高产苏氨酸菌株的构建方法与流程

本发明属于微生物工程，具体地说，涉及一种高产苏氨酸菌株的构建方法。

背景技术：

1、l-苏氨酸(l-threonin)，化学名称β-羟基-α-氨基丁酸，分子式c4h9no3，相对分子质量119.12。l-苏氨酸是一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等多个领域。

2、谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysc编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrb)以及苏氨酸合酶(thrc)编码。hermann sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷氨酸棒状杆菌的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因(reinscheid d j,eikmannsb j,sahm h.analysis of a corynebacterium glutamicum hom gene coding for afeedback-resistant homoserine dehydrogenase.[j].journal of bacteriology,1991,173(10):3228-3230)、lysc基因(eikmanns b j,eggeling l,sahm h.molecular aspectsof lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in corynebacteriumglutamicum.[j].antonie van leeuwenhoek,1993,64(2):145-163)。继hermann sahm之后，lothar eggling通过弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glya，同时过表达苏氨酸外运蛋白thre，使得苏氨酸的产量由49mm提高到67mm(simic p,willuhn j,sahm h,etal.identification of glya(encoding serine hydroxymethyltransferase)and itsuse together with the exporter thre to increase l-threonine accumulation bycorynebacterium glutamicum[j].applied and environmental microbiology,2002,68(7):3321-3327)。

3、目前利用谷氨酸棒状杆菌生产l-苏氨酸的报道主要集中在其合成路径中，支路失活、分解代谢失活与合成途径组合等方面的报道较少，且现有报道仅对l-苏氨酸合成路径做了初步研究，并未形成系统。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高产苏氨酸菌株的构建方法。

2、为了实现本发明目的，本发明通过加强苏氨酸合成路径同时降低与苏氨酸合成相关的竞争途径和/或分解代谢途径使菌株生产l-苏氨酸的能力得到提升。

3、第一方面，本发明提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其与苏氨酸合成途径相关的酶活性增强，且与苏氨酸合成相关的竞争途径和/或分解代谢途径相关的酶活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。

4、其中，与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶中的至少一种；

5、所述与苏氨酸合成相关的竞争途径和/或分解代谢途径相关的酶选自二氨基庚二酸脱氢酶、4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶、苏氨酸脱水酶、高丝氨酸-o-乙酰转移酶中的至少一种。

6、优选地，天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶、二氨基庚二酸脱氢酶、4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶、苏氨酸脱水酶、高丝氨酸-o-乙酰转移酶在ncbi上的参考序列编号分别为wp_011013497.1、wp_003855724.1、wp_011014964.1、wp_011015254.1、wp_011014792.1、wp_011014022.1、wp_003862033.1、wp_011013793.1，或与其相似性为90％的氨基酸序列。

7、优选地，酶的活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：

8、1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；

9、2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；

10、3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；

11、4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；

12、5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；

13、6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。

14、所述微生物体内与苏氨酸合成相关的竞争途径和/或分解代谢途径相关的酶活性降低或丧失是通过选自以下1)-5)，或任选的组合实现的：

15、1)通过改变所述酶的编码基因的启动子序列而降低或丧失；

16、2)通过改变所述酶的编码基因的核糖体结合位点而降低或丧失；

17、3)通过改变所述酶的氨基酸序列而降低或丧失；

18、4)通过改变编码所述酶的核苷酸序列而降低或丧失；

19、5)通过敲除所述酶的编码序列而丧失；

20、其中，与苏氨酸合成相关的竞争途径和/或分解代谢途径相关的基因选自ddh、dapa、tdcb、ilva、metx中的至少一种。

21、可以采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低与苏氨酸合成相关的竞争途径和/或分解代谢途径相关的基因的表达或敲除内源的与苏氨酸合成相关的竞争途径和/或分解代谢途径相关的基因。

22、所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶和苏氨酸合酶活性增强，且二氨基庚二酸脱氢酶、4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶、苏氨酸脱水酶和高丝氨酸-o-乙酰转移酶活性降低或丧失。

23、进一步地，天冬氨酸氨基转移酶活性的增强是通过在编码基因aspb起始密码子上游插入sod启动子来实现的。

24、进一步地，天冬氨酸激酶活性的增强是通过在编码基因lysc起始密码子上游插入sod启动子，并将lysc基因的起始密码子由gtg突变为atg、天冬氨酸激酶的第311位氨基酸由t突变为i来实现的。

25、进一步地，苏氨酸合酶活性的增强是通过在编码基因thrc起始密码子上游插入sod启动子，并将thrc基因起始密码子由gtg突变为atg实现的。

26、进一步地，二氨基庚二酸脱氢酶活性降低或丧失是通过敲除ddh基因来实现的。

27、进一步地，4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶活性降低或丧失是通过将dapa基因起始密码子由atg突变为gtg。

28、进一步地，苏氨酸脱水酶活性降低或丧失是通过敲除tdcb基因来实现的。

29、进一步地，苏氨酸脱水酶活性降低或丧失是通过敲除ilva基因来实现的。

30、进一步地，高丝氨酸-o-乙酰转移酶活性降低或丧失是通过敲除metx基因来实现的。

31、优选地，本发明所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括atcc13032、atcc13870、atcc13869、atcc21799、atcc21831、atcc14067、atcc13287等(参见ncbi corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌atcc 13032。

32、第二方面，本发明提供高产苏氨酸菌株的构建方法，所述方法包括：利用基因工程手段，增强具有氨基酸生产能力的棒杆菌中的与苏氨酸合成途径相关的基因，并失活或弱化与苏氨酸合成相关的竞争途径和/或分解代谢途径相关的基因；

33、其中，所述与苏氨酸合成途径相关的基因选自aspb、lysc、thrc中的至少一种；

34、所述与苏氨酸合成相关的竞争途径或分解代谢途径相关的基因选自ddh、dapa、tdcb、ilva、metx中的至少一种；

35、优选地，基因aspb、lysc、thrc、ddh、dapa、tdcb、ilva、metx在ncbi上的参考序列编号分别为cg0294、cg0306、cg2437、cg2900、cg2161、cg1116、cg2334、cg0754。

36、所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：

37、1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；

38、2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；

39、3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；

40、4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；

41、5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；

42、6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强；

43、本发明中，所述弱化选自以下1)-5)，或任选的组合实现的：

44、1)通过改变所述酶的编码基因的启动子序列而降低或丧失；

45、2)通过改变所述酶的编码基因的核糖体结合位点而降低或丧失；

46、3)通过改变所述酶的氨基酸序列而降低或丧失；

47、4)通过改变编码所述酶的核苷酸序列而降低或丧失；

48、5)通过敲除所述酶的编码序列而丧失。

49、弱化的方法可选自诱变、定点突变、同源重组等中的至少一种。

50、第三方面，本发明提供一种生产苏氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：

51、a)培养所述修饰的棒状杆菌属微生物，以获得所述微生物的培养物；

52、b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的苏氨酸。

53、优选地，本发明所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括atcc13032、atcc13870、atcc13869、atcc21799、atcc21831、atcc14067、atcc13287等(参见ncbi corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌atcc 13032。

54、第四方面，本发明提供所述修饰的棒状杆菌属微生物或按照上述方法构建得到的高产苏氨酸菌株在苏氨酸发酵生产或提高苏氨酸发酵产量中的应用。

55、上述有关菌株的改造方法包括基因的强化和弱化等均为本领域技术人员可知的改造方式，参见满在伟.高产l-精氨酸钝齿棒杆菌的系统途径工程改造[d].江南大学,2016；崔毅.代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产l-亮氨酸[d].天津科技大学.；徐国栋.l-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化.天津科技大学,2015.

56、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

57、本发明通过将棒杆菌(如谷氨酸棒状杆菌)天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶中的一种或多种表达加强，使菌株的l-苏氨酸产量有所提高；进一步地，将二氨基庚二酸脱氢酶失活，4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶弱化，且苏氨酸脱水酶tdcb、苏氨酸脱水酶ilva、高丝氨酸-o-乙酰转移酶中的一种或多种表达弱化或失活的菌株，l-苏氨酸产量有所提高，最终可达6.7g/l，从而为大规模生产苏氨酸提供有效手段，应用前景广阔。