一种烟草NtCNGC4基因在制备调控株高和叶片氨基酸含量的烟草突变体材料中的应用的制作方法

一种烟草ntcngc4基因在制备调控株高和叶片氨基酸含量的烟草突变体材料中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种烟草ntcngc4基因在制备调控株高和叶片氨基酸含量的烟草突变体材料中的应用。


背景技术：

2.环核苷酸门控通道(cyclic nucleotidegated channels,cngcs)属于非选择性阳离子通道基因家族，广泛存在于动物和植物中。cngcs家族的一些基因已在大麦、拟南芥、玉米、烟草等植物中被克隆和研究，是一类受环核苷酸(camp)门控的通道。研究表明，植物cngcs可以通透钾、钠、钙和镁等阳离子，与重金属胁迫、盐胁迫、植物病原反应等生理过程相关，还参与植物的生长发育调控。
3.本发明的环核苷酸门控通道基因在烟草株高和叶片氨基酸含量调控中的功能目前没有报道。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种烟草ntcngc4基因在制备调控株高和叶片氨基酸含量的烟草突变体材料中的应用，为烟草株高和叶片氨基酸含量调控提供材料借鉴。
5.本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
6.一种烟草ntcngc4基因在制备调控株高和叶片氨基酸含量的烟草突变体材料中的应用。
7.优选地，上述技术方案中，所述突变体材料的创制方法包括以下步骤：
8.(1)选择ntcngc4基因中较特异的23nt核苷酸序列为crispr/cas9 的引导序列，并将该序列片段与crispr/cas9载体进行连接、转化和pcr 扩增检测，pcr阳性克隆，获得crispr/cas9-ntcngc4编辑载体；
9.(2)利用所构建的crispr/cas9-ntcngc4编辑载体，进行遗传转化和组培，获得ntcngc4基因发生敲除编辑的植株。
10.优选地，上述技术方案中，还包括：
11.(3)采用gc-ms进行ntcngc4基因纯合敲除素材的叶片的氨基酸含量的检测。
12.优选地，上述技术方案中，还包括：
13.(4)采用育种实验种植方法观察植株的生长状况。
14.优选地，上述技术方案中，扩增ntcngc4基因的引物序列为：
15.上游引物f：tattcccaaacccataaac(seq id no.3)；
16.下游引物r：ggagtgttaccttagtggttctttg(seq id no.4)。
17.优选地，上述技术方案中，步骤(1)中，所述ntcngc4基因中较特异的23nt核苷酸序列如seq id no.5所示。
18.优选地，上述技术方案中，所述烟草品种为红花大金元。
19.本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
20.(1)本发明通过crispr/cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除，ntcngc4基因的crispr/cas9编辑载体，经编辑素材创制和分子检测鉴定后获得了ntcngc4基因敲除的烟草植株。本发明获得的ntcngc4基因敲除的烟草基因编辑植株，相比于对照烟草植株，较为矮小，为培育调控株高的烟草品种提供了材料参考。
21.(2)本发明利用crispr/cas9介导的基因编辑技术敲除ntcngc4基因，获得了叶片中氨基酸含量显著降低的烟草基因编辑素材，这为进一步阐明烟草氨基酸调控机理提供了理论依据，为培育氨基酸含量显著改变的烟草品种提供了材料借鉴。
附图说明
22.被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。
23.图1为本技术的ntcngc4基因编辑材料植株与对照植株的株高比较图。
24.图2为本技术的ntcngc4基因编辑植株叶片氨基酸含量降低示意图。
具体实施方式
25.现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
26.以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
27.实施例1ntcngc4基因的获得
28.本实施例主要就烟草环核苷酸门控通道相关的基因ntcngc4的获得过程，简要介绍如下。
29.以栽培种烟草红花大金元叶片为样品，利用rna提取试剂盒提取烟草叶片总rna，反转录为cdna备用：
30.按照植物rna提取试剂盒说明书提取烟草总rna。
31.1μg从叶片中提取总rna用于反转录，转录体系如下：
32.totalrna1μg，
33.oligo(dt)(10μm)1.5μl，
34.ddh2oupto15μl。
35.将上述体系混匀后置于pcr中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：
[0036][0037]
上述体系放入pcr仪中，42℃65min，65℃10min，4℃保温，然后置于
ꢀ‑
20℃冰箱中保存使用。
[0038]
通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：
[0039]
上游引物f：tattcccaaacccataaac(seq id no.3)；
[0040]
下游引物r：ggagtgttaccttagtggttctttg(seq id no.4)。
[0041]
以上述所制备cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增：
[0042]
扩增体系(50μl)：
[0043][0044][0045]
混匀离心后进行pcr扩增，pcr反应条件为：95℃10sec，52℃30sec， 72℃2.5min，共30个循环；72℃10min；12℃hold。
[0046]
对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草环核苷酸门控通道相关的基因 ntcngc4序列，其碱基序列如seq id no.1所示，共包括2019bp个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如seq id no.2所示，共包括 672个氨基酸，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。
[0047]
实施例2载体的构建
[0048]
利用实施例1中所获得烟草环核苷酸门控通道相关的基因ntcngc4，本发明进一步构建了crispr/cas9载体，以及利用叶盘法转化获得基因编辑植株。
[0049]
(1)ntcngc4基因的sgrna序列的设计和合成：
[0050]
选择ntcngc4基因中较特异的23nt核苷酸序列(seq id no.5)为 crispr/cas9的
引导序列，并将该序列片段与crispr/cas9载体(由西南大学提供)进行连接、转化和pcr扩增检测，pcr阳性克隆送测序公司进行测序确认，最后得到crispr/cas9-ntcngc4编辑载体。
[0051]
实施例3转化农杆菌
[0052]
利用上一步实施例2所构建的crispr/cas9-ntcngc4编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化和组培，以获得烟草环核苷酸门控通道相关的基因ntcngc4发生敲除编辑的植株，相关实验过程简要介绍如下。
[0053]
将烟草种子表面消毒后点种至ms培养基上，待长到4片子叶(15-20d)，移入含ms固体培养基的培养瓶中，于25
±
1℃、光照强度30-50μmol/(m2·
s)，光照时间为16h/d条件继续培养35-40d，备用。
[0054]
取出-80℃保存的lba4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。待感受态刚刚解冻时，加入crispr/cas9-ntcngc4编辑载体质粒的2μl，混匀，置于冰上。后将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1ml的yeb液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h。8000rpm离心菌体弃掉上清培养基，然后用200μl的yeb液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/l利福平、50mg/l链霉素和50mg/l卡那霉素的yeb固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d。
[0055]
实施例4侵染愈伤组织
[0056]
在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用ms液体制备含有crispr/cas9-ntcngc4编辑载体的农杆菌菌落成悬浮菌液 (od
600
＝0.6-0.8)。利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min。之后将叶盘置于含2.0mg/l naa+0.5mg/l 6-ba的ms固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3d。之后进行继代培养，放置于含2.0mg/l naa+0.5mg/l 6-ba+250mg/lcb+50mg/l kan的ms固体培养基上，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·
s)，25℃黑暗培养8h/d，培养45-60d，直至分化芽形成，每7-10d更换一次分化培养培养基，更换3-4次；培养至分化芽形成；将已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有500mg/l羧苄青霉素与50mg/l卡那霉素的ms培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件与分化培养条件一致，培养8-14d；再生植株生根培养，将分化芽切下，插入含有500mg/l羧苄青霉素与50mg/l卡那霉素的ms培养基上进行生根培养，培养条件与分化培养条件一致，培养20-30d，再生移栽至花盆后进行培养，后进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得ntcngc4基因编辑植株，之后进行收种获得t0代编辑植株种子。t0代种子按23倍进行自交纯合扩繁，待植株长到5-6片叶时，单株的叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得ntcngc4基因发生纯合编辑的植株，之后进行收种获得 ntcngc4基因纯合编辑的种子。
[0057]
本发明所述的烟草环核苷酸门控通道基因ntcngc4的应用为在烟草植株体内降低所述ntcngc4基因的表达，可调控烟草株高和叶片中氨基酸含量。现有技术领域内常用的降低基因表达或者基因沉默的方法均适用于本发明。
[0058]
实施例5gc-ms检测
[0059]
利用实施例2中分子检测确定为ntcngc4基因纯合敲除的植株，进行收种获得基因纯合编辑素材。然后以gc-ms进行ntcngc4基因纯合敲除素材的叶片的氨基酸含量的检测试验。
[0060]
选择成熟期的烟株，分别采集5株对照(未编辑)烟草植株、ntcngc4 基因纯合编辑
的烟草植株的同一叶位的烟叶样本；叶片去主筋，锡箔纸包裹后液氮保存运输，实验室超低温(-70℃)保存，冻干磨粉过筛。
[0061]
标准品的衍生过程：准确吸取1ml混合标准品样品，加入1ml 1mol/l三乙胺乙腈溶液，并加入1ml 0.1mol/l苯基异硫氰酸酯乙腈溶液，涡旋混匀1min，室温反应半个小时，待反应完全后加入2ml正己烷溶液，涡旋1min，静置 10min,取下层清液200μl置于样品瓶加入800μl超纯水，混匀15s，过滤，供液相分析用。(标曲范围：2.5μg/ml-50μg/ml)。
[0062]
样品前处理及衍生：称取烟叶粉末0.3000g置于15ml离心管，加入 5ml0.1mol/l盐酸水溶液，超声提取40min,8000r/min离心10min，准确移取 1ml上清液，加入1ml 1mol/l三乙胺乙腈溶液，并加入1ml 0.1mol/l苯基异硫氰酸酯乙腈溶液，涡旋混匀1min，反应半个小时，待反应完全后加入2ml 正己烷溶液，涡旋1min，静置10min,取下层清液200μl加入800μl超纯水，混匀15s，过滤后置于样品瓶，供液相分析用。
[0063]
仪器方法：
[0064]
a:50mmol/l乙酸钠(ph＝6.5)(93:7乙腈)；
[0065]
b:甲醇：acn：水＝2:6:2；
[0066]
色谱柱：dikma endeavosil c18，100*2.1mm，1.8μm；
[0067]
波长：254nm；
[0068]
柱温：40℃；
[0069][0070]
ntcngc4基因纯合编辑烟草及对照(未编辑)植株叶片中氨基酸含量比较(结果如图2所示)。与对照相比，ntcngc4基因纯合编辑烟草植株叶片中，精氨酸、脯氨酸、组氨酸和总氨基酸等含量均显著降低。
[0071]
实施例6
[0072]
利用实施例2中分子检测确定为ntcngc4基因纯合敲除的植株，进行收种获得基因纯合编辑素材。然后采用育种实验种植方法观察植株的生长状况。
[0073]
选择成熟期各5-10株编辑素材和对照素材开展株高、顶叶长和顶叶宽、叶数等性状调查。
[0074]
结果显示，ntcngc4基因编辑材料的株高显著低于对照(未编辑)红花大金元，顶叶长、顶叶宽和叶数等与对照无明显差异。
[0075]
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。