纤维素降解菌及菌剂、制备方法、应用和降解酒糟的方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及纤维素降解菌及菌剂、制备方法、应用和降解酒糟的方法。


背景技术：

2.酿酒或酒精产业实现了工业化，其酒糟的产量也与日俱增，酒糟成为了生产企业的巨大负担。目前，酒糟作为肥料是目前处理量较大的一种方式，绝大多数企业或个体均对酒糟的处理方法比较简单粗暴，基本上是简单干燥处理后用作肥料直接出售，甚至直接填埋掉，酒糟中丰富的营养成分未被充分利用，这不仅造成资源的严重浪费，而且还会造成环境污染。因此，酒糟堆肥改良成为我们急需解决的关键问题。有研究通过菌种对酒糟、秸秆等有机废弃物进行发酵改良，将其转化为有机肥。林金新等通过短时间的混合菌株发酵酒糟，有效提高其中氮磷钾和有机腐殖质等含量。魏蔚等研究证实了复合菌剂对秸秆降解速率的促进作用和对土壤质量的提升效果。兰小艳等采用白腐菌使酒糟纤维素含量降低了9.5％。阳刚等将枯草芽孢杆菌b2菌株应用于酒糟降解，酒糟降解率为15.23％。李国伟等使用菌株yt5-1-1对酒糟发酵后发现，半纤维素降解率和纤维素降解率较空白组分别提高了4.18％和3.46％。寻找更多的降解菌具有十分重要的作用。
3.黑水虻(hermetia illucens l.)又叫亮斑扁角水虻，属于双翅目水虻科昆虫，其繁殖速度快，可摄取的食物种类多，物料转化率高，生长周期短，处理粪便速度快，抗逆性强，可将体积庞大的有机废弃物转化为高附加值生物蛋白物质，可用作许多水产养殖物种和家禽的饲料。
4.目前，利用黑水虻幼虫进行堆肥已逐渐成为一种废物管理的生物技术，主要被用于商业化处理粪便和其他有机废弃物，却鲜有利用黑水虻联合微生物降解酒糟的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明为了弥补现有技术的不足，提供纤维素降解菌及菌剂、制备方法、应用和降解酒糟的方法。
6.第一个方面，本发明提供一株纤维素降解菌，所述纤维素降解菌为p15，分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，于2021年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为cctcc no：m 20211094。
7.第二个方面，本发明提供一种利用所述维素降解菌制备的微生物菌剂。
8.进一步的，所述的微生物菌剂的制备方法，是将所述纤维素降解菌接种于lb液体生长培养基，于30-32℃培养1-2d。
9.第三个方面，本发明提供所述纤维素降解菌或所述的微生物菌剂在降解纤维素、木质素和半纤维素中的应用。
10.进一步的，所述纤维素、木质素和半纤维素来源于酒糟。
11.第四个方面，本发明提供一种降解酒糟中纤维素、木质素和半纤维素的方法，是将所述纤维素降解菌或所述的微生物菌剂加入酒糟中，进行发酵。
12.第五个方面，本发明提供所述纤维素降解菌或所述的微生物菌剂联合黑水虻在降解酒糟中纤维素、木质素和半纤维素的应用。
13.第六个方面，本发明提供另一种降解酒糟中纤维素、木质素和半纤维素的方法，是将所述纤维素降解菌或所述的微生物菌剂加入酒糟混合发酵，并饲养黑水虻幼虫。
14.进一步的，所述酒糟的含水率为50-60％。
15.进一步的，每90g干重的酒糟中加入的所述纤维素降解菌的菌数为4.5-5.5
×
109cfu，黑水虻幼虫数为140-160头。
16.本发明具有以下有益效果：
17.黑水虻能利用酒糟中的糖类及蛋白质等营养物质、高效地降解酒糟中的纤维素、木质素、半纤维素资源，转化成自身的昆虫资源，提高酒糟的附加值，且其体内外存在着纤维素降解相关的细菌，联合黑水虻和本发明提供的纤维素降解菌降解酒糟，可改变黑水虻肠道群落结构，提高酒糟堆肥的效率。
附图说明
18.图1为葡萄糖标准曲线。
19.图2为菌株cmc-na酶活测定。
20.图3为酒糟的扫描电镜图，a为未经实验处理的酒糟，b为经黑水虻幼虫和p15共同发酵处理7天后的酒糟。
21.图4为黑水虻幼虫肠道菌群群落结构分析，a为细菌门水平的菌群分布，b为细菌属水平的菌群分布。
具体实施方式
22.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
23.实施例1：黑水虻体内菌株p15的筛选和鉴定
24.(1)纤维素刚果红培养基筛选
25.a.实验准备
26.分别用高粱酒糟、麦麸饲养黑水虻幼虫至4～5龄，先用ddh2o将黑水虻的体表清洗备用，取黑水虻降解过后的高粱酒糟、麦麸样品各0.3g于3ml灭菌生理盐水中制成悬液样品备用。
27.b.黑水虻体表消毒
28.在超净工作台内，依次用75％酒精、1％次氯酸钠溶液对黑水虻幼虫表面进行消毒除菌，再用无菌水冲洗虫体表面3遍，洗去消毒液，取最后一次洗过虫体的无菌水100μl涂布于lb培养基上检查体表消毒是否合格。
29.c.黑水虻幼虫肠道及其内容物提取
30.在超净工作台内，用解剖剪将幼虫从腹部轻轻剪开，用镊子取出肠道及其内容物至含有1.5ml灭菌生理盐水的离心管中，立即置于冰上，将5头黑水虻幼虫的肠道及其内容物为一组研磨为匀浆备用，生理盐水也涂板做空白对照。
31.d.涂布观察
32.将肠道悬液、饲养黑水虻的酒糟悬液和麦麸悬液分别稀释为10-4
、10-5
、10-6
，取80μl稀释液分别涂布于纤维素刚果红培养基进行初筛，每个样品每个稀释倍数3个重复。把培养基中出现较明显透明圈的菌点种在新的刚果红培养基上，35.6℃培养观察。用牙签点取透明圈明显形态大小有差异的菌落于lb平板上三区划线纯化培养，取纯化培养的单菌落再次点种于纤维素刚果红培养基上，编号并观察长势及形态。
33.(2)纤维分解菌16s rdna片段pcr扩增及测序
34.a.保菌
35.在超净工作台内，将刚果红培养基上初筛得到的纤维素分解菌株接种到装有4ml lb液体培养基的试管中，30℃，180r/min摇菌至对数生长期，取500μl菌液与甘油为1:1混合，-80℃甘油保菌。
36.b.煮沸法提细菌dna
37.将剩余的3ml菌液3000r/min离心5min后去上清，再用1ml ddh2o将沉淀清洗离心2次，然后取150μl ddh2o将沉淀重悬，放在漂浮板上于沸水浴中煮沸10min后，立即置于冰上5min，最后12000r/min离心10min后取100μl上清于0.2μl的ep管中，即得菌株dna模板。
38.c.16s rrna片段pcr扩增
39.用细菌通用引物27f(如seq id no.1所示)和1513r(如seq id no.2所示)各1μl进行16s rrna的pcr扩增。扩增条件：25μl premix taq酶，1μl细菌dna模板，22μl ddh2o；反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性30s、63.5℃退火30s、72℃延伸30s、30次循环，72℃再延伸10min，所得pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
40.d.双向测序并鉴定
41.将纯度符合要求的pcr扩增产物样品送至上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序，用软件chromes去除峰图杂乱部分的序列，得到测序精度满足要求的正反两条序列，然后用dnaman拼接为一条序列，通过blast进行序列比对。
42.于黑水虻肠道内筛选得到一株新的纤维素降解菌，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)p15(以下或称为菌株p15)。
43.所述菌株p15具有如下形态和生理特征：革兰氏阳性菌，单个细胞0.7～0.8
×
2～3微米，着色均匀，无荚膜。菌为椭圆形，菌落表面粗糙不透明，有很多隆起、皱褶，呈现污白色，生长、繁殖速度较快。
44.实施例2：dns法测定菌株p15纤维素酶活性
45.1、葡萄糖标准曲线绘制
46.葡萄糖在50℃烘箱烘24h后，用柠檬酸缓冲液(0.05m,ph 4.8)配置10mg/ml葡萄糖标准溶液，用柠檬酸缓冲液(0.05m,ph 4.8)稀释葡萄糖标准溶液分别为0、0.2、0.3、0.5、0.6、1、2、3mg/ml。分别取工作液0.1ml至1.5ml ep管中，加入0.15ml柠檬酸缓冲液与0.3ml dns试剂充分混匀后沸水浴5min，冷却后取200μl样品于比色皿并加入3ml水，混匀后用分光光度计在540nm处测定吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，结
果如图1所示。
47.测得葡萄糖标准曲线后，根据公式x＝(5.56
×m×
n)/(v
×
t)计算纤维素降解菌酶活力，式中x：cmc-na酶活力(u/ml)；m：吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的葡萄糖量(mg)；n：酶液的稀释倍数；v:酶液体积(ml)；t：时间(min)；5.56为1mg葡萄糖的μmol(1000/180＝5.56)。
48.2.cmc-na酶活测定
49.(1)粗酶液的制取
50.于15ml的试管中装入8ml的cmcf培养基(10g/l羧甲基纤维素，10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，4g/l硫酸铵，0.5g/l磷酸二氢钾，0.5g/l无水硫酸镁，ph调至7.0，115℃高压灭菌20min)，挑取初筛的纤维素降解菌单菌落接入其中，于30℃、180r/min摇床培养，同时做3个对照：不加菌的培养基作为空白对照组、产纤维素酶的菌株cicc10832作为阳性对照组、取适量菌液8000r/min离心15min，取上清液作为粗酶液。
51.(2)纤维素分解菌的cmc-na酶活测定
52.测试菌株在cmcf培养基中30℃，180r/min条件下培养。分别在培养第3d，5d，10d时取菌液l ml，10000r/min离心15min,分别取0.1ml上清作为粗酶液加到装有0.15ml 1％cmc-na溶液(用0.05m，ph 4.8的柠檬酸缓冲液配置，盛装于1.5ml ep管中)，50℃恒温条件下反应60min。加入0.3ml dns显色剂，充分混匀后置于沸水浴中煮沸5min，迅速于冰上终止反应，取反应样品0.2ml于比色管并加3ml水混匀，用分光光度计分别测定菌株粗酶液与底物cmc-na吸光度值540nm。每个样品设置三个平行，通过酶活计算公式算出酶活值。
53.底物的cmc-na降解能力可反应内切β-1,4-葡聚糖苷酶活性，菌株的cmc-na酶活测定对菌株的纤维素降解应用具有指导意义。结果如图2所示，第十天菌株p15的cmc-na酶活性显著高于对照组。
54.实施例3：菌株p15及联合降解酒糟能力测试
55.将茅台镇酒厂赠送的酱香型酒糟平均分成若干份，每份的干重均为90g，按如下分组发酵7天后采用范氏法检测纤维素、木质素和半纤维素的量，每组三个平行实验，取平均值。
56.a：酒糟不经发酵处理，即干酒糟；
57.b：酒糟经自然堆肥发酵，湿度为60％，以下各组湿度相同；
58.c：菌(p15)发酵，将菌株p15接种到盛有200ml lb液体生长培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g,琼脂糖15g,蒸馏水1l，121℃高压灭菌)的锥形瓶中，30℃培养1d以获得种子液，用麦氏比浊仪通过1
×
mcf(细菌的近似浓度为3
×
108cfu/ml)的比浊管进行比浊计算菌液浓度(cfu/ml)，菌数为5
×
109cfu，接种于的酱香型酒糟中，堆肥发酵；
59.d：虫发酵，在酒糟中混合150头黑水虻3龄幼虫(虫的初始总重量为1.05g)，堆肥发酵；
60.e：菌(p15)虫联合发酵酒糟中混合150头黑水虻3龄幼虫的同时，接种5
×
109cfu的p15。
61.结果如图3和表1所示，经过黑水虻与p15联合处理过的酒糟样品表面破损粗糙，而未经处理的酒糟其表面光滑完好，说明联合黑水虻和纤维素降解菌降解酒糟能破坏酒糟的纤维素结构，且能显著提高对纤维素、木质素和半纤维素的降解效果。
62.表1酒糟成分测定结果
[0063][0064]
实施例4：黑水虻肠道菌种多样性检测及功能分析
[0065]
实施例3降解结束后，取d组和e组的黑水虻各70头，解剖，取其肠道样品(包括肠道内容物)1g以上，液氮速冻，-80℃保存，干冰运输到天津诺禾致源生物信息科技有限公司对黑水虻幼虫肠道内容物进行16s rrna基因的v3～v4区测序，通过nova pe 250高通量测序并利用扩增子分析软件qiime2进行分析完成建库。
[0066]
高通量测序结果和基本数据统计如表2所示，肠道菌群在门水平上，主要为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、髌骨细菌门、脱硫细菌门、梭杆菌门等，从门水平的分析可知：变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门在样品d中占比分别是39.962％、52.642％、6.700％、0.411％；而在样品e中分别占82.901％、9.392％、5.878％、1.671％(图4a)。从在属的水平上，样品d中相对丰度大于1％的共有8个属，分别为摩根氏菌属(morganella，31.775％)、肌痛单胞菌(dysgonomonas，49.034％)、芽孢杆菌属(bacillus，2.007％)、苍白杆菌属(ochrobactrum，2.598％)、绒毛杆菌属(muribaculaceae，2.020％)、普罗威登斯菌属(providencia，1.068％)、(incertae-sedis,1.163％)、(uncultured,1.513％)；样品e中相对频率超过1％的有摩根氏菌属(morganella,81.056％)、肌痛单胞菌(dysgonomonas,8.381％)、芽孢杆菌属(bacillus,3.072％)、放线菌属(actinomyces,1.524％)(图4b)。
[0067]
从属水平上分析，菌虫联合后黑水虻幼虫肠道菌群中的摩根氏菌属和芽孢杆菌属的丰度提高了，而前期实验证明这两种菌有纤维素酶活力，故菌虫联合降解酒糟，菌的肠道菌群的结构会发生变化，肠道内纤维素降解相关的菌属丰度增加，如此便增强了黑水虻利用酒糟纤维素资源的能力，将更多的纤维素降解为单糖为自身的生长发育提供更多能量，故虫质量提高。
[0068]
表2高通量测序结果和基本数据统计
[0069][0070]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0071]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精
神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。