菜豆α-吡喃酮还原酶PvTKPR2基因及其编码蛋白和应用

菜豆
α-吡喃酮还原酶pvtkpr2基因及其编码蛋白和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种菜豆pvtkpr2基因及其编码蛋白和应用。


背景技术：

2.单性结实(parthenocarpy)是指子房不经过双受精作用而形成不含种子果实的现象，所结的果实被称为无籽果实。单性结实主要有两个优点，其一是在授粉失败时，仍能长出果实。由于授粉过程对环境的温度、湿度、光照等条件要求比较高，单性结实使得作物在不良的环境条件下仍能结出果实，进而提高作物的稳产能力。其二是单性结实可以提高某些植物(如番茄、黄瓜、茄子)的产量、品质和经济效益。
3.菜豆(snap bean)主要食用鲜荚，菜豆单性结实而形成的肉质无籽荚具有直接食用或加工的潜能，但目前尚未有菜豆单性结实成为肉质无籽荚的报道。因此，利用基因的手段培育出能够单性结实的菜豆种质资源具有重要的理论及实际意义。
4.无论是常规杂交育种还是分子设计育种，目标都是将父母本的优良性状组合在一起，以达到培育良种的目的，杂交是其中的必须环节。菜豆杂交过程中的去雄环节常常会发生去雄不完全或碰伤柱头而导致杂交失败的现象。


技术实现要素：

5.本发明是要解决现有菜豆杂交过程中由于去雄不完全或碰伤柱头而导致杂交失败的问题，提供一种菜豆α-吡喃酮还原酶pvtkpr2基因及其编码蛋白和应用。
6.本发明菜豆α-吡喃酮还原酶pvtkpr2基因的核苷酸序列如序列表中seq id no：1所示。
7.本发明菜豆α-吡喃酮还原酶pvtkpr2基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
8.本发明菜豆α-吡喃酮还原酶pvtkpr2基因在维持菜豆雄性育性中的应用。
9.本发明菜豆α-吡喃酮还原酶pvtkpr2基因在培育杂交菜豆新品种中的应用。
10.本发明菜豆α-吡喃酮还原酶pvtkpr2基因在培育肉质无籽荚菜豆品种中的应用。
11.本发明还提供菜豆突变体中pvtkpr2
slp
基因的核苷酸序列，如序列表中的seq id no：3所示。
12.菜豆突变体中pvtkpr2
slp
基因编码的pvtkpr2
slp
蛋白的氨基酸序列，如序列表中的seq id no：4所示。
13.本发明的有益效果：
14.本发明在分子水平上首次成功地克隆出菜豆α-吡喃酮还原酶pvtkpr2基因。本发明通过植物生理学和分子生物学方法，证实pvtkpr2基因在菜豆花粉发育中发挥重要的功能，该基因的突变体表现出完全的雄性不育表型，该突变体能够单性结实而产生大量的肉质无籽荚。在外施生长素和细胞分裂素的情况下，突变体的肉质无籽荚鲜重能够增大两倍，具有加工或直接食用的价值。此外，pvtkpr2基因突变体作为杂交母本，可以省去菜豆杂交
工作的去雄过程，不仅简化杂交过程还可以大大提高杂交的成功率。
15.本发明首次阐明菜豆中pvtkpr2基因菜豆肉质无籽荚产生过程中的功能，为培育菜豆肉质无籽荚提供种质资源和理论依据。此外，pvtkpr2基因的发现在通过雄性不育系培育杂交菜豆新品种方面具有重要的应用价值。
附图说明
16.图1为在突变体库中筛选到能够产生肉质无籽荚的突变体slp；
17.图2为完全开放的dalong1的花中有大量花粉而slp突变体的花无花粉；
18.图3为对dalong1和slp突变体的花药进行亚历山大染色的比较图；
19.图4为slp突变体的肉质无籽荚与dalong1荚的荚长的比较图；
20.图5为slp突变体的肉质无籽荚与dalong1荚的荚宽的比较图；
21.图6为slp突变体的肉质无籽荚与dalong1荚的荚厚的比较图；
22.图7为slp突变体的肉质无籽荚与dalong1荚的单荚鲜重的比较图；
23.图8为slp突变体的单株荚数约为dalong1的单株荚数的50倍；
24.图9为在不同荚发育阶段dalong1中双受精的种子和slp突变体中未受精的胚珠的比较图；
25.图10为利用barcbean6k_3 beadchip将slp位点初定为在3号染色体m1127至m825区段；
26.图11为利用本发明针对dalong1和pi60234品种设计的124个分子标记将slp位点初定为在3号染色体pvm44至pvm44区段；
27.图12为slp位点精细定位于pvxk-16与pvxk-11之间76.1kb区段；
28.图13为利用igv软件观察候选基因phvul.003g031200在slp突变体基因组中有7bp缺失；
29.图14为候选基因phvul.003g031200的基因结构示意图及突变位点标识；
30.图15为pvxk-7分子标记在pi60234、slp突变体和dalong1中的电泳条带图；
31.图16为系统进化树分析phvul.003g031200基因属于tkpr家族基因；
32.图17为候选基因phvul.003g031200在dalong1和slp突变体中的rna序列比较；
33.图18为在slp突变体中无法检测到被可变剪切掉的外显子序列；
34.图19为与dalong1相比，slp突变体中phvul.003g031200基因的表达量无变化；
35.图20为候选基因phvul.003g031200在dalong1和slp突变体中的蛋白质序列比较；
36.图21为与dalong1相比，slp突变体中phvul.003g031200蛋白的亚细胞定位无变化；
37.图22为dalong1的6mm宽幼荚、dalong1的12mm宽成熟荚和slp突变体的6mm宽肉质无籽荚中植物激素含量测定结果；
38.图23为外施生长素和细胞分裂素后slp突变体的肉质无籽荚的表型；
39.图24为外施生长素和细胞分裂素后slp突变体的肉质无籽荚与未外施激素的slp肉质无籽荚和dalong1荚的荚长的比较图；
40.图25为外施生长素和细胞分裂素后slp突变体的肉质无籽荚与未外施激素的slp肉质无籽荚和dalong1荚的荚宽的比较图；
41.图26为外施生长素和细胞分裂素后slp突变体的肉质无籽荚与未外施激素的slp肉质无籽荚和dalong1荚的荚厚的比较图；
42.图27为外施生长素和细胞分裂素后slp突变体的肉质无籽荚与未外施激素的slp肉质无籽荚和dalong1荚的单荚鲜重的比较图。
具体实施方式
43.下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
44.实施例1：菜豆雄性不育突变体slp可以单性结实
45.一、利用
60
co辐射菜豆品种dalong1，获得菜豆突变体库，将m3代种植在哈尔滨平房(45
°
70
′
n，126
°
64
′
e)，从中筛选到能够产生大量肉质无籽荚的突变株slp(seedless pod)，如图1所示。
46.二、对dalong1和slp突变体进行正反交实验，结果显示，以slp突变体为父本、dalong1为母本，无法获得种子发育正产的荚；以dalong1为父本、slp突变体为母本，可以获得种子发育正常的荚，如图1中*标识所示。因此，slp突变体是菜豆雄性不育突变体。
47.三、观察dalong1和slp突变体完全开放的花，发现dalong1有大量的花粉黏附在柱头上用于双受精，slp突变体无花粉黏附在柱头上，无法完成双受精过程，如图2所示。
48.四、对dalong1和slp突变体的花药进行压力山大染色观察，发现dalong1的花药中有大量的花粉被染成粉红色，而slp突变体的花药中无花粉，如图3所示。
49.五、与dalong1的荚相比，slp突变体可以产生较小的肉质无籽荚，slp突变体的肉质无籽荚的荚长度、荚宽度、荚厚度和单荚鲜重均小于dalong1的荚，如图4-图7所示。
50.六、在温室中种植，统计20株dalong1和slp突变体的单株荚数，结果显示，slp突变体的单株荚数约为dalong1单株荚数的60倍，如图8所示。
51.七、在体视显微镜下观察，dalong1和slp突变体的荚，发现dalong1荚中的种子能够伴随幼荚的生长而长大，但slp突变体荚中的种子无法伴随幼荚的生长而长大，如图9所示，因此，slp突变体产生的肉质无籽荚实则是败育子房膨大而成的单性结实。
52.实施例2：菜豆slp基因定位
53.一、利用菜豆品种pi60234为父本、slp突变体为母本，进行杂交，获得10粒杂交粒，种植3粒，杂交粒自交后收获1346粒f1种子，其中有籽荚植株与肉质无籽荚突变株的比率为3:1，说明slp突变体肉质无籽荚的表型由单一基因隐性控制，如表1所示。
54.表1 f2代群体表型的分离比
[0055][0056]
二、利用ctab方法提取f2代中22个有籽荚植株、24个肉质无籽荚植株、dalong1和pi60234的基因组，利用barcbean6k_3beadchip对该48个个体进行基因分型。去除不稳定的snp信号，共获得5398个snp分子标记，其中在dalong1和pi60234之间存在多态性的snp分子标记共1545个。1545个分子标记可分为11个连锁群，这11个连锁群可对应菜豆的11条染色
体，如表2所示。基因分型的结果通过qtl icimapping_4.0软件分析，结果显示候选基因定位于3号染色体引物marker1127(990,752bp)和marker825(3,463,964bp)之间，如图10、表3所示。
[0057]
表2利用pi60234与slp杂交而来的f2群体构建的11个连锁群的基本信息
[0058][0059][0060]
三、利用ctab方法提取f2代中另外74个有籽荚植株、20个肉质无籽荚植株、dalong1和pi60234的基因组，利用本发明针对dalong1和pi60234两个品种设计的124对indel分子标记对该96个个体进行基因分型。基因分型的结果通过qtl icimapping_4.0软件分析，结果显示候选基因定位于3号染色体引物pvm44(2,571,292)和pvm45(3,463,964)之间，如图11、表3所示。
[0061]
四、综合上面两种基因初定位结果，认为候选基因定位于pvm44和marker825之间。
[0062]
表3利用snp和indel分子标记获得的slp位点的初定位结果
[0063][0064]
五、在pvm44与marker825之间设计9个用于精细定位的分子标记，如表4所示。在342个肉质无籽荚f2代个体中，我们获得6个可用于基因精细定位的重组体，进一步将slp定位于pvxk-16与pvxk-11之间的76kb的区段，如图12所示，该区段中包含4个基因：phvul.003g031000、phvul.003g031200、phvul.003g001300和phvul.003g031400。
[0065]
表4用于精细定位的9个引物
[0066][0067][0068]
六、利用igv软件筛查上述4个基因，发现只有phvul.003g031200的基因序列在dalong1和slp突变体中存在差异，如图13所示；在slp突变体中phvul.003g031200基因的第四个内含子中缺失4bp，在第五个外显子中缺失3bp，如图14所示，说明phvul.003g031200是slp位点的最优候选基因。
[0069]
七、pvxk-7分子标记位于phvul.003g031200基因内部，可用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分pi60234和slp突变体基因型，也可以区分dalong1和slp突变体基因型，如图15所示。图15的1至4的泳道分别表示pi60234、slp突变体、pi60234+slp突变体和dalong1。利用pvxk-7分子标记对1346个f2代个体和2560个f
2:3
代个体，共计3906个个体进行基因分型，结果显示，共计785个肉质无籽荚植株均是pvmxk7
slp
基因型；3121个有籽植株是pvmxk7
pi60234
或pvmxk7
pi60234/slp
基因型。另外，若f2代植株为pvmxk7
pi60234
基因型时，所得f
2:3
代植株均为有籽植株，若f2代植株为pvmxk7
pi60234/slp
基因型时，f
2:3
代植株可分离为有籽植株和肉质无籽荚植株，且分离比为3:1。综上所述，pvxk-7分子标记与肉质无籽荚表型共分离，如表5所示，因此phvul.003g031200基因为slp突变体的控制基因。
[0070]
表5 pvxk-7分子标记与肉质无籽荚表型共分离
[0071][0072][0073]
八、在phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov)利用phvul.003g031200蛋白序列比对拟南芥蛋白质组，发现与其相似性最高的是拟南芥tkpr2蛋白。分别下载菜豆、拟南芥、大豆、水稻中与phvul.003g031200蛋白序列相似性较高的蛋白质的序列，并利用meag6对它们进行系统发育树比较，结果显示phvul.003g031200属于α-吡喃酮还原酶(tetraketideα-pyrone reductase2)家族中的tkpr2分枝上的成员，如图16所示，故将phvul.003g031200基因命名为pvtkpr2基因。
[0074]
实施例3：pvtkpr2和pvtkpr2
slp
基因的克隆
[0075]
一、以dalong1及其突变体slp突变体为材料，用购买自康维世纪公司的omini plant rna试剂盒(cw25985)的操作手册提取花的总rna。
[0076]
二、取1μg总rna用于cdna的合成，cdna的合成操作按照购买自全式金公司的transscript one-step gdna removal and cdna sythesis supermix试剂盒(at311-03)的使用手册进行，获得cdna；
[0077]
三、以获得的dalong1和slp突变体的cdna为模板通过正向引物f与反向引物r分别扩增pvtkpr2和pvtkpr2
slp
基因，pcr反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35s，共38循环，再72℃延伸10min，将pcr产物在abi3130测序仪(abi公司)上进行测序。测序结果表明菜豆pvtkpr2基因由960个碱基组成，其核苷酸序列如序列表中的seq id no：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表中的seq id no：2所示。slp突变体中pvtkpr2
slp
基因由951个碱基组成，其核苷酸序列如序列表中的seq id no：3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表中的seq id no：4所示。
[0078]
正向引物f：5'-atgcctgagttttgcgtgac-3'
[0079]
反向引物r：5'-caggaagcccttgtcttgaaaac-3'
[0080]
四、由于slp突变体中phvul.003g031200基因缺失缺失的7bp(第四个内含子中4bp，在第五个外显子中3bp)位于mrna剪接的关键位点上，导致slp突变体中phvul.003g031200基因的剪接发生改变，最终使得pvtkpr2
slp
基因的mrna中缺失9bp，如图17(黑色字体表示外显子，灰色字体表示内含子，方框中表示缺失的7bp，三角形表示间接位点)所示。为验证这个观点，本发明针对缺失的9bp设计qpcr正向引物qpcr-f1(红色字体表示缺失的9bp)和反向引物qpcr-r1，分别以获得的dalong1和slp突变体的cdna为模板，可以在dalong1中检测到信号，但不能在slp突变体检测到信号，如图18所示。
[0081]
qpcr正向引物qpcr-f1：5'-tagcattatcaaaggcatggtag-3'
[0082]
qpcr反向引物qpcr-r1：5'-catagccaacaagtgagcag-3'
[0083]
五、以获得的dalong1和slp突变体的cdna为模板通过qpcr正向引物qpcr-f2和反向引物qpcr-r2分别检测pvtkpr2和pvtkpr2
slp
基因在dalong1和slp突变体的表达量，结果显示，pvtkpr2
slp
基因7bp的缺失并不影响其基因的表达量，如图19所示。
[0084]
qpcr正向引物qpcr-f2：5'-gcaccacaaccaacaagt-3'
[0085]
qpcr反向引物qpcr-r2：5'-tatcctccatagccaacaag-3'
[0086]
六、菜豆pvtkpr2蛋白由319个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表中的seq id no：2所示。slp突变体中pvtkpr2
slp
蛋白由316个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表中的seq id no：4所示。与pvtkpr2蛋白质序列相比pvtkpr2
slp
蛋白序列缺少了3个氨基氨酸，如图20(方框中表示缺失的mrna和氨基酸序列)所示。亚细胞定位的结果显示，pvtkpr2
slp
蛋白pvtkpr2蛋白的亚细胞定位均位于内质网中，故该3个氨基酸的缺失并不影响pvtkpr2
slp
蛋白亚细胞定位，如图21所示。
[0087]
实施例4：外施生长素和细胞分裂素可以使slp的单性结实的荚增大约3倍
[0088]
一、为探索使slp突变体的单性结实的荚增大的方法，分别对dalong1中可以继续生长发育的6mm宽的幼荚、dalong1中完成生长发育的12mm宽的成熟荚和slp突变体中完成生长发育的6mm宽的肉质无籽荚进行植物激素含量测定。结果显示，与dalong1的6mm宽的幼荚相比，dalong1的12mm宽的成熟荚和slp突变体的6mm宽的肉质无籽荚的生长素和细胞分裂素的含量明显下调，如图22所示。
[0089]
二、在slp突变体的盛荚期喷施2μm吲哚乙酸(生长素)和1μm玉米素核苷(细胞分裂素)，喷施后5天发现未喷施的对照相比肉质无籽荚有明显增大的表型，最终收获的无籽肉荚比未喷施的对照增大3倍，如图23-图27所示。
[0090]
实施例5：slp突变体是可用于菜豆杂交育种的全新种质资源
[0091]
菜豆的杂种优势非常明显，3粒菜豆杂交粒可收获13246粒种子，如表1所示。以slp突变体为母本，可以省去菜豆杂交中的去雄过程，进而减少对柱头的碰撞，这样不仅简化杂交过程还可以大大提高杂交的成功率。本实验中以slp突变体为母本，分别以菜豆品种pi60234、盛优1号、九粒白、白不老、无架四季豆、红芸豆为父本都非常容易进行杂交工作，如表6所示，所以slp突变体是可用于菜豆杂交育种的全新种质资源。
[0092]
表6 slp突变体作为母本与其他菜豆品种的杂交情况。
[0093]