一种可食用壳聚糖麦谷蛋白仿生取向的细胞培养肉生物支架的制作方法

1.本发明属于食品领域，具体涉及一种可食用壳聚糖麦谷蛋白仿生取向的细胞培养肉生物支架。


背景技术：

2.细胞培养肉通过细胞培养和组织工程技术，在体外形成具有真实肌肉的风味和口感的肉质产品。该技术基于无菌环境和质量控制，可规避抗生素、激素带来的食品安全问题；该技术从被动依赖动物生长周期中解放出来，有望更高效生产肉质产品，解决粮食危机问题。此外，该技术避免动物屠宰，更加复合动物保护的健康理念。细胞培养肉主要由细胞和生物支架组成。其中生物支架需满足可食用性和促进细胞黏附生长的性能要求。此外，由于天然肌肉组织存在明显的取向纹理。为了使细胞培养肉展现出天然肌肉纹理，制备具有仿生取向的微结构具有重要意义。
3.目前，可通过取向静电纺丝、湿法挤出纺丝等技术实现取向微结构的制备。然而这些生物支架存在细胞渗透率不足等问题，导致支架在增加厚度方面受到严重的限制，无法实现3d立体结构的成型加工；且由于细胞难以渗透支架内部，导致在制备的细胞培养肉中细胞占比较低，难以突破70%。提高生物支架的孔隙结构是增加细胞渗透性的重要途经。因此，亟待一种新的可食用生物支架的制备技术来来解决孔隙率和生物相容性的挑战。
4.定向冻干是一种以温度梯度为驱动、定向形成冰晶模板的方法，经过冻干以后可形成3d一体的多孔气凝胶。所制备的材料具有丰富的微纳米孔穴，为细胞的渗透生长提供了所需的空间。此外，由于冰晶的定向形成，可在冰晶形成方向上，诱导支架材料微纤维发生有序排列。因此，该技术有望在体外直接制备具有仿生肌肉取向纹理的立体细胞培养肉。cn113208059a、cn113215090a利用该技术制备了明胶基和胶原蛋白衍生物取向生物支架，可作为细胞培养肉用的生物支架。然而明胶、胶原蛋白仍然属于动物蛋白，来源受限，这与细胞培养肉行业的愿景相违背。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供种可食用的壳聚糖谷朊粉仿生取向的细胞培养肉生物支架。
6.本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供：一种可食用壳聚糖麦谷蛋白仿生取向的细胞培养肉生物支架，其制备方法包括如下步骤：1)将麦谷蛋白、壳聚糖、其他可食用蛋白与水充分混合，调节混合液的ph为9～10，得到混合蛋白液，所述其他可食用蛋白的添加量为麦谷蛋白和壳聚糖质量之和的0～500%；2)将混合蛋白液转入定向支架模具中，使混合蛋白液在不超过10 min的时间内冷冻，脱模后冻干，得到未固定的生物支架；
3)将未固定的生物支架热交联，得到仿生取向生物支架。
7.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，麦谷蛋白、壳聚糖的质量用量比为(3～8)：(2～7)。
8.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，麦谷蛋白、壳聚糖使用醋酸溶液溶解后再与其他原料混合。
9.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，将定向支架模具置于乙醇、液氮混合液中进行速冻。
10.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述其他可食用蛋白选自大豆分离蛋白、土豆蛋白、玉米蛋白中的至少一种。
11.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述热交联的温度为90～150℃。
12.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述壳聚糖选自虾壳来源和/或蘑菇来源的壳聚糖。
13.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述壳聚糖的黏度范围在20～800 cps。
14.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述生物支架每平方厘米的块状支架，质构仪tpa测试的韧性不低于10000g。
15.本发明的第二个方面，提供：一种细胞培养肉，通过将动物细胞培养在生物支架上得到，细胞培养使用的生物支架如本发明第一个方面所述，具有仿生的色泽，其颜色范围为浅黄到棕色。
16.在一些细胞培养肉的实例中，所述动物细胞选自成肌细胞、肌肉卫星细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪前体细胞、成体干细胞和多能干细胞。所述细胞包括但不限于肌细胞、肝细胞、成骨细胞、成纤维细胞、成脂细胞、造牙本质细胞、成体神经元祖细胞、神经干细胞、来自脑室下前脑区的多个多潜能干细胞、室管膜神经干细胞、造血干细胞、肝造血干细胞、骨髓干细胞、脂肪的成纤维细胞、脂肪干细胞、产生多个胰岛细胞的干细胞、胰源性多能产生胰岛干细胞、间质干细胞、胎盘细胞、骨髓基质细胞、肌肉侧群细胞、骨髓来源的回收细胞、血液来源的间质前体细胞、骨髓来源的侧群细胞、肌肉前体细胞、循环的骨骼干细胞、神经祖细胞、多潜能成体祖细胞、中胚层祖细胞、脊髓祖细胞及孢子样细胞及任何组合所组成的群组。
17.本发明的有益效果是：本发明一些实例的可食用的壳聚糖谷朊粉仿生取向的细胞培养肉生物支架，所涉及的原材料均为非动物源的蛋白质，不仅具有良好的细胞相容性和生物安全性，还能促进细胞黏附生长。所制备的生物支架具有定向仿生取向结构，能够模拟天然肌肉组织的纹理，为细胞培养肉带来良好的口感。
18.本发明一些实例的可食用的壳聚糖谷朊粉仿生取向的细胞培养肉生物支架含有丰富的孔隙率有效提高了细胞的渗透能力。因此，本发明将为细胞培养肉和生物工程领域提供一种更健康更有效的生物支架。
附图说明
19.图1是tpa模式下的支架力学性能测试结果；图2是生物支架在冻干、热交联固定、细胞培养后的颜色变化；
图3是细胞培养肉生物支架接种c2c12细胞后5d的细胞活死染色图；图4是细胞培养肉生物支架接种c2c12细胞后12d的细胞活死染色图。
具体实施方式
20.本发明的第一个方面，提供：一种可食用壳聚糖麦谷蛋白仿生取向的细胞培养肉生物支架，其制备方法包括如下步骤：1)将麦谷蛋白、壳聚糖、其他可食用蛋白与水充分混合，调节混合液的ph为9～10，得到混合蛋白液，所述其他可食用蛋白的添加量为麦谷蛋白和壳聚糖质量之和的0～500%；2)将混合蛋白液转入定向支架模具中，使混合蛋白液在不超过10 min的时间内冷冻，脱模后冻干，得到未固定的生物支架；3)将未固定的生物支架热交联，得到仿生取向生物支架。
21.可以通过在蛋白液中添加可食用的碱或酸，如naoh、na2co3等来调整混合蛋白液的ph。其他可食用蛋白指麦谷蛋白之外的可食用蛋白，优选非动物来源的蛋白，更佳为植物蛋白。
22.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，麦谷蛋白、壳聚糖的质量用量比为(3～8)：(2～7)。这样既具有良好的强度，又具有很好地促进细胞黏附生长。
23.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，麦谷蛋白、壳聚糖使用醋酸溶液溶解后再与其他原料混合。这样可以更为均匀地混合。
24.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，将定向支架模具置于乙醇、液氮混合液中进行速冻。这样可以有效调控冻干过程的工艺温度，以实现孔结构的调整。
25.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述其他可食用蛋白选自大豆分离蛋白、土豆蛋白、玉米蛋白中的至少一种，以满足对口感和营养成分的个性化设计。
26.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述热交联的温度为90～150℃。通过控制热交联反应的温度和时间，可以进一步调整支架的颜色，使其更为接近天然肉。
27.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述壳聚糖选自虾壳来源和/或蘑菇来源的壳聚糖。这些来源的壳聚糖来源稳定，特别是蘑菇来源的壳聚糖，可以完全摆脱水产养殖的依赖。
28.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述壳聚糖的黏度范围在20～800 cps。
29.在一些细胞培养肉生物支架的实例中，所述生物支架每平方厘米的块状支架，质构仪tpa测试的韧性不低于10000g。这样具有更为接近天然肉的纤维感。
30.本发明的第二个方面，提供：一种细胞培养肉，通过将动物细胞培养在生物支架上得到，细胞培养使用的生物支架如本发明第一个方面所述，具有仿生的色泽，其颜色范围为浅黄到棕色。
31.在一些细胞培养肉的实例中，所述动物细胞自成肌细胞、肌肉卫星细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪前体细胞、成体干细胞和多能干细胞。所述细胞包括但不限于肌细胞、肝细胞、成骨细胞、成纤维细胞、成脂细胞、造牙本质细胞、成体神经元祖细胞、神经干细胞、来自脑室下前脑区的多个多潜能干细胞、室管膜神经干细胞、造血干细胞、肝造血干细胞、骨髓干细胞、脂肪的成纤维细胞、脂肪干细胞、产生多个胰岛细胞的干细胞、胰源性多能产生
胰岛干细胞、间质干细胞、胎盘细胞、骨髓基质细胞、肌肉侧群细胞、骨髓来源的回收细胞、血液来源的间质前体细胞、骨髓来源的侧群细胞、肌肉前体细胞、循环的骨骼干细胞、神经祖细胞、多潜能成体祖细胞、中胚层祖细胞、脊髓祖细胞及孢子样细胞及任何组合所组成的群组。
32.下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
33.以下实例中，如无特别说明，使用的定向冻干模具的底部为金属铜板，上层为含氟材料ptfe。
34.麦谷蛋白溶液通过将谷朊粉酸溶，然后去除不溶物得到。
35.百分比如无特别说明，均为质量百分比。
36.实施例1生物支架的制备：溶液配置：1)用1%的食品级冰醋酸配置5%谷朊粉，1000rpm隔夜搅拌；搅拌后，5000rpm转速下离心5分钟。取上清液，即为麦谷蛋白溶液；2)用1%的食品级冰醋酸配置2.5%虾壳壳聚糖（壳聚糖来源为sigma-aldrich提供的中等分子量，其脱乙酰度》95%）；3)麦谷蛋白溶液和壳聚糖溶液按照质量比为1:1进行混合，形成均匀支架溶液；在上述溶液中添加大豆膳食纤维，所述浓度为0.1mg/ml。
37.经过冰晶模板法定向冻干制备获得仿生生物支架，所述制备方法为：1)将支架溶液倒入到自制模具中，放置于-80℃乙醇液氮混合液中，静置20min，使溶液彻底冻住，经过冻干机冻干水分后，获得未固定的生物支架；2)待样品冻干完成，进行固定。具体方法为为热交联，将冻干的支架放置于100℃水上蒸15min；或者在蒸烤一体机中，保持140℃，蒸烤10min；3)待固定完成后，用pbs除去酸碱，调至中性。
38.生物支架的力学性能：质构仪是食品工业和科学研究中常用的质构测定仪器。利用ta.xt plus texture analyser质构仪，在全质构实验（texture profile abalysis, tpa，又二次咀嚼实验）模式下进行支架力学性能测试。
39.tpa测试时，用的是一个圆盘形探头，探头截面积大于样品面积，探头运行轨迹如下：1)探头起始位置归零后，先以1mm/s速率压向测试样品；2)接触到样品表面后再以测试速率对样品进行压缩一定的距离(5mm)；而后返回到压缩的触发点；3)停留一段时间后继续向下压缩同样的距离；而后以测后速率返回到探头测试前的位置。即可获得生物支架的力学性能。
40.tpa测试结果如图1所示，可以发现，定向冻干支架具有各向异性。例如，支架的咀嚼性，即把固态食品咀嚼成能够吞咽状态所需要的能量，在沿着冻干方向仅为垂直方向的20%。该各向异性和仿生的性能可提供非常接近天然肌肉组织的口感。
41.实施例2
生物支架的制备：1)用1%的食品级冰醋酸配置5%谷朊粉，1000rpm隔夜搅拌；搅拌后，5000rpm转速下离心5分钟。取上清液，即为麦谷蛋白溶液；2)用0.5%的食品级盐酸配置5%花生蛋白溶液，1000rpm隔夜搅拌，使花生蛋白全部溶解，即可获得花生蛋白溶液；3)用1%的食品级冰醋酸配置5%蘑菇来源壳聚糖（壳聚糖来源为食品级蘑菇壳聚糖，其黏度为100cps），得到壳聚糖溶液；4)麦谷蛋白溶液、花生蛋白和壳聚糖溶液按照质量比为1:1:1进行混合，形成均匀支架溶液；5)经过冰晶模板法定向冻干制备获得仿生生物支架，所述制备方法为：将支架溶液倒入到自制模具中。放置于-80℃乙醇液氮混合液中。静置20min，使溶液彻底冻住。经过冻干机冻干水分后，获得未固定的生物支架；6)待样品冻干完成，进行固定。具体方法为为热交联，将冻干的支架放置于100℃水上蒸15min；或者在蒸烤一体机中，保持140℃，蒸烤10min；7)待固定完成后，用pbs除去酸碱，调至中性。
42.生物支架的颜色变化：天然肉质产品具有典型的血红色素。因此，细胞培养肉同业也需要提供更加仿真的颜色。为此，本实施例利用普通光学相机记录生物支架在冻干、热交联固定、细胞培养后的颜色变化。
43.结果如图2所示，由于在热交联过程中，麦谷蛋白和壳聚糖之间发生了典型的美拉德反应。因此，颜色形成了棕色。经过细胞附着后，所制备的细胞培养肉展示出了非常靠近天然肉类的结构和颜色。
44.实施例3生物支架的制备：1)用1%的食品级冰醋酸配置5%谷朊粉，1000rpm隔夜搅拌；搅拌后，5000rpm转速下离心5分钟。取上清液，即为麦谷蛋白溶液；2)用1%的食品级冰醋酸配置5%蘑菇来源壳聚糖（壳聚糖来源为食品级蘑菇壳聚糖，其黏度为300cps），得到壳聚糖溶液；3)麦谷蛋白溶液和壳聚糖溶液按照质量比为1:1进行混合，形成均匀支架溶液；4)经过冰晶模板法定向冻干制备获得仿生生物支架，所述制备方法为：将支架溶液倒入到自制模具中。放置于-80℃乙醇液氮混合液中。静置20min，使溶液彻底冻住。经过冻干机冻干水分后，获得未固定的生物支架；5)待样品冻干完成，进行固定。具体方法为为热交联，将冻干的支架放置于100℃水上蒸15min；或者在蒸烤一体机中，保持140℃，蒸烤10min；6)待固定完成后，用pbs除去酸碱，调至中性。
45.细胞培养：1)细胞代数不超过6代的小鼠成肌细胞c2c12，培养于高糖培养基/胎牛血清（dmem/fbs）培养基中，所述培养基含10%fbs和1%三抗。细胞培养于37℃，5%co2培养箱中。待细胞在培养皿中达到80%覆盖率后，经过胰蛋白酶消化和离心，重悬获得细胞分散液。经过
计数，分散的细胞为105cells/ml的溶液备用。
46.2)本实施例所制备仿生支架，泡在75%医用酒精进行灭菌。同时将体系放于紫外灭菌灯进行灭菌处理。然后在生物安全柜中用pbs清洗5次，每次5min。移除pbs后，将细胞悬液接种于生物支架。使细胞贴壁生长。细胞培养于37℃，5%co2培养箱中。
47.3)细胞表征：待细胞培养5d后，加入适当体积的calcein am/pi检测工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果(calcein am为绿色荧光，ex/em=494/517nm；pi为红色荧光，ex/em=535/617nm)。
48.4)为了跟踪更长时间范围内细胞的黏附生长情况，培养时间延长至12天，重复上述染色过程。
49.实验结果(图3和图4)显示所有细胞呈现绿色荧光，这说明细胞的存活率超过95%以上，且细胞在支架上的黏附密度高，实验结果显示该定向冻干支架具有良好的细胞相容性，可促进细胞的黏附生长。对比第12天细胞的形态发生了明显的取向生长，说明本发明所制备的仿生支架对形成肌肉组织具有良好的促进作用。
50.以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。