一种抗沙丁胺醇和/或克伦特罗单克隆抗体和应用

1.本发明属于抗体技术领域，具体涉及一种抗沙丁胺醇和/或克伦特罗的单克隆抗体和应用。


背景技术：

2.沙丁胺醇(sal)和克伦特罗同属β-兴奋剂(β-agonist)，全称β-肾上腺素受体激动剂(β-adrenoceptor agonist)，是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类药物(phenethy lamines，peas)。β-兴奋剂能选择性地与细胞膜上的β-肾上素受体结合，起到调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌的功能，因此在临床上常用于人和动物哮喘类病症的治疗。当β-兴奋剂用量为临床用量的5-10倍时，能够增强体内脂肪分解代谢、增加蛋白质合成并减少脂肪组织，显著提高瘦肉率。最早被用于提高牲畜瘦肉率的β-兴奋剂是克伦特罗，但随着世界范围内对其禁用，沙丁胺醇成为克伦特罗最常用替代品。
3.β-兴奋剂残留会聚集在动物可食用组织中，一旦通过食物链进入人体，会对健康产生极大的危害，人体中毒后常表现为心跳过速、心率失常、肌肉震颤、头晕头痛、呕心呕吐、发热寒颤等症严重者甚至会导致死亡。
4.像其它环境污染物质一样，沙丁胺醇等β-兴奋剂虽然分子量小，但却会对人类健康造成巨大的潜在威胁，而且会以各种形式在人类不知情的情况下出现在环境中。此外，沙丁胺醇有可能通过动物排泄物和尿液进入生态环境，这会造成环境污染，并可能通过间接消费进入人体。沙丁胺醇在环境中作为污染物广泛存在，在某些水体环境例如泰晤士河中，沙丁胺醇的浓度高达0.47μg/l。同时，也有报道指出污水处理厂在去除水体中沙丁胺醇污染方面效果较差。因此，有必要建立一种适当的检测方法来监测环境中的沙丁胺醇。
5.β-兴奋剂残留的主要检测方法有色谱法、免疫分析法、毛细管电泳法及电化学法等。色谱法包括气相色谱法(gc)、高效液相色谱法(hplc)、气质联用法(gcms)、液质联用法(lc—ms)。免疫分析法包括酶联免疫法、胶体金免疫法、时间分辨免疫荧光测定等。其中，免疫分析方法最为快速、经济，但目前应用于免疫检测的抗体主要是多克隆抗体，其亲和力均较低限制了其在免疫检测中的应用。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供了一种抗沙丁胺醇和/或克伦特罗单克隆抗体和应用。本发明通过大量试验研究，包括噬菌体抗体库的筛选、抗沙丁胺醇和/或克伦特罗特异性抗体的纯化、抗沙丁胺醇和/或克伦特罗单克隆抗体的制备、表达及纯化，最终获得一种抗沙丁胺醇和/或克伦特罗单克隆抗体，该单克隆抗体具有高的亲和力和灵敏度，能够应用于沙丁胺醇和克伦特罗的快速免疫检测。
7.为实现本发明的上述目的，采用如下技术方案：
8.本发明提供一种抗抗沙丁胺醇和/或克伦特罗的单克隆抗体，所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no.3所示的氨基酸序列，或者是所述seq id no.3所
示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；
9.和重链可变区，所述重链可变区包含seq id no.4所示的氨基酸序列，或者是所述seq id no.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
10.优选地，所述轻链可变区包含如下互补区决定区：氨基酸序列为seq id no.5所示的lcdr1、seq id no.6所示的lcdr2和seq id no.7所示的lcdr3；
11.所述重链可变区包含如下互补区决定区：氨基酸序列为seq id no.8所示的hcdr1、seq id no.9所示的hcdr2和seq id no.10所示的hcdr3。
12.本发明目的还在于提供一种抗抗沙丁胺醇和/或克伦特罗的单克隆抗体，所述抗体包含轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区包含seq id no.11所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含seq id no.12所示的氨基酸序列。
13.本发明目的还在于提供一种dna分子，所述dna分子编码权利要求1或2所述单克隆抗体的轻链和/或重链。
14.优选地，所述dna分子编码轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述dna分子编码重链可变区的核苷酸序列如seq id no.2所示。
15.本发明目的还在于提供一种表达载体，所述表达载体包含所述的dna分子以及与所述dna分子操作相关的表达调控序列。
16.本发明目的还在于提供一种采用所述的dna分子或所述的表达载体转化或转染的宿主细胞。
17.本发明目的还在于提供一种所述的单克隆抗体在沙丁胺醇和/或克伦特罗检测中的应用。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
19.本发明提供的单克隆抗体对沙丁胺醇和克伦特罗具有良好的交叉反应率、高亲和力和高灵敏度，适用于沙丁胺醇和克伦特罗的快速免疫检测，将在沙丁胺醇和克伦特罗检测中发挥重大作用。
附图说明
20.图1为本发明实施例1制备的4d6抗体(即抗沙丁胺醇和/或克伦特罗单克隆抗体)的sds-page检测结果图，其中mw为蛋白质分子量marker；1为抗沙丁胺醇和/或克伦特罗单克隆抗体。
21.图2为4d6抗体与沙丁胺醇(sal)的复合体预测结构图。
22.图3为4d6抗体的亲和力成熟结果图，4d6h1和4d6h2分别为4d6单克隆抗体的突变体。
23.图4为4d6抗体与不同β-兴奋剂(分别为沙丁胺醇、克伦特罗、特布他林、莱克多巴胺和非诺特罗)的elisa结果。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1：抗沙丁胺醇/克伦特罗的单克隆抗体的制备
26.1、用沙丁胺醇半抗原在噬菌体抗体库中经过4轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，获得抗沙丁胺醇的单链(scfv)抗体，然后通过pcr扩增测序获得抗体的可变区序列，分别为轻链可变区序列seq id no.3和重链可变区序列seq id no.4，其中亲和力最高的克隆为4d6细胞株。
27.2、根据步骤1所获得的轻链和重链可变区序列，设计引物，引物的序列如下：
28.重链引物：
29.正向：accagggtgctgagtcaggtgcagctgcagcagag(seq id no.13所示)；
30.反向：gcccttggtgctagcggcgctcacggtcaccaggg(seq id no.14所示)；
31.轻链引物：
32.正向：acaggagtgcatagtgacatcctgatgacccagac(seq id no.15所示)；
33.反向：tgcagccaccgtacgcttgatctccagcttggtgc(seq id no.16所示)。
34.3、通过pcr分别扩增上述获得的(scfv)抗体的重链和轻链基因，分别回收重链和轻链的pcr产物，所述重链和轻链的pcr扩增体系和扩增条件相同，pcr扩增体系为：
[0035][0036][0037]
pcr扩增条件为：
[0038]
[0039]
4、通过无缝克隆将上述重链和轻链的pcr产物分别连入重链表达载体pbnch(自制载体)和轻链表达载体pbncl(自制载体)，并将测序正确的克隆保存菌种并扩大培养，提取质粒，分别得到重链质粒和轻链质粒。
[0040]
5、抗体的表达
[0041]
(1)取步骤4得到的重链质粒30μg和轻链质粒20μg置于1ml的293f培养基中，得混合物a；另外取200μl的293f转染试剂置于9ml的293f培养基中，得混合物b；将上述两种混合液室温静置15min；
[0042]
(2)处理293f细胞，将293f细胞离心后用293f培养基重悬，然后计数吸取1
×
108个细胞于培养瓶中，用293f培养基定容为90ml，得混合液c，静置15min；
[0043]
(3)15min结束后,将步骤(1)和步骤(2)静置后的混合物a、b和c混合均匀，放在摇床培养箱中进行培养，培养条件为5％co2，150rmp，37℃，1天后加补料，7天后收集细胞上清。
[0044]
6、抗体的纯化
[0045]
akata纯化仪按照protein a纯化的标准步骤纯化，以1ml/min的速度上样，以1ml/min的速度洗脱。将纯化后的4d6单克隆抗体(即本发明的抗沙丁胺醇和/或克伦特罗单克隆抗体)进行sds-page检测，其结果如图1所示，由图1可知纯化后的抗体纯度很高，且用protein a柱纯化效果较好，且还原电泳后，4d6抗体蛋白解离为两条带，分别在55kd和25kd的位置，分别对应为重链和轻链的位置。
[0046]
实施例2：抗沙丁胺醇单克隆抗体同源建模及分子对接
[0047]
4d6单克隆抗体的3d结构通过robetta(https://robetta.bakerlab.org/)使用默认参数进行预测。选用autodock vina作为分子对接工具。采用mgltools1.5.6读入4d6结构，并进行加氢以及赋予kollman电荷操作，生成protein.pdbqt文件。对接盒中心设置为cdr环的几何中心，盒子大小设置为使其包含整个cdr域。sdf格式的sal三维结构从pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/salbutamol)下载，并使用openbabel将其转换为mol2文件。mgltools用于生成配体pdbqt文件，采用分子对接软件包中的ligand_prepare.py脚本对配体linoleic acid的mol2文件进行处理，采用默认方式设置柔性键，赋予gasteiger电荷，生成配体pdbqt文件，得到4d6抗体与沙丁胺醇(sal)的复合体预测结构图；
[0048]
通过分析4d6-sal复合体结构，可以看出sal结合在重链和轻链之间，与cdr3环的残基形成接触。在sal的羟基与asn35、glu158和tyr173的侧链之间观察到氢键。同时，sal与cdr-h1的tyr33、fr-h2的trp47、cdr-h2的asp50、cdr-h3的ser98、gln99、ser100形成相互作用；也与fr-l2的tyr156、lys174；cdr-l3的phe213、ser216、val218和phe220有结合。在这个模型中，4d6的hcdr3和lcdr3在抗原结合中起主要作用。
[0049]
实施例3：单克隆抗体的亲和力成熟测定
[0050]
在抗体与抗原的结合中，抗体结构中的cdr区域，尤其是重链cdr3和轻链cdr3发挥着最为重要的作用。根据上述计算机分子模拟分析结果，在单克隆抗体对沙丁胺醇的结合中，重链cdr3区的ser98、gln99、ser100，轻链cdr3区的phe213、ser216、val218和phe220发挥着最为重要的作用。以此分析为指导，选取沙丁胺醇分子周围50nm范围内的氨基酸残基作为突变靶位点，共选取10个氨基酸残基。根据已知的抗体基因序列设计简并引物，通过
pcr技术分别在单链抗体中靶位点引入突变。为避免产生过多无活性克隆，采用经调整的nns简并密码子引入突变，在每个氨基酸突变点产生50％的随机突变几率。将pcr扩增产物克隆至噬菌体展示载体中，构建噬菌体展示文库。每次进行3-4个氨基酸的随机突变，约产生1.3x106个突变子，所构建的核糖体展示文库约为1x10
8-9
，良好的覆盖了所有可能的突变子，达到了高通量突变体筛选的要求。
[0051]
在构建突变噬菌体展示文库后，使用bsa标记的半抗原和链霉亲和素包被的纳米磁珠对文库中的活性克隆进行纯液相免疫亲和富集筛选。共进行6轮，在每轮富集中逐步降低筛选所用抗原sal浓度，本实施例中筛选抗原sal的浓度依次为100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml，以改善抗体的亲和力。最后一轮富集结束后，随机挑选单独菌落克隆进行scfv的分泌表达，并进行elisa鉴定。最终抗体亲和力成熟结果如图3所示，可以看出，不同浓度(0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.31μg/ml、0.63μg/ml、1.25μg/ml、2.50μg/ml、5.00μg/ml)游离sal对sal-bsa与4d6单克隆抗体及其突变体4d6h1和4d6h2的结合具有不同的抑制作用，显示4d6突变体能够提高其对沙丁胺醇(sal)的亲和力。
[0052]
实施例4：单克隆抗体的应用
[0053]
1、采用sal-bsa(采用碳酸盐缓冲液调节浓度)进行包被，100μl/孔；sal-bsa的包被浓度为1μg/ml。
[0054]
2、4℃孵育16小时。
[0055]
3、封闭并洗板。
[0056]
4、每孔加入50μlβ-兴奋剂溶液(β-兴奋剂和pbs缓冲液组成)，β-兴奋剂分别为沙丁胺醇、克伦特罗、特布他林、莱克多巴胺和非诺特罗，每种β-兴奋剂的浓度分别设置为o.oo12μg/ml、o.oo49μg/ml、0.0195μg/ml、0.0781μg/ml、0.3125μg/ml、l.25μg/ml、5μg/ml；对照孔设置为只加入pbs缓冲液的孔；每个浓度设置3个复孔。
[0057]
5、每孔加入100μl制备的4d6单克隆抗体溶液，浓度为1ng/μl。
[0058]
6、37℃孵育1h，洗板。
[0059]
7、每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体，37℃孵育1h。
[0060]
8、洗板。
[0061]
9、加入tmb显色液，避光显色15min。
[0062]
10、每孔加入100μl 2mol/l硫酸中止反应；读取od
450
值。
[0063]
将采用各个浓度的β-兴奋剂得到的吸光值(三个复孔的平均值)b除以对照孔的吸光值b0得到的b/b0作为纵坐标，以β-兴奋剂浓度(μg/ml)为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50％时对应的β-兴奋剂浓度(μg/ml)，即ic50值，其中沙丁胺醇ic50值为0.04μg/ml，克伦特罗ic50值为0.06μg/ml。结果如图4所示，可以看出，本发明制备的抗沙丁胺醇和/或克伦特罗单克隆抗体只与沙丁胺醇和克伦特罗进行结合，不与特布他林、莱克多巴胺和非诺特罗结合，且对沙丁胺醇和克伦特罗具有良好的交叉反应率、高亲和力和高灵敏度。经计算得出，单克隆抗体与沙丁胺醇的交叉反应率为100％，则单克隆抗体与克伦特罗的交叉反应率为66.7％。
[0064]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。