用于处理养猪废水的枯草芽孢杆菌菌株SC株及其应用

用于处理养猪废水的枯草芽孢杆菌菌株sc株及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种可用于处理养猪废水的微生物菌株，特别涉及一株枯草芽孢杆菌菌株sc株在处理养猪废水中的应用，还涉及一种处理养猪废水的方法。本发明属于农业生产技术领域。


背景技术：

2.中国是世界上最为庞大的生猪规模化养殖与消费产业国家之一。随着经济不断发展，生猪养殖产业链规模不断扩大，根据2016年中国统计年鉴，在2015年我国猪肉年产量5486.5万吨，生猪养殖规模十分巨大(国家统计局，2016)，而产生的禽畜粪便也已经成为一大主要污染源，随之带来的环境污染问题也越来越凸显。我国禽畜粪便总体产生量现已达到2.43x108吨，尿液为1.63x108吨，总氮为1.02x106吨，总磷为1.60x105吨(潘庆，2002)，cod排放量已经达到7118万吨，远远超过工业废水以及生活废水cod的排放量之和，由于大部分生猪养殖场都采用冲水进行猪舍清洁，因此猪场废水猪尿与粪便等相互混杂，废水中氨态氮含量、磷含量、悬浮物以及有机物浓度高且碳氮比严重失衡，如果不经过处理的大量排放对湖泊、河流、农田等环境当中对导致水体富养化、土壤性质改变等一些列污染问题。
3.现如今国内外的养猪废水处理技术主要集中于三大类方式分别为物化处理技术、自然处理技术以及生物处理技术。其中物化处理法使用较多的方法是介质吸附法、絮凝沉淀法等，如钱峰等利用沸石-稻草组合进行猪尿废水过滤，cod、氨态氮以及磷的去除率分别能达到47.9％、72.9％以及50.1％(钱锋，2008)，像崔丽娜等人通过磁絮凝法能够对cod浓度为3232mg/l的养猪废水去除61.02％(崔丽娜，2010)。尽管物化法对猪尿废水有较好的污染物去除率，但其对猪尿废液污染去除广谱性较低、去除污染物成本较高、处理设备投入较大、工程应用较少等弱势。而自然处理法一般是利用天然的土壤、水体以及生物进行综合作用来进行污染物的去除，像是朱夕珍等通过高炉渣和石英砂等基质进行人工湿地构建对cod、bod、磷的去除率分别达到71％-88％、80％-89％、70％-85％(朱夕珍，2003)，以及鲁秀国等利用氧化塘处理养猪废水cod≤400mg/l、氨态氮≤70mg/l(鲁秀国，2009)。自然处理法对污染废水的去污能力也较为不错，但稳定性不足，并且净化时间较长。生物处理技术则是一种运用微生物的催化作用来处理高浓度有机废水的新型方法，像是梁美东等使用srb反应器进行曝气处理养猪废水能够将cod的去除率增加至90％以上(梁美东，2009)，李锋民等采用好氧-厌氧联合处理法能够使氨态氮和总氮的去除率达到99.7％与50.7％(李锋民，2011)。但是通过生物处理法对废水进行处理的过程中会产生大量的活性污泥无法进行处理对环境造成二次污染。
4.尽管养猪废水对环境造成了巨大的压力，但是其本身含有大量有机质，氮、磷、钾等营养元素。在2010年的第一次中国污染普查公告中明确指出，总氮和总磷为畜禽养殖工业最首要的污染排放物，其排放量分别是102.48万吨和16.04万吨，在全国水污染总氮、总磷排放组成中分别占21.7％和37.9％。由此可见，禽畜所产生的粪便及废水确实是十分重要的资源，资源化利用潜力巨大。如果以养猪废水作为基础培养基进行有益微生物发酵生
产即可大大降低微生物菌肥的生产成本又可通过生物降解减轻污染问题，这样就能使废水变废为宝，实现其剩余价值。
5.因此，本发明以养猪废水作为天然筛选培养基筛选到能够利用废水的有益菌株bacillus subtilis sc(cctcc no：m 20211546)，并对其生物量、营养成分的利用情况污染物降解情况进行了研究，以期为养猪废水无害化资源利用提供技术支撑。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供一种可用于处理养猪废水的微生物菌株；
7.本发明的目的之二在于提供一种处理养猪废水的方法。
8.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
9.本发明将不同种类的有益微生物接种于养猪废水用以筛选得到在养猪废水中生长且繁殖速度较快的菌种枯草芽孢杆菌菌株(bacillus subtilis)sc株(cctcc no：m 20211546)，并检测其对养猪废水中营养成分的利用情况，以及对养猪废水中污染物的降解情况，结果发现枯草芽孢杆菌sc株能在原始养猪废水中进行生长且生物量较高，使用优化培养基接种sc后生物量提升显著，最高活菌数为4.16
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cfu/ml。sc菌株在优化碳氮比的养猪废水培养基中进行发酵对cod、氨态氮具有较好的去除率，cod去除率为81.25％、氨态氮去除率为89.98％，对养猪废水中的磷去除能力较弱，去除率仅为17.39％，且能够有效调节原始养猪废水的ph值，降低了发酵废液对环境污染的可能性，更好的提升了养猪废水的资源化利用。
10.在上述研究的基础上，本发明首先提出了一株可用于处理养猪废水的枯草芽孢杆菌菌株(bacillus subtilis)，命名为bacillus subtilis sc，分类命名分别为bacillus subtilis sc，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在中国.武汉.武汉大学，其菌种保藏编号为cctcc no：m 20211546，保藏时间为2021年12月6日。
11.进一步的，本发明还提出了所述的枯草芽孢杆菌菌株在处理养猪废水中的应用。
12.其中，优选的，将所述的枯草芽孢杆菌菌株的种子液接种于已灭菌的待处理养猪废水中，经过发酵即可获得处理后养猪废水，经处理后的养猪废水相较于处理前污染物含量有所下降。
13.其中，优选的，还包括向已灭菌的待处理养猪废水中加入红糖的步骤，使得养猪废水的碳氮比为16-20：1。
14.其中，优选的，所述的发酵是指于30℃，120r/min下发酵培养24-96h。
15.其中，优选的，经处理后的养猪废水相较于处理前总氮、总碳、总有机碳、cod、氨态氮、磷的含量均有所下降。
16.更进一步的，本发明还提出了一种处理养猪废水的方法，包括以下步骤：
17.(1)将所述的枯草芽孢杆菌菌株sc接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行活化，将活化后菌株sc复接于牛肉膏蛋白胨培养基中然后使用无菌水将菌株浓度调节为od
600
＝1.0作为种子液；
18.(2)将种子液接种于已灭菌的待处理养猪废水中，经过发酵即可获得处理后养猪废水，经处理后的养猪废水相较于处理前污染物含量有所下降。
19.其中，优选的，步骤(2)中还包括向已灭菌的待处理养猪废水中加入红糖的步骤，
使得养猪废水的碳氮比为16-20：1。
20.其中，优选的，步骤(2)中是将种子液按1-2vol％的接种量接种于已灭菌的待处理养猪废水中；所述的发酵是指于30℃，120r/min下发酵培养24-96h。
21.其中，优选的，经处理后的养猪废水相较于处理前总氮、总碳、总有机碳、cod、氨态氮、磷的含量均有所下降。
22.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
23.本发明以有益微生物实现养猪废水资源化利用，这一技术是以生物处理法作为基础，其核心是利用微生物好氧-厌氧联合处理法对养猪废水进行污染物去除，并且开创性的利用养猪废水中的丰富营养实现有益微生物的大量繁殖用以获取有益微生物菌体进行微生物菌剂的制作，在去除污染物保护环境的同时创造经济价值。本发明是以养猪废水作为天然培养基对微生物进行培养，之所以选用养猪废水是因为其含有的大量有机物、碳源、氮源等营养物质能够为微生物生长提供充足的养分是微生物培养的天然温床，并且在微生物生长过程中能够将养猪废水中对环境有害的物质进行吸收、转化、固定用于菌体自身的增殖以及代谢产物的分泌，这样一方面降低了养猪废水中对环境安全造成威胁污染源像氨态氮、有机物、磷等另一方面通过养猪废水培养的大量微生物菌体可以进行收集用于植物促生、作物生防、污染物降解等多方面的微生物制剂，一举两得，并且微生物在培养过程中其培养基的成本较高是造成微生物菌剂价格居高不下的主要原因之一，而使用养猪废水对有益微生物菌株进行培养在活菌数上与传统培养基接近，但成本上大幅度下降，对推广微生物菌剂达到农药化肥的减用少用实现绿色农业具有重要意义。
24.本发明对养猪废水进行碳氮比优化调节后接种有益微生物，通过筛选最终得到1种在养猪废水中生长且繁殖速度较快的菌种枯草芽孢杆菌菌株(bacillus subtilis)sc株(cctcc no：m 20211546)，枯草芽孢杆菌sc株能在原始养猪废水中进行生长且生物量较高，使用优化培养基接种sc后生物量提升显著，最高活菌数为4.16
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cfu/ml。sc菌株在优化碳氮比的养猪废水培养基中进行发酵对cod、氨态氮具有较好的去除率，cod去除率为81.25％、氨态氮去除率为89.98％，对养猪废水中的磷去除能力较弱，去除率仅为17.39％，且能够有效调节原始养猪废水的ph值，降低了发酵废液对环境污染的可能性，更好的提升了养猪废水的资源化利用。
25.由此证明“有益微生物实现养猪废水资源化利用”技术对养猪废水的去污能力不弱于国内外主流的物化处理技术、自然处理技术以及传统生物处理技术达到的效果甚至更好并且对养猪废水中的污染物去除的种类更全面具有较高的广谱性；通过微生物发酵来进行养猪废水处理在去污成本上更为低廉，设备投入资金少，无需大量场地，去污周期短，能靠近源头快速搭建小型发酵设备进行养猪废水处理，小型企业也同样可以负担体系构建成本；使用有益微生物进行发酵在对养猪废水进行处理的同时还能收获有益微生物菌株用于微生物菌剂的生产使用，在养猪废水处理过程中不但降低了污染物对环境的破坏还会回报以经济利益并且还能够促进微生物菌剂推广加快绿色农业的发展，开创一种生态保护-农业发展的良性循环体系，符合我国可持续发展战略大方向。
附图说明
26.图1为sc菌株在原始与优化碳氮比后的养猪废水中生物量随时间的变化；
27.图2为经sc处理后原始(b)与优化后养猪废水(c)总氮含量变化及下降率(a)比较；
28.图3为经sc处理后原始(b)与优化后养猪废水(c)总碳含量变化及下降率(a)比较；
29.图4为经sc处理后原始(b)与优化后养猪废水(c)总有机碳含量变化及下降率(a)比较；
30.图5为sc发酵液上清液中总氮、总碳、总有机碳的下降率比较；
31.图6为sc在优化培养基中随发酵时间的ph与cod的变化趋势；
32.图7为sc对氨态氮与磷含量的去除率。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1菌株的筛选及其在养猪废水处理中的应用
35.1材料与方法
36.1.1供试材料来源
37.试验所用菌株均为课题组分离筛选得到的不同种类的纯培养有益微生物，经研究发现各菌种均为在植物促生、生物防治、污染物防治等方面具有较好工业化应用潜力高效菌种，于-80℃冰箱中保存待用，所有菌株均经过菌株形态与16srdna分类鉴定，分别为wzw03(plantibacter sp.)、lzn01(bacillus amyloliquefaciens)、wa(bacillus velezensis)、wc(bacillus methylotrophilus)、wb(bacillus velezensis)、jdy(bacillus mucilaginosus)、cl01(sphingomonas sp.)、sc(bacillus subtilis)。养猪废水均取自齐齐哈尔市富拉尔基区某养猪场，采集后的养猪废水存放于4℃条件下进行保存以待后续实验，养猪废水基本特性为总氮403.2mg/l、总碳981.6mg/l、总有机碳361.9mg/l、磷含量48.66mg/l、氨态氮315.98mg/l、ph 8.85。
38.1.2培养基
39.牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10.00g，牛肉膏3.00g，nacl 5.00g，琼脂20.00g，蒸馏水定容至1000.00ml，液体培养基不加琼脂。
40.原始养猪废水培养基：猪场的运输来的养猪废水。
41.优化碳氮比后的养猪废水培养基：红糖10g，养猪废水定容至1000.00ml使得养猪废水的碳氮比为16-20：1。
42.1.3养猪废水高效降解菌株初筛
43.将保藏菌株接种至牛肉膏蛋白胨培养基，进行活化，将活化后的菌种再次接入牛肉膏蛋白胨培养基中，将培养到相同浓度(od600＝1.0)的各菌株作为种子液用于养猪废水的处理试验。为了筛选能够在养猪废水中大量生长的菌株，将不同菌株的种子液按1vol％接种量分别接种于装有100ml已灭菌养猪废水的三角瓶中，于30℃，120r/min摇瓶培养，每24h对发酵液进行取样，检测各个时间段的活菌数确定菌株最大活菌量。活菌数通过稀释涂布法进行确定，取发酵后的培养基10ml，放入90ml装有玻璃珠和无菌水三角瓶中，于200r/min的摇床中震荡30min后进行梯度稀释，选择适当的稀释浓度取0.1ml稀释液涂布于牛肉
膏蛋白胨培养基固体平板上，在30℃培养24h，计算活菌数(cfu/ml)，设三组平行。而后挑选发酵生物量较高的菌种进行后续实验。
44.1.4筛选菌种对养猪废水资源化利用效果探究
45.1.4.1各筛选菌种在原废水与优化碳氮比后的养猪废水培养基中的随时间生长情况及处理效果的变化
46.由于养猪废水原液中碳氮比值较小可能会抑制菌体生长繁殖降低养猪废水的处理效果，因此对养猪废水培养基进行适当的碳氮比优化，检测能否提升菌体含量并加强对养猪废水的处理能力。将筛选后得到的优势菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基制作种子液，按2vol％的接种量分别接种于300ml的原始养猪废水培养基以及优化碳氮比后的养猪废水培养基中，在于30℃，120r/min摇瓶培养，每24h对样品进行取样测定各项指标。
47.1.4.2经筛选菌株处理的优化碳氮比养猪废水离心后的处理效果
48.为模拟工业化生产过程中在获取菌体之后经各菌种处理的养猪废液是否能够进一步的降低环境威胁潜力，本实验通过对不同发酵时间的样液离心后进行指标检测。将筛选菌种的种子液接种于优化碳氮比后的养猪废水中，在于30℃，120r/min摇瓶培养，每24h对样品进行取样，并在12000rpm的条件下离心5min，而后进行指标测定。
49.1.5试验测定指标
50.样品测定指标包括cod、ph、总氮、总碳、总有机碳、氨态氮、磷含量以及生物量的测定。
51.2.结果与讨论
52.2.1养猪废水处理菌株筛选及其在原始与优化碳氮比后的养猪废水培养基中随时间的生长情况
53.通过检测养猪废水中各菌种活菌数最大含量以达到对不同菌株进行筛选的目的，通过使用养猪废水对各有益菌株进行培养发现sc株能够在养猪废水中进行生长且具有较高的生物量，最大活菌数为1.88
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cfu/ml。为确定sc株在不同培养基中生物量的大小，分别接种于原始以及优化碳氮比后的养猪废水培养基中通过梯度稀释涂板法进行活菌数测定。由图1可知sc菌株在原始培养基中生物量为1.88
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cfu/ml，在优化碳氮比后的养猪废水培养基中与其相比生物量提升了54.81％，达到4.16
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cfu/ml的活菌数。因此添加红糖进行碳氮比优化能够显著提升各菌株在养猪废水中的生物量，提高有益微生物的菌体获取。
54.将筛选得到的一株可用于处理养猪废水的枯草芽孢杆菌菌株(bacillus subtilis)，命名为bacillus subtilis sc，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在中国.武汉.武汉大学，其菌种保藏编号为cctcc no：m 20211546，保藏时间为2021年12月6日。
55.2.2sc株在原始与优化碳氮比后的养猪废水培养基中生长其发酵液总氮、总碳和总有机碳的变化情况
56.2.2.1sc株在原始与优化后养猪废水培养基中总氮的改变
57.将sc株分别接种于原始养猪废水培养基与优化碳氮比后的养猪废水培养基，每24h对发酵液进行总氮测定。由图2可知，在原始养猪废水接种sc菌株后发酵液总氮的含量随着菌株发酵时间的增加普遍呈现不断下降趋势，在培养96h时sc株发酵液的总氮含量均下降到最低值为262.1mg/l，相较于对照组而言总氮含量下降了34.99％。当对养猪废水进
行碳氮比调节优化后sc株发酵液同样随着发酵时间的延长总氮含量呈现总体下降的趋势，并且在0-24h的发酵区间内总氮含量快速下降，而后趋于平缓，sc株培养96h后总氮含量达到最小值136.3mg/l，相较于对照组sc株总氮下降了59.19％。通过比较可以发现sc株在优化后的养猪废水中生长其发酵液总氮的下降率显著高于原始养猪废水。
58.2.2.2原始与优化碳氮比后的养猪废水培养基中总碳处理情况比较
59.将sc株分别接种于原始养猪废水培养基与优化碳氮比后的养猪废水培养基，每24h对发酵液进行总碳测定。如图3所示，sc菌株接种于原始养猪废水培养基后，发酵液中总碳的含量随着培养时间的增加呈现缓慢下降而后趋于稳定的趋势，sc株发酵液总碳含量下降到的最低值为691mg/l，相较于对照组而言，筛选菌株sc株发酵液的总碳下降率为29.60％。将筛选菌株接种于优化碳氮比后的养猪废水培养基后，其发酵液中总碳的含量随着培养时间的提升不断下降且速度较快最终趋于缓慢下降，培养96h后发酵液总碳含量达到最小值sc＝2010mg/l，总碳下降率相较于对照组而言降低了60.97％。sc株在优化后的培养基中培养，其发酵液中总碳含量下降率相较于在原始养猪废水中的总碳下降率显著提高。
60.2.2.3原始与优化碳氮比后的养猪废水培养基发酵液中总有机碳处理情况比较
61.由图4可知，接种sc菌株后，原始养猪废水发酵液中的总有机碳含量随着菌体培养时间的增加呈现先增加后减少的趋势，相较于对照组而言sc株发酵后的总有机碳最低值含量为367.4mg/l，总有机碳下降率为-1.52％，出现了一定幅度的增长，而将sc株接种于优化碳氮比后的养猪废水培养基中，发酵液总有机碳含量随培养时间延长不断下降在96h时达到最小值，相较于对照组sc株下降率达到69.89％，相比于原始养猪废水培养基而言优化后的培养基对总有机碳的消耗量以及消耗速度更为迅速。
62.2.3经sc株处理的养猪废水去除菌体后发酵废液各指标的变化
63.通过比较发现对sc菌株在优化碳氮比后的养猪废水培养基中能够更好的生长繁殖，因此选择优化碳氮比后的养猪废水培养基作为有益微生物工业化发酵的基础培养基，同时为了模拟在工业生产过程中sc株在养猪废水中发酵并收获菌体后能否更好的降低其滤出的发酵废液对环境的潜在威胁，因此本试验通过高速离心法对菌株发酵液中的菌体进行去除并测定上清液中总氮、总碳、总有机碳、cod、氨态氮、磷的变化情况。
64.2.3.1sc株在优化碳氮比后的养猪废水培养基中总氮、总碳以及总有机碳含量的变化
65.将sc株接种于优化碳氮比后的养猪废水培养基中每24h对离心后的上清液进行总氮、总碳和总有机碳测定。由图5可知，相较于对照组而言离心后的sc株发酵液上清液中总氮含量下降了94.23％，总碳含量降低了78.64％，而总有机碳的含量降低了77.84％，这表明sc菌株能较好的利用养猪废水中的营养成分进行自身的生长繁殖与代谢活动，防止滤出的发酵废液富营养造成环境污染。
66.2.3.2sc株在优化碳氮比后的养猪废水培养基中ph及cod变化情况
67.对sc株发酵液每24h进行ph测定，由图6可知养猪废水经过sc菌株发酵96h后其ph由原始ph＝8.85的碱性溶液降低为ph＝6.31的酸性发酵液，对预防废水排放造成土壤盐碱化，破坏土壤结构具有重要意义。为确定筛选菌株对养猪废水cod去除效果，对sc株发酵液上清液进行cod检测，由图6可知随着菌株发酵时间的不断增加，其cod含量不断快速下降，
最大cod去除率达到81.25％，说明sc株对cod具有较好的去除率，减少滤出废液对环境的威胁。
68.2.3.3sc株在优化碳氮比后的养猪废水培养基中氨态氮以及磷的去除率
69.对sc株不同发酵时间的发酵液上清液进行氨态氮含量测定，由图7可知sc菌株能显著降低发酵废液中氨态氮的含量，对氨态氮的去除率达到89.98％，对氨态氮去除效果良好。同样对发酵液上清液进行磷含量测定发现相较于对照组sc株对磷的去除率可达到17.39％，具有异性去磷效果。
70.3结论
71.sc株能在原始养猪废水中进行生长且生物量较高，使用优化培养基接种sc株后生物量提升显著，最高活菌数为4.16
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cfu/ml。sc株菌株在优化碳氮比的养猪废水培养基中进行发酵对cod、氨态氮具有较好的去除率，cod去除率为81.25％、氨态氮去除率为89.98％，对养猪废水中的磷去除能力较弱，去除率仅为17.39％，能够有效调节原始养猪废水的ph值，降低了发酵废液对环境污染的可能性，更好的提升了养猪废水的资源化利用水平。