GmZTL3蛋白和及其编码基因的应用和一种培育大豆的方法

gmztl3蛋白和及其编码基因的应用和一种培育大豆的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及gmztl3蛋白和及其编码基因的应用和一种培育大豆的方法。


背景技术：

2.大豆是一种典型的短日照植物(short day plant，sdp)，生育期受到日照长度的显著影响，这一特性严重阻碍大豆品种的适应性，限制大豆播种范围，最终影响大豆产量。
3.大豆的生育期、成熟度和株高是影响大豆产量和区域适应性的重要农艺性状。大豆生育期性状的改良一直是研究的热点问题。早熟是各地区对大豆育种的普遍要求，也是我国大豆等植物向北扩展种植的基础和高海拔地区利用土地资源的基础。现代生物工程技术可以打破生物之间的界限来实现遗传物质的重新组合，按照人类预先设计进行育种，使之符合人类的需要。大豆种植的纬度跨度较广，但是个体品种的纬度适应性较为狭窄。单一的传统育种存在着育种时间长，有很大的盲目性和不确定性等缺点。生物工程技术与传统育种技术相结合，通过对早熟的优良基因的遗传选育，培育出具有早熟性状的大豆新品种，并且为大豆转基因育种提供必需的理论佐证，一方面可以为通过基因转化的方法培育其他作物新品种提供资料，同时还将产生巨大的社会经济及生态效益。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了提供一种同时控制植物光周期和花期的方法。
5.本发明提供一种gmztl3蛋白在控制植物生育期、控制植物光周期或控制植物植物生育期和光周期中的应用，所述gmztl3蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示。
6.进一步地限定，植物为双子叶植物或单子叶植物；
7.进一步地限定所述植物为豆科植物；
8.进一步地限定，所述植物为大豆；所述植物为大豆品种东农50。
9.进一步地限定，所述控制生育期为提高株高；所述控制光周期为提前开花。
10.进一步地限定，所述提前开花是在长日照和短日照的条件下。
11.本发明提供了一种编码seq id no.10所示的氨基酸序列的基因在控制植物生育期、控制光植物周期或控制植物生育期和光周期中的应用。
12.进一步地限定，植物为双子叶植物或单子叶植物；
13.进一步地限定所述植物为豆科植物；
14.进一步地限定，所述植物为大豆；所述植物为大豆品种东农50。
15.进一步地限定，所述控制生育期为提高株高；所述控制光周期为提前开花。
16.本发明提供了一种培育大豆的方法，所述方法的步骤如下：
17.(1)扩增编码seq id no.10所示氨基酸序列的基因序列，将基因序列插入到表达载体；
18.(2)将步骤(1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆中得到转基因
大豆；
19.(3)鉴定步骤(2)获得的转基因大豆得到阳性转基因大豆。
20.进一步地限定，步骤(1)所述基因的序列如seq id no.7所示。
21.进一步地限定，步骤(1)中获得基因序列的方法是利用上游引物如seq id no.1所示和下游引物如seq id no.2所示的序列扩增seq id no.3所示基因序列1，再利用上游引物如seq id no.4所示和下游引物如seq id no.5所示的序列扩增seq id no.6所示基因序列2，将基因序列1和基因序列2进行融合pcr反应得到基因序列。
22.进一步地限定，步骤(1)利用的表达载体为pb7wg2。
23.进一步地限定，步骤(2)所述的农杆菌为根癌农杆菌lba4404、eha105或gv3101。
24.有益效果：在长短日照条件下，向大豆品种东农50中导入重组质粒pb7wg2-gmztl3，经筛选得到t1代转gmztl3基因大豆的阳性植株。与大豆品种东农50相比，t1代转gmztl3基因大豆的阳性植株早花，株高显著增加。由此可见，蛋白质gmztl3可以调控植物生育期、株高、开花时间和光周期。
附图说明
25.图1为重组质粒pb7wg2-gmztl3的构建过程图谱。
26.图2为gmztl3基因全长的克隆，其中，m1是d15000 dna marker，m1是d2000 dna marker，1是gmztl3基因全长。
27.图3为重组质粒pb7wg2-gmztl3编码区pcr鉴定，d2000 dna marker，1-5是阳性重组质粒pb7wg2-gmztl3，6是阴性对照。
28.图4为重组质粒pb7wg2-gmztl3启动子区pcr鉴定，d2000 dna marker，1-6是阳性重组质粒pb7wg2-gmztl3，7是阴性对照。
29.图5为t0代转gmztl3基因大豆的分子鉴定，其中，wt是大豆品种东农50，m是d2000 dna marker，1-7是t0代转gmztl3基因大豆株系。
30.图6为qrt-pcr检测t0代转gmztl3基因大豆的检测结果，其中，横坐标是组别，纵坐标是gmztl3基因相对表达量。
31.图7为采用免疫胶体金试纸条检测t0代转gmztl3基因大豆的检测结果，其中，wt是大豆品种东农50，gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆。
32.图8为t1代转gmztl3基因大豆的分子鉴定，其中，m是d2000 dna marker，1-6是t1代转gmztl3基因大豆，wt是大豆品种东农50。
33.图9为t1代转gmztl3基因大豆的蛋白鉴定，其中，wt是大豆品种东农50，gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆。
34.图10为长日照下生殖生长时期植株表型比较，其中，wt是大豆品种东农50，gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆。
35.图11为长日照下生殖生长时期花序比较，其中，wt是大豆品种东农50，gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆。
36.图12为长日照下成熟时期植株表型比较，其中，wt是大豆品种东农50，gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆。
37.图13为短日照下生殖生长时期植株表型比较，其中，wt是大豆品种东农50，
gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆。
38.图14为短日照下生殖生长时期花序比较，其中，wt是大豆品种东农50，gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆。
39.图15为短日照下成熟时期植株表型比较，其中，wt是大豆品种东农50，gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆。
具体实施方式
40.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
41.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
42.下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
43.以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
44.大豆品种东农42记载于如下文献中：陈立君.不同播期对大豆东农42产质量性状动态变化规律研究.[j].大豆科学，2008.。在下文中，大豆品种东农42简称为东农42。大豆品种东农50记载于如下文献中：yu jin，juanjuan qu，guangming ren，lei dong.effects of transgenic dreb soybean dongnong50 on the diversity of soil ammonia-oxidizing bacteria.agricultural science&technology.2013，14(7):988-992.在下文中，大豆品种东农50简称为东农50，公众可以从东北农业大学(即申请人处)获得，以重复本技术实验。
[0045]
根癌农杆菌lba4404记载于如下文献中：陈中健，刘兵，王宏斌，王金发，刘良.(2003)水稻重复序列rrd3缺失体介导gusa在水稻愈伤组织中的表达式.热带亚热带植物学报，li(2)：127-131.
[0046]
pb7wg2载体为invitrogen公司的产品。
[0047]
植物光周期的改变可表现为开花时间的改变。光周期是指昼夜周期中光照期和暗期长短的交替变化。植物开花对日照长度的反应有三种类型，分别为长日照植物、短日照植物和日中性植物。长日照植物指在24h昼夜周期中，日照长度长于一定时数才能成花的植物。短日照植物指在24h昼夜周期中，日照长度短于一定时数才能成花的植物。日中性植物的成花对日照长度不敏感，只要其他条件满足，在任何长度的日照下均能开花。
[0048]
实施例1.构建含有gmztl3基因的载体
[0049]
1.蛋白质gmztl3的编码基因(gmztl3基因)的克隆
[0050]
(1)采用trizo1法提取生长30天的东农42幼苗的叶片的总rna，然后利用反转录酶反转录出第一链cdna，得到东农42的cdna。
[0051]
(2)以步骤(1)获得的东农42的cdna为模板，采用5
’‑
atggagtgggacagcaattccgat-3’(序列如seq id no.1所示)和5
’‑
gatgacagaacttgccaaggaaagt-3’(序列如seq id no.2所示)组成的引物对进行pcr扩增，得到约1836bp的双链dna分子。
[0052]
反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。
[0053]
将步骤(2)得到的双链dna分子进行测序。测序结果表明，步骤(2)得到的双链dna分子的核苷酸序列如seq id no.3所示(gmztl3基因编码区)。
[0054]
(3)gmztl3的编码基因启动子(gmztl3基因启动子)的克隆
[0055]
1)采用ctab法提取生长30天的东农42幼苗的叶片的dna。
[0056]
2)以步骤1)获得的东农42的dna为模板，采用5
’‑
tggagctcggtaccccaataaatttttgtaaaaattggat-3’(序列如seq id no.4所示)和5
’‑
ccactcttcccctccccatatatacactatcaaatattaa-3’(序列如seq id no.5所示)组成的引物对进行pcr扩增，得到约1643bp的双链dna分子。
[0057]
反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。
[0058]
将步骤2)得到的双链dna分子进行测序。测序结果表明，步骤2)得到的双链dna分子(gmztl3基因启动子)的核苷酸序列如seq id no.6所示，结果如图2所示。
[0059]
2.重组质粒pb7wg2-gmztl3的构建
[0060]
重组质粒pb7wg2-gmztl3的构建过程图谱见图1。
[0061]
(1)将实施例1获得的seq id no.3所示和seq id no.6所示的核苷酸序列分别进行回收，将回收获得的两个dna片段进行融合pcr反应，采用5
’‑
tggagctcggtaccccaataaatttttgtaaaaattggat-3(序列如seq id no.4所示)和5
’‑
gatgacagaacttgccaaggaaagt-3’(序列如seq id no.2所示)组成的引物对进行pcr扩增，得到约3479bp的双链dna分子。
[0062]
反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃3min30s，35个循环；72℃10min。
[0063]
得到重组dna片段gmztl3全长如seq id no.7所示(gmztl3基因全长)。
[0064]
(2)完成步骤(1)后，将重组dna片段gmztl3全长重组到经smai限制性内切酶酶切后的线性pentry-flag载体上进行in-fusion(639633，takara公司产品)无缝连接反应，得到重组质粒progmfulc:gmfulc-flag。
[0065]
(3)完成步骤(2)后，将重组质粒progmfulc:gmfulc-flag和pb7wg2载体进行(logistic regression)lr反应，反应如表2所示，得到重组质粒pb7wg2-gmztl3。
[0066]
表1 lr反应体系
[0067][0068]
将重组质粒pb7wg2-gmztl3进行测序。测序结果如3和图4所示表明，重组质粒pb7wg2-gmztl3中含有gmztl3全基因组的dna分子。
[0069]
实施例2.一种培育转gmztl3基因大豆
[0070]
1.将重组质粒pb7wg2-gmztl3导入根癌农杆菌lba4404，得到重组农杆菌，命名为lba4404/pb7wg2-gmztl3。
[0071]
2.t1代转gmztl3基因大豆的阳性植株的获得
[0072]
t0代转gmztl3基因大豆的获得
[0073]
采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法(记载于如下文献中olhoft p m，donovan c m，somers d a.soybean(glycine max)transformation using mature cotyledonary node explants[j].methodsin molecular biology，2006，343(12)：385)，将步骤二获得的lba4404/pb7wg2-gmztl3转至大豆品种东农50中，获得t0代转gmztl3基因大豆。具体步骤如下：
[0074]
(1)取大豆品种东农50的种子，先用氯气灭菌16h，然后无菌水浸泡12h，得到吸涨的大豆。
[0075]
(2)完成步骤(1)后，取吸涨的大豆，去皮，将2个子叶分开，用刀片在子叶节附近轻划出伤口，然后将其放入农杆菌重悬液中侵染30min。
[0076]
农杆菌重悬液的制备方法如下：取步骤二获得的重组农杆菌的单克隆，加入20ml yep液体培养基，28℃、200rpm震荡培养，得到od
600nm
值为0.5左右的菌液1；将菌液1接种至200ml yep液体培养基，28℃、200rpm震荡培养，得到od
600nm
值为1.6-2.0的菌液2；取菌液2，室温、5000rpm离心10min，收集沉淀；取沉淀，用液体浸染培养基重悬，得到od
600nm
值为0.8的农杆菌重悬液。
[0077]
液体浸染培养基的溶质及其浓度为0.321g/l b5培养基(gamborg b-5basal medium)，30g/l蔗糖，3.9g/l mes，1.67mg/l 6-ba，0.25mg/l ga3和0.04g/l as；溶剂为水；ph值为5.4。
[0078]
(3)完成步骤(2)后，取大豆子叶，先用滤纸吸干重悬液，然后置于固体共培养培养基，25℃光照培养5天。
[0079]
固体共培养培养基的溶质及其浓度为0.321g/l b5培养基，30g/l蔗糖，3.9g/l mes，1.67mg/l 6-ba，0.25mg/l ga3，0.04g/l as，0.4g/l l-cys，0.15g/l dtt，0.5％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；ph值为5.4。
[0080]
(4)完成步骤(3)后，将大豆子叶转移至丛生芽诱导培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)28天。
[0081]
丛生芽诱导培养基的溶质及其浓度为0.321g/l b5培养基，30g/l蔗糖，0.59g/l mes，1.67mg/l 6-ba，200mg/l cef，200mg/l tim，5mg/l草铵膦和0.75％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；ph值为5.4。
[0082]
(5)完成步骤(4)后，先从大豆子叶上切下丛生芽，然后将该丛生芽转移至丛生芽伸长培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)至丛生芽中再生的植株伸长至2cm。
[0083]
丛生芽伸长培养基的溶质及其浓度为4.43g/l ms，30g/l蔗糖，0.59g/l mes，0.5mg/lga3，1mg/l zr，1mg/l asp，0.1mg/l iaa，200mg/l cef，200mg/l tim，3mg/l草铵膦和0.75％(w/v)琼脂；溶剂为水；ph值为5.6。
[0084]
(6)完成步骤(5)后，将丛生芽中再生的植株从基部切下，然后转移至生根培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)，得到t0代拟转gmztl3基因大豆。
[0085]
生根培养基的溶质及其浓度为0.321g/l b5培养基，20g/l蔗糖，3.9g/l mes，1mg/l iba和0.8％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；ph值为5.6。
[0086]
3.t0代转gmztl3基因大豆的鉴定
[0087]
(1)提取t0代转gmztl3基因大豆植株的叶片的基因组dna并以其作为模板，采用gmztl3-f：5
’‑
tcaatcttaagaaactttattgcca-3’(序列如seq id no.8所示)和gmztl3-r：5
’‑
gggtccctggaaggcacg-3’(序列如seq id no.9所示)组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；然后进行如下判断：如果某pcr扩增产物中含有约390bp的dna片段，则该pcr扩增产物对应的t0代转gmztl3基因大豆植株被鉴定为t0代转gmztl3基因大豆阳性植株。部分检测结果图5(wt为大豆品种东农50，1-7为t0代转gmztl3基因大豆)。
[0088]
(2)采用trizo1法提取生长至30天的东农50和t0代转gmztl3基因大豆幼苗叶片的总rna，然后利用反转录试剂盒获得cdna。采用5
’‑
gctaactaatcctcacaccact-3’(序列如seq id no.11所示)和5
’‑
gtcaagttcaacccatgagaac-3’(序列如seq id no.12所示)组成的引物进行qrt-pcr扩增。反应条件为：95℃2min；95℃15s，60℃15s，40个循环。
[0089]
检测结果如图6所示：t0代转gmztl3基因大豆的植株，gmztl3基因相对表达量在gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7株系中表达量较高，选取这三个株系进行下一步试验。
[0090]
(3)重组农杆菌lba4404/pb7wg2-gmztl3转至大豆品种东农50，其中pb7wg2载体中含有特异性抗除草剂基因bar，检测是否有bar蛋白的表达，可以提示样本中是否含有转基因成分。分别取大豆品种东农50的植株或t0代转gmztl3基因大豆的植株，采用免疫胶体金试纸条(envirologix公司的产品)检测是否有bar蛋白的表达。
[0091]
bar试纸条检测：剪取待检测大豆的叶片置于1.5ml离心管中，加入200μl去离子水，用研磨棒捣碎叶片，bar试纸条(as-014-lss，envirologix公司的产品)插入捣出的匀浆中。2条带为阳性，1条带为阴性植株。有bar蛋白的表达即为t0代转gmztl3基因大豆。
[0092]
部分检测结果如图7所示：(wt为大豆品种东农50，gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆的阳性植株)。
[0093]
4.t1代转gmztl3基因大豆的获得和鉴定
[0094]
(1)待t0代转gmztl3基因大豆成熟后采收，自交，得到t1代转gmztl3基因大豆。
[0095]
(2)将大豆品种东农50或t1代转gmztl3基因大豆的种子播种于温室中，当三出复叶完全展开后，剪取待鉴定大豆植株叶片，液氮速冻。
[0096]
(3)提取t1代转gmztl3基因大豆的阳性植株的叶片的基因组dna并以其作为模板，采用gmztl3-f：5
’‑
tcaatcttaagaaactttattgcca-3’和gmztl3-r：5
’‑
gggtccctggaaggcacg-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；然后进行如下判断：如果某pcr扩增产物中含有约390bp的dna片段，则该pcr扩增产物对应的t1代转gmztl3基因大豆的阳性植株再次被鉴定为t1代转gmztl3基因大豆植株。
[0097]
检测结果见图8(m为dna marker，wt为大豆品种东农50，gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7为t1代转gmztl3基因大豆)。
[0098]
经过上述步骤，鉴定出的3个t1代转gmztl3基因大豆(gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7)的阳性植株株系将进行后续实验。
[0099]
实施例3.表达gmztl3蛋白
[0100]
1.将实施例2获得的转gmztl3基因大豆的阳性植株
[0101]
1).蛋白的提取
[0102]
称取新鲜转基因大豆叶片(约0.3g)，利用钢珠配合磨样器在液氮下打磨样品；频率20次/s，40s，打磨1-2次，将样品充分研磨。向样品粉末中加入300μl pbs buffer，充分振荡混匀，冰上静置10min后14000rpm，10min，加入2
×
xsample buffer；热水浴80℃，5min，充分裂解，可放-80℃冰箱备用。
[0103]
2).western blot检测方法
[0104]
(1)sds-page电泳
[0105]
制备sds-page倒入薄玻璃板中，再放入跑胶槽中，点样跑胶；将电压调至100v进行
跑胶，待样品跑出上层胶后，将电压增加至150v，直至样品跑至下层面胶底部，即跑胶结束。
[0106]
(2)转膜
[0107]
先用1
×
transfer buffer将大小与凝胶相同的滤纸、硝酸纤维素膜和薄泡沫浸湿；在转膜夹上，从黑色孔处依次放置薄泡沫、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、薄泡沫(放置过程中，注意及时处理气泡，防止气泡的产生)，最后将转膜夹夹好；将准备好的转膜夹放入转膜槽中，向转膜槽中加入1
×
transfer buffer，放入冰袋，在低温的条件下进行转膜；在100v恒定电压条件下，转膜1h。
[0108]
(3)丽春红染色
[0109]
将膜放于1
×
tbst buffer中清洗一次；再将膜泡在丽春红染色溶液中，于水平摇床上，室温，50-60rpm，染色1min；染色结束后，用无菌水清洗硝酸纤维素膜3-4次，观察被染色的硝酸纤维膜以确定蛋白提取状况；并根据目的蛋白大小进行剪膜。
[0110]
(4)封闭
[0111]
将硝酸纤维素膜泡在blocking buffer中，于水平摇床上；室温，50-55rpm，封闭1h。
[0112]
(5)杂交
[0113]
将blocking buffer倒掉，按照1:2000比例进行稀释抗体(a8592,sigma公司的产品)；加入杂交液，于水平摇床上；室温，30-40rpm，杂交1h。
[0114]
(6)洗膜
[0115]
结束杂交后，将膜放入1
×
tbst中温育晃动洗膜10min，共3次。
[0116]
(7)显影
[0117]
用酒精擦拭化学发光成像仪中的成像板，根据比例配置ecl显影液，现用现配；将配好的显影液用移液器均匀的滴在硝酸纤维素膜上，确保显影液均匀完全的将硝酸纤维膜覆盖，显色3-5min；然后通过化学发光成像仪观察western blot结果如图9所示，目的带大小约为66.36kda。
[0118]
2.测序得到蛋白质的氨基序列如seq id no.10所示。
[0119]
实施例4.gmztl3蛋白在控制植物生育期、控制植物光周期或控制植物生育期和植物光周期中的应用
[0120]
将实施例2获得的gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7分别进行长日照和短日照的培育，获得的株系相对于野生型大豆品种东农50提前开花，株高增加。
[0121]
利用以下实验验证实验效果：
[0122]
表型分析：
[0123]
分别播种待测大豆(大豆品种东农50、gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7)，长日照培养(光培养(16h)和暗培养(8h)交替进行；光培养时为白光，光照强度为350μmol m-2
s-1
)，观察表型并统计株高和大豆开花时间。
[0124]
表2(r1为始花期，r2为盛花期，r3为始荚期，r4为盛荚期，r5为始粒期，r6为鼓粒期，r7为成熟初期，r8为完熟期)和表3。表2和表3中，gmztl3-ox为gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7的平均值。结果表明，在长短日照下，与大豆品种东农50相比，t1代转gmztl3基因大豆的阳性植株早花，株高显著增加。
[0125]
分别播种待测大豆(大豆品种东农50、gmztl3-ox-1、gmztl3-ox-2、gmztl3-ox-7)，
短日照培养(光培养(8h)和暗培养(16h)交替进行；光培养时为白光，光照强度为350μmol m-2
s-1
)，观察表型并统计株高和大豆开花时间。
[0126]
上述结果表明，结果如图10-12为长日照下生殖生长状态，在长日照条件下，在大豆品种东农50中过表达gmztl3基因开花时间提前12.45％，株高增加14.28％；
[0127]
结果如图13-15为短日照下生殖生长状态，在短日照条件下，在大豆品种东农50中过表达gmztl3基因开花时间提前8.15％，株高增加19.42％。为培育光周期反应相对敏感的大豆品种，提供研究基础和育种材料，对大豆育种具有重要的理论和实践意义。
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表2.花期数据
[0129][0130]
注：**表示p《0.01。
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表3.表型数据
[0132][0133]
注：**表示p《0.01。