，经试验发现培养后的循环液中白蛋白、尿素和细胞色素p450的含量明显增加，实验结束时肝细胞仍保持良好活力。可见，本发明的装配式板式塔型贴壁细胞反应器培养人肝细胞为材料的人工肝，具备生物合成与转化代谢功能，能够满足生物型人工肝对肝细胞材料的数量和质量要求，可为肝衰竭患者提供人工肝支持与治疗的作用。
56.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。