用于预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌组合物及其应用

1.本发明属于益生菌技术领域，特别涉及一种用于预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌组合物以及该益生菌组合物在制备预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌产品中的应用。


背景技术：

2.目前肥胖症患病率在全球范围内持续上升，世界卫生组织（who）将肥胖定义为可能导致健康损害的异常或过多脂肪的堆积，与ii型糖尿病、高血压高血脂、心血管疾病、肝硬化等疾病密切相关。肥胖的形成受到多方面因素影响，包括遗传因素、激素的使用、饮食、运动等环境因素，近年来，越来越多的研究证实，肥胖的发生与宿主肠道菌群有着密不可分的关系。已有研究发现，肥胖患者与健康人的肠道菌群存在很大的差异，肥胖患者肠道内比正常人有更高丰度的肠杆菌（enterobacter）和拟杆菌属（bacteroides），而双歧杆菌属（bifidobacterium）、颤藻属（oscillospira）、欧文氏菌（erwinia）、琥珀酸弧菌属（succinivibrio）和阿利培斯属（alistipes）的丰度明显下降。通过饮食干预或其他手段改变患者肠道菌群的组成和功能从而改善肥胖及其相关代谢疾病是最近年来提出来的有效治疗肥胖的重要手段。
3.2020年6月，pendulum推出首款降血糖益生菌产品——pendulum glucose control（pgc）。pgc包含akkermansia muciniphila wb-str-0001（简称akk菌）、eubacterium hallii wb-str-0008（霍氏真杆菌）、clostridium butyricum wb-str-0006（酪酸梭菌）、clostridium beijerinckii wb-str-0005（拜氏梭菌）、bifidobacterium infantis 100（婴儿双岐杆菌）5种菌株和菊粉1种益生元，在一项随机的、双盲的安慰剂对照研究中。与安慰剂相比，ii型糖尿病患者在服用pgc 12周后，a1c下降0.6%，血糖峰值（auc）下降32.5%。
4.越来越多的研究证明，肠道益生菌能够通过改变肠道菌组成、加强肠道屏障、调节肠道免疫等多个方式明显改善肥胖、糖尿病等代谢性疾病。例如，pgc益生菌组合能够很好的为人体补充患者体内缺失菌株，还原人类肠道健康的微生态环境。但人群肠道菌群受到地域、人种、环境等多方面因素会有较大差异，国外的益生菌产品并不一定适用于中国居民。
5.本发明致力于开发适合于中国人群的，能够在预防和/或治疗代谢类疾病过程中发挥作用的功能益生菌。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明有必要提供一种用于预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌组合物，该益生菌组合物包括功能益生菌，涉及一种或两种以上的双歧杆菌。以指定功能益生菌作为活性成分，其在预防和/或治疗代谢类疾病中具有明显效果，对肥胖具有明显改善作用，并可改善葡萄糖耐受和胰岛素敏感性，降低血清中总胆固醇，降低血清中的甘油三酯等
肥胖生理指标。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种用于预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌组合物，包括（1）-（5）所述的菌株中的任意一种或两种以上的组合：（1）第一粪双岐杆菌（bifidobacterium faecalis），保藏编号为cctcc m 2022037；（2）第二粪双岐杆菌（bifidobacterium faecalis），保藏编号为cctcc m 2022038；（3）长双歧杆菌（bifidobacterium longum），保藏编号为cctcc m 2022039；（4）假链双歧杆菌（bifidobacterium pseudochain），保藏编号为cctcc m 2022040；（5）两歧双歧杆菌（bifidobacterium bifidum），保藏编号为cctcc m 2022041；或与（1）-（5）所述的任意一种菌株具有至少98%的基因组序列同一性，或与（1）-（5）所述的任意一种菌株具有至少95%的16s rrna同一性的细菌菌株中的至少一种。
8.进一步方案，所述益生菌组合物中，所述第一粪双岐杆菌、第二粪双岐杆菌、长双歧杆菌、假链双歧杆菌、两歧双歧杆菌的菌体数比为(1-10)：(1-10)：(1-10)：(1-10)：(1-10)。
9.进一步方案，所述益生菌组合物还包括益生元成分。
10.本发明进一步提供了一种如前述任一项所述的益生菌组合物在制备用于预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌产品中的应用。
11.进一步方案，所述代谢类疾病包括肥胖或ii型糖尿病。
12.进一步方案，所述益生菌产品包括食品、饮料、保健品或药物。
13.本发明进一步提供了一种预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌产品，其包括如前述任一项所述的益生菌组合物以及食品、保健品、饮料或药学上可接受的载体、辅料或添加剂。
14.进一步方案，所述益生菌产品为胶囊、片剂、颗粒剂、悬剂、粉剂或稀释剂。
15.进一步方案，所述益生菌产品中，菌体浓度为10
8-10
11 cfu。
16.本发明具有以下有益效果：本发明益生菌组合物中涉及的细菌菌株是从健康人体肠道分离获得的，安全性高。
17.该益生菌组合物能够在肠道内定植，从而能够长期发挥功能。
18.此外，实验结果表明，该益生菌组合物对于肥胖的治疗效果好，并能够改善葡萄糖耐受和胰岛素敏感性，降低血清中总胆固醇，降低血清中的甘油三酯等肥胖生理指标，在预防和/或治疗代谢类疾病中具有优异的效果。
19.生物保藏说明粪双岐杆菌 zhulab-2（bifidobacterium faecalis zhulab-2），菌株编号为cctcc m 2022037，保藏时间为2022年1月10日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，具体地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，生物保藏编号为cctcc m 2022037；粪双岐杆菌 zhulab-3（bifidobacterium faecalis zhulab-3），菌株编号为
cctcc m 2022038，保藏时间为2022年1月10日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，具体地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，生物保藏编号为cctcc m 2022038；长双歧杆菌 zhulab-4（bifidobacterium longum zhulab-4），菌株编号为cctcc m 2022039，保藏时间为2022年1月10日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，具体地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，生物保藏编号为cctcc m 2022039；假链双歧杆菌 zhulab-5（bifidobacterium pseudochain zhulab-5），菌株编号为cctcc m 2022040，保藏时间为2022年1月10日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，具体地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，生物保藏编号为cctcc m 2022040；两歧双歧杆菌 zhulab-6（bifidobacterium bifidum zhulab-6），菌株编号为cctcc m 2022041，保藏时间为2022年1月10日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，具体地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，生物保藏编号为cctcc m 2022041。
附图说明
20.图1为实施例4中小鼠体重变化趋势图，图中*：p《0.05，**：p《0.05；图2为实施例4中小鼠在葡萄糖耐受测试中血糖变化情况，图中*：p《0.05，**：p《0.05；图3为实施例4中小鼠在胰岛素敏感测试中血糖变化情况，图中*：p《0.05；图4为实施例5中已肥胖小鼠的体重变化趋势图，图中*：p《0.05，**：p《0.05，***：p《0.005；图5为实施例5中已肥胖小鼠在葡萄糖耐受测试中血糖变化情况，图中*：p《0.05，**：p《0.05；图6为实施例5中已肥胖小鼠在胰岛素敏感测试中血糖变化情况；图7为实施例5中已肥胖小鼠在实验终点时血清中甘油三酯的含量；图8为实施例5中已肥胖小鼠在实验终点时血清中总胆固醇的含量。
具体实施方式
21.为了便于理解本发明，下面将结合具体的实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
22.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
23.本发明第一方面提供了一种用于预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌组合物，其含有特定的功能益生菌，具体的说，根据本发明的实施例，所述的功能益生菌可以是（1）-（5）所述的菌株中的任意一种或两种以上的组合：（1）第一粪双岐杆菌（bifidobacterium faecalis），实验室编号为zhulab-002，保藏编号为cctcc m 2022037，其16sdna序列如seq id no.1所示；（2）第二粪双岐杆菌（bifidobacterium faecalis），实验室编号为zhulab-003，保藏编号为cctcc m 2022038，其16sdna序列如seq id no.2所示；
（3）长双歧杆菌（bifidobacterium longum），实验室编号为zhulab-004，保藏编号为cctcc m 2022039，其16sdna序列如seq id no.3所示；（4）假链双歧杆菌（bifidobacterium pseudochain），实验室编号为zhulab-005，保藏编号为cctcc m 2022040，其16sdna序列如seq id no.4所示；（5）两歧双歧杆菌（bifidobacterium bifidum），实验室编号为zhulab-006，保藏编号为cctcc m 2022041，其16sdna序列如seq id no.5所示。
24.在本发明的另外的实施例中，所述的功能益生菌可以是与（1）-（5）所述的任意一种菌株具有至少98%的基因组序列同一性的细菌菌株中的至少一种，比如基因组序列同一性可以是98%、98.5%、99%、99.5%或100%，优选基因组序列同一性在99%以上；所述的功能益生菌也可以是与（1）-（5）所述的任意一种菌株具有至少95%的16s rrna同一性的细菌菌株中的至少一种，比如16s rrna同一性可以是95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%，优选16s rrna同一性在97%以上。需要说明的是，本文中所述的基因组序列同一性或16s rrna同一性的比对方式在本领域中是公知的，这里不再具体阐述。
25.可以理解的是，本文中所述的用于预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌组合物中的功能益生菌可以是以上所述的任意一种菌株，也可以是以上任意两种以上的菌株以任意菌体比的组合。
26.本文中所述的“益生菌”意指具有特异性的微生物，当该微生物被吞咽或应用足够数量时，能够在使用者中诱导出对宿主的健康状况特异性的功能和有益影响。目前应用较多的益生菌主要包括乳杆菌属以及双歧杆菌属，其中双歧杆菌属（bifidobacterium）为双歧杆菌目双歧杆菌科的一属革兰氏阳性菌，本文中涉及的即为双歧杆菌属的多种双歧杆菌，本文通过从健康的人体肠道中分离出上述功能益生菌，具体的说，以健康志愿者的粪便作为样品，经过分离培养后，通过pcr扩增技术，结合16s rrna测序分析确定种属，并最终经过体外筛选，获得上述功能益生菌。本发明通过将上述功能益生菌作为活性成分形成益生菌组合物，协调益生菌微生物之间的作用，在预防和/或治疗代谢类疾病中取得明显的效果。
27.优选的，本发明的一些具体的实施例中，益生菌组合物中的功能益生菌由上述五种益生菌按照任意菌体数比进行混合得到，进一步优选的，所述第一粪双岐杆菌、第二粪双岐杆菌、长双歧杆菌、假链双歧杆菌、两歧双歧杆菌的菌体数比为（1-10）：（1-10）：（1-10）：（1-10）：（1-10），更优选的，所述第一粪双岐杆菌、第二粪双岐杆菌、长双歧杆菌、假链双歧杆菌、两歧双歧杆菌的菌体数比为1：1：1：1：1。
28.进一步方案，所述益生菌组合物还包括益生元成分，本文中“益生元”意指饮食物质或成分（如纤维等），既不会被机体消化也不会被机体吸收，当其完整到达结肠时，选择性刺激对个体健康有益的菌群的生长和活性。在本发明的一些具体的实施方式中，所述益生元优选为不被机体消化和吸收的碳水化合物，具体可提及的实例包括但不限于低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻等，此外，还可以为多糖（如云芝多糖，胡萝含氮多糖等）、蛋白质水解物（如酪蛋白的水解物，α-乳清蛋白，乳铁蛋白等）以及天然植物中的蔬菜、中草药、野生植物等，更优选的为菌粉或多聚木糖。可以理解的是，益生元成分本领域技术人员可根据实际情况进行选择，故这里不再具体阐述。
29.本发明第二方面提供了如本发明第一方面所述的益生菌组合物在制备用于预防
和/或治疗代谢类疾病的益生菌产品中的应用。
30.其中，本文中所述的“代谢类疾病”主要包括：（i）肥胖及肥胖相关病症（ii）ii型糖尿病。
31.本文中所述的“益生菌产品”意指以本发明第一方面所述的益生菌组合物作为活性成分的，具体包括但不限于食品、饮料、保健品、药物等形式的产品。
32.本发明第三方面在上述基础上提供了一种预防和/或治疗代谢类疾病的益生菌产品，其包括如本发明第一方面所述的益生菌组合物以及食品、保健品、饮料或药学上可接受的载体、辅料或添加剂，本文中所述的“载体”、“辅料”或“添加剂”根据益生菌产品的不同而有所区别，均可采用本领域中常规选择，故这里不再具体阐述。
33.在本发明的一些具体的实施方案中，益生菌产品可以为制剂，将益生菌组合物与合适的赋形剂混合制成，所述的赋形剂可以为制剂或药物领域中常用的如分散剂、增甜剂、稳定剂、防腐剂等，如一些氨基酸、维生素或酶等。
34.本发明的益生菌产品可以为口服的胶囊、悬剂、片剂、颗粒剂或粉剂；可以制成具有包衣的、胶囊包封的或微胶囊包封的形式，以便耐胃蚀；还可以制成缓释形式，以便在肠道，特别是在结肠内选择性释放活性成分；此外，在本发明的一些优选的实施方案中，也可以将上述功能益生菌与合适的赋形剂使用常用于药物和/或食品组合物冻干处理的技术和设备进行混合冻干等等，由于益生菌产品的制备均可采用本领域中常规手段进行，这里不再具体阐述。
35.进一步的，具体的应用剂量可根据实际情况进行调整，在本发明的一些优选的实施方式中，所述益生菌产品中，总的菌体浓度为1
×
10
8-1
×
10
11
cfu；更优选的，菌体浓度为1
×
109或1
×
10
10
cfu。
36.下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。
37.实施例1 功能菌的分离取10名健康志愿者粪便样品，用20%体积分数的甘油磷酸盐缓冲液保存，对粪便样品分别梯度稀释至10-5
、10-6
、10-7
；将各浓度涂布于mrs肉汤培养基上（solarbio m8540），37℃，厌氧培养48小时；挑取单克隆至mrs肉汤液体培养基中进行培养，通过16srna通用引物进行pcr扩增（上游引物27f：agagtttg atcctggctcag，下游引物1492r：ggtta ccttgttacgactt）；扩增产物送测序，通过16s rna序列比对确定种属，用甘油-80℃进行菌种保存；从分离出来的菌种中选取双歧杆菌进行体外筛选，最终得到五株潜在的功能益生菌，分别编为粪双岐杆菌zhulab-002，粪双岐杆菌zhulab-003，长双歧杆菌zhulab-004，假链双歧杆菌zhulab-005，两歧双歧杆菌zhulab-006。
38.实施例2 功能菌的培养五种功能益生菌的培养方法一致，具体为：从-80℃冰箱取出冻存的实施例1中获得的功能益生菌，于mrs肉汤培养基中划线，37℃厌氧培养，直至有明显单克隆出现，挑取单克隆至12ml培养管中，进行mrs肉汤培养基液体培养，培养至测得od600值为1.0-2.0时，
3000rpm离心10分钟，收集细菌菌体。
39.实施例3 混合功能菌组合制剂的制备获得实施例2中培养的细菌菌体，分别取2
×
10
8 cfu的细菌悬液，3000rpm离心10分钟，去掉菌液上清，用200μl无菌磷酸盐缓冲液进行重悬，重悬后将五种菌按照菌体数比1：1：1：1：1的方式进行混合，3000rpm离心10分钟收集混合菌体；将1.2g菌粉和0.24g多聚木糖溶于20ml无菌水中，配置成含有益生元的无菌水；将离心后收集的混合菌体用含有益生元的无菌水重悬至200μl，制备成用做动物实验的混合功能菌组合制剂。
40.实施例4 验证混合功能菌组合制剂改善小鼠肥胖（1）将18只8-10周龄的spf级c57/b6j小鼠（集萃药康购入）分为三组，一组为对照组（6只）、一组为实验组1（6只）、一组为胰岛素（1iu/kg）阳性对照组（6只），适应环境后，从第0天，分别给予高脂食物（美迪森，md12033，60% fat kcal）喂养，同时通过灌胃的方式对对照组给予无菌水，对实验组1给予混合功能菌组合制剂，灌胃频率均为每两天一次，其中，灌胃混合功能菌制剂数量为1
×
10
9 cfu。
41.每周对其体重进行监测，以初始体重作为100%，每周相对体重=实时体重/初始体重
×
100%，使用相对体重绘制体重曲线。结果如图1中所示的，实验结果显示，实验组1小鼠的体重增长速度对比对照组有明显的下降，证实混合功能菌组合制剂能明显控制小鼠体重增长。
42.（2）在第10周进行小鼠的葡萄糖耐受测定。具体地，小鼠过夜禁食（12-16小时），称量小鼠体重，按照1.5g/kg的剂量计算小鼠所需葡萄糖量，在0分钟时从小鼠尾巴取血，用血糖试纸检测小鼠空腹血糖值。小鼠静置30分钟后，按照编号顺序依次通过灌胃的方式给予每只小鼠对应的葡萄糖剂量。从小鼠灌胃时开始计时，在15分钟、30分钟、60分钟、90分钟后再次测量小鼠的血糖值，并绘制小鼠血糖变化值指示小鼠对葡萄糖的耐受程度。结果如图2中所示的，实验结果表明，给予混合功能菌组合制剂处理的实验组1小鼠的葡萄糖耐受明显优于对照组。
43.（3）在第12周进行胰岛素敏感测试。具体地，小鼠禁食3-4小时，称量小鼠体重，按照1u/kg的剂量计算小鼠所需胰岛素量，在0分钟时从小鼠尾巴取血，用血糖试纸检测小鼠空腹血糖值。小鼠静置30分钟后，按照编号顺序依次通过腹腔注射的方式给予每只小鼠对应的胰岛素。从小鼠接受胰岛素注射时开始计时，在15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟时再次测量小鼠的血糖值，并绘制小鼠血糖变化值指示小鼠对胰岛素的敏感性。结果如图3中所示的，实验结果表明，给予混合功能菌组合制剂处理的实验组1小鼠的胰岛素敏感度相对于对照组有一定程度的改善。
44.实施例5 验证混合功能菌组合制剂对已肥胖小鼠的作用将18只8-10周龄的spf级c57/b6j小鼠（集萃药康购入）分为三组，一组为对照组（6只）、一组为实验组1（6只）、一组为利拉鲁肽（0.02mg/kg）阳性对照组（6只），适应环境后，第-10周开始给予高脂食物（美迪森，md12033，60% fat kcal）喂养，至体重达到40g左右。在第0周通过灌胃的方式，对照组给予无菌水，实验组1给予合功能菌组合制剂，灌胃频率为每两天一次，其中，实验组1灌胃混合功能菌组合制剂数量为1
×
10
9 cfu。每周对其体重进行监测，计算和统计方式与实施例4一致，结果见图4。
45.在第15周进行小鼠的葡萄糖耐受测定，在第18周进行胰岛素敏感测试，方法与实施例4一致，结果见图5和图6。
46.在第20周进行甘油三酯和总胆固醇的测定，具体地，通过眼球取血得到小鼠血液500-600μl，静置30分钟后离心，取上层小鼠血清使用甘油三酯（tg）测试试剂盒（南京建成，a110-1-1）和总胆固醇（t-cho）测试试剂盒（南京建成，a111-1-1）进行测定，结果见图7和图8。
47.通过图4-8中的结果可以看出，灌胃混合功能菌组合制剂的实验组1小鼠体重增长得到了明显的缓解；实验组1的小鼠葡萄糖耐受明显优于对照组，且胰岛素敏感性得到了一定程度的改善；此外，实验组1小鼠血清中甘油三酯和总胆固醇含量比对照组有一定的降低。上述实验结果表明，混合功能菌组合制剂对已肥胖的小鼠仍具有治疗效果。
48.可以理解的是，以上实施例仅仅是为了使得本发明的技术方案和技术效果更加清楚做出的优选示例。本技术人同时还选取了实施例1中五种菌株中的一种、两种、三种或四种进行混合功能菌制剂的制备，并进行了实施例4-5中的验证实验，结果表明，其能够获得类似的技术效果，由于篇幅有限在此不再具体阐述。从而证明本发明中的益生菌组合物在预防和/或治疗代谢类疾病中具有明显效果，对肥胖具有明显改善作用，可改善葡萄糖耐受和胰岛素敏感性，降低血清中总胆固醇，降低血清中的甘油三酯等肥胖生理指标。
49.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。