一种用于前列腺癌评估的分子指标ApoA1表位肽，试剂盒

一种用于前列腺癌评估的分子指标apoa1表位肽，试剂盒
技术领域
1.本发明属于肿瘤诊断和治疗效果评估技术领域，具体涉及用于前列腺癌危险度诊断和疗效评估的分子指标、试剂盒。


背景技术：

2.在男性肿瘤中，前列腺癌仅次于肺癌，排名第二。2017年全球新发前列腺癌约134.4万，其中美国有27.8万例。如何在早期筛查中发现前列腺癌风险，并对相关药物的治疗效果进行有效性评估对有效防护前列腺癌并针对每一名患者进行精准用药具有重要意义。
3.本发明发现一种血清分子指标可以精确地诊断前列腺癌的危险程度并可以用来评估前列腺癌的治疗效果。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种可以方便且精确地辅助诊断前列腺癌的危险等级并评估前列腺癌的治疗效果的血清分子指标apoa1蛋白表位肽，以及相应的试剂盒。
5.本发明发现apoa1蛋白通过血小板脱颗粒影响重离子治疗效果，进一步分析发现apoa1蛋白中存在4段表位肽能引起强烈的抗体反应，并由此提供一种抗体诊断试剂，通过该试剂能有效诊断前列腺癌的危险等级和评估治疗效果。
6.本发明提供的四段功能表位肽，是基于生物信息学、结构生物学及b细胞表位分析等方法对apoa1蛋白进行分析筛选而来，并用人工合成，其序列如seq id no.1、seq idno.2、seq idno.3、seq idno.4所示；它们能引起强烈的免疫反应，产生特异性抗体，可用于检测apoa1的含量和存在（表1和图1）。具体以这些肽作为抗原免疫动物制作针对性抗体，得到的特异抗体可以较灵敏地检测低危、中危和高危的前列腺癌病人，并可对前列腺癌的治疗效果进行评估。
7.本发明首先通过itraq检测前列腺癌不同危险分期和治疗不同阶段的血清蛋白组表达变化，发现apoa1在不同危险分期前列腺癌中的表达有显著差异（p《0.001），而且在重离子治疗的不同阶段和肿瘤症状好转（基于肿瘤体积大小和病理指标）的过程中，该分子指标的含量具有明显的差异（p《0.001）（表1和图1）。
8.通过差异蛋白富集分析发现该分子通过血小板脱粒影响重离子治疗的效果（图2）。
9.本发明还涉及基于表位肽序列（seq id no.1、no.2、no.3、no.4）所制备的特异性抗体，该抗体能监测血清中apoa1蛋白的含量，从而检测前列腺癌危险程度和评估治疗效果。
10.本发明还提供用于前列腺癌危险度诊断和疗效评估的试剂，基于权利要求1所述的分子指标制备得到。
11.本发明还提供用于前列腺癌危险度诊断和疗效评估的试剂盒，该试剂盒基于所述
的分子指标制备得到，包括以所述的分子指标作为标准蛋白分子对照，所述的分子指标制作的特异抗体分子作为探针。该试剂盒可用于血清和组织中apoa1蛋白含量的测定，以便对相应肿瘤的危险度和治疗效果进行分析评估。具体地，能分辨低危、中危和高危前列腺癌病人（p《0.05），并能用于前列腺治疗效果的评估（p《0.05）（图1）。
附图说明
12.图1 不同危险程度前列腺癌病人在重离子治疗前中后apoa1蛋白的表达变化（表位肽抗体法检测验证itraq检测结果）。
13.图2 aopa1蛋白通过血小板脱粒发挥作用。
14.图3 apoa1表位肽抗体检测法诊断前列腺癌危险等级及重离子治疗效果评估。其中，1为重离子治疗前，2为治疗一星期症状减轻，3为治愈后出院一个月。
具体实施方式
15.1.对外周血进行取样，抽血后2小时内应进行处理。
16.2.室温下血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟（2000-3000转/分）取上清液。
17.3.按1:1-1:500在200μl试管中梯度稀释待测。
18.4.在96或48孔板上分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。标准品孔加入50μl标准品，待测样品孔中加待测样品50μl。分别将样品加于酶标板各孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；标准孔分别加入一定浓度的各目标表位肽（序列为seq id no.1、no.2、no.3、no.4）：seqno.1：dsvtstfsklreqlgpvtqefwdnleketeglrqemseqno.2：vdvlkdsgrdyvsqfegsalgkseqno.3：ehlstlsekakpaledlrqgllpvlesfkseqno.4：dnleketeglrqemskdleevkakvqpylddfqk。
19.5.温育、洗涤和加酶：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；小心揭掉封板膜，弃去液体并甩干；然后每孔加满洗涤液静置30秒后弃去，重复洗涤5次，甩干；每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
20.6.显色和终止：每孔先加入显色剂a 50μl，再加入50μl显色剂b，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时溶液由蓝色立转黄色）。
21.7.以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（od值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。以标准物的浓度为横坐标，od值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的od值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与od值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的od值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
22.8.前列腺癌诊断指标：以正常为对照，如果样本浓度为正常的（1-2）倍，为低危病人；（2-3）倍，为中危病人；3倍以上即为高危病人。治疗效果评估：中危和高危病人，如果治疗后，样本浓度回归2倍以下，即为治疗好转；如回归正常水平，即基本恢复。
23.表1 不同危险程度及不同治疗阶段前列腺癌病人血清中apoa1蛋白表达水平（4种表位肽抗体法检测验证itraq检测结果）
。


技术特征：
1.一种用于前列腺癌危险度诊断和疗效评估的分子指标，其特征在于，为基于apoa1蛋白制备的功能表位肽，其序列为seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示。2.一种基于权利要求1所述分子指标制作的特异抗体，该抗体能监测血清中apoa1蛋白的含量，从而检测前列腺癌危险程度和评估治疗效果。3.一种用于前列腺癌危险度诊断和疗效评估的试剂，其特征在于，基于权利要求1所述的分子指标制备得到。4.一种用于前列腺癌危险度诊断和疗效评估的试剂盒，其特征在于，基于权利要求1所述的分子指标制备得到，包括以权利要求1所述的分子指标作为标准蛋白分子对照，权利要求1所述的分子指标制作的特异抗体分子作为探针。

技术总结
本发明属于肿瘤诊断和治疗效果评估技术领域，具体为用于前列腺癌评估的分子指标ApoA1表位肽、试剂盒。本发明用iTRAQ大量检测前列腺癌治疗前后的血清蛋白的含量变化，发现ApoA1蛋白与前列腺癌的危险分级和治疗疗效密切相关。然后筛选和人工合成ApoA1中的功能表位肽，并以这些肽作为抗原免疫动物制作针对性抗体，得到的特异抗体可以较灵敏地检测低危、中危和高危的前列腺癌病人，并可对前列腺癌的治疗效果进行评估；该分子标志物可用来作为检测的标准对照和制备抗体用于生产相应肿瘤诊断和研究试剂盒。断和研究试剂盒。断和研究试剂盒。


技术研发人员：梁雨来 谢君 朱乃硕
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2022.01.17
技术公布日：2022/5/6