鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29及其在富集分离沙门氏菌中的应用

鸡白痢沙门氏菌噬菌体pu29及其在富集分离沙门氏菌中的应用
技术领域
1.本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体pu29及其在富集分离沙门氏菌中的应用。


背景技术：

2.沙门氏菌(salmonella spp.)作为重要的肠道致病菌之一，宿主广泛，能够引起各种动物的沙门氏菌病。鸡白痢沙门氏菌(salmonella pullorum)是沙门氏菌属鸡血清型的一种生物型。该型菌株具有高度适应专一宿主的特点，禽类中鸡最易感，火鸡次之。不同品种的鸡，易感性不同；母鸡的患病率比公鸡高。不同日龄的鸡易感性也不同，其感染症状主要为白色下痢和呼吸困难，病死率高达90％～100％。成年鸡多为隐性感染并且终身带菌，带菌母鸡可垂直传播给雏鸡，雏鸡之间也可以水平传播，因而极易导致鸡白痢在鸡群中的大范围流行，造成极大的经济损失。世界动物卫生组织(oie)将鸡白痢列为b类疫病，我国将其列为二类疫病。鸡白痢沙门氏菌为细胞内寄生菌，药物治疗只能缓解临床症状而不能根除，而且鸡肉制品中一旦存在药物残留则会对人的健康产生影响一。因此，鸡白痢沙门氏菌的检测在预防和控制方面尤为重要。为了实现对鸡白痢沙门氏菌的快速检测，针对预处理样品中的鸡白痢沙门氏菌进行快速准确的富集更是必不可少。
3.免疫磁珠分离技术(immunomagnetic separation，ims)利用经过修饰的磁性微球作为载体进行目标物的捕获及富集，一般由载体微球和功能化配基结合而成。为了富集样品中的目的细菌，将特异性物质(如特异性抗体等)包被于纳米磁性微球表面，当在外加磁场的磁力作用下，磁珠复合物会被吸附到磁极的一端，实现特异性富集目标细菌的效果，以达到提高有害细菌检出率的目的且大大缩短了检测时间。此外，还可以弥补传统检测方法的不足，即能够富集vbnc(不能培养却存在，viable but non-culture)性质的目标细菌。
4.目前为止，纳米磁珠技术在食品基质中已被广泛应用，例如肉制品、果汁、蔬菜及牛奶等样品的致病菌检测。食品中污染的致病菌数量通常较少，且基质复杂，常规分析方法难以实现对致病菌进行高灵敏和高特异性的检测。免疫磁分离技术通过免疫吸附和磁场作用可实现食品样品中少量致病菌的特异性分离富集，达到了后续分析检测的纯度和数量。
5.现在应用于病原微生物前富集分离的免疫磁珠分离技术中，纳米微球表面修饰的配基主要是特异性抗体，但特异性抗体一般价格昂贵且较难以获取，检测成本较高。寻找可与致病菌特异性结合的生物亲和分子并将其应用于致病菌的磁分离技术值得进一步探究。与抗体相比，噬菌体具有许多优势，即参与宿主识别的噬菌体蛋白极其稳定，噬菌体易于分离和繁殖，并且可以储存相当长的时间。这些特征使得噬菌体有望成为一种廉价且功能齐全的工具，在细菌的免疫检测过程中具有替代的抗体潜力。


技术实现要素：

6.本发明第一目的是提供了一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体pu29。
7.为实现上述目的，本发明所设计一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体(salmonella pullorum bacteriophage)pu29，其保藏编号为：cctcc no：m 2021169。
8.上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体(salmonella pullorum bacteriophage)pu29，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：cctcc m2021169，保藏日期为2021年1月29日，地址：中国武汉武汉大学。
9.上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体(salmonella pullorum bacteriophage)pu29为实验室分离纯化得到，其特异性强，能够识别不同血清型的沙门氏菌，并且不能识别其他种属的细菌；其具有快速吸附沙门氏菌的特点(15min可达到最大吸附速率)；其具有高ph稳定性(3-12)和热稳定性(30℃-90℃)。
10.上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体(salmonella pullorum bacteriophage)pu29通过第二代基因组测序法得到其基因组，采用生物信息学方法分析其基因组。随后结合其透射电镜结果，所述噬菌体pu29属于长尾科(siphoviridae family)噬菌体。
11.本发明第二目的是一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs及其制备方法，所述偶联物phagepu29-mbs为权利要求1所述鸡白痢沙门氏菌噬菌体pu29与羧基磁珠偶联得到的复合物。
12.进一步地，所述羧基磁珠的直径为200nm。
13.制备含有上述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液的方法，包括以下步骤：
14.1)将噬菌体pu29活化；
15.2)将羧基磁珠进行活化，得到活化羧基磁珠；
16.3)将噬菌体pu29与活化的羧基磁珠进行偶联，得到含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液，且含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液中，pbs的摩尔浓度为0.05mol/l，牛血清白蛋白(bsa)的质量体积浓度为15g/l，
17.每毫升pbs缓冲液中，沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的含量为2mg。
18.进一步地，所述步骤1)中，噬菌体pu29活化方法如下：
19.将噬菌体pu29贮存液与对数期的鸡白痢沙门氏菌cvcc c519混合，液体培养，过滤，得到噬菌体pu29液体，于4℃备用；且噬菌体pu29液体使用滴度为：10
10
pfu/ml。
20.上述噬菌体液体的滴度的测定方法如下：
21.首先进行噬菌体液体10倍梯度稀释，按从稀释倍数高到低的方向倒入4ml含有200μl宿主菌的0.7％琼脂lb培养基，37℃培养6-8h，观察噬菌斑和个数，即为噬菌体滴度。
22.上述羧基磁珠活化的制备方法如下：
23.1)将直径为200nm的羧酸修饰的磁珠经超声分散充分混匀后，得到分散磁珠，
24.2)取100μl分散磁珠到1.5ml离心管中，置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，保留磁珠；加入200μl 2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)溶液到上述离心管中，混匀置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，重复该步骤1次，加入n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)(100μl，20mg/ml)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)(200μl，20mg/ml)来活化磁珠上的羧基；
25.3)活化后的磁珠在37℃下以180r/min的速度垂直混合30min，然后用100μl冰冷的磷酸盐缓冲液(pbs)清洗磁珠3次，以除去多余的nhs和edc，得到活化的羧基磁珠mbs。
26.上述噬菌体pu29与活化的羧基磁珠偶联方法如下：
27.1)将200μl 1.0
×
10
10
pfu/ml的噬菌体pu29与1mg活化的羧基化磁珠在4℃下过夜孵育，
28.2)用200μl磷酸盐吐温缓冲液(pbst)洗涤磁珠两次，以除去多余的噬菌体。然后将偶联物phagepu29-mbs重新悬浮在1ml含3％牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(pbs)中，在37℃下振荡(180r/min)30min，以阻断残留位点。清洗phagepu29-mbs偶联物两次，以除去残留的阻断缓冲液；
29.3)最后，将phagepu29-mbs偶联物重悬于含1.5％牛血清白蛋白(bsa)的pbs(ph 7.4)中，4℃保存直至使用，得到含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液。
30.本发明还提供了一种富集分离沙门氏菌的试剂盒，它包括含有上述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液。
31.进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品和pbs缓冲溶液。
32.其中，阴性对照品为含有bsa的pbs缓冲液，其中，牛血清白蛋白(bsa)的质量体积浓度(m/v)为15g/l，
33.pbs缓冲液摩尔浓度为0.05mol/l；阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鸡白痢沙门氏菌cvcc c519。
34.本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行富集分离沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
35.1)含有沙门氏菌的待分离样品与含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液混合，摇床培养，得到培养样品
36.2)样品管放置于磁分离器中使得磁珠与液体充分分离，保留上清液；其中，所述上清液采用平板计数法，计算出上清液中的含菌量，
37.根据以下公式计算出phagepu29-mbs对沙门氏菌的捕获效率ce：
[0038][0039]
公式中，n0是初始样品中存在的沙门氏菌菌液浓度(cfu/ml)，na是未与颗粒结合的沙门氏菌菌液浓度(cfu/ml)。
[0040]
作为优选方案，所述步骤1)中，摇床培养条件为：温度为37℃，转速为180rpm，培养时间为：20min。
[0041]
本发明还提供了一种上述的试剂盒在牛奶中分离富集沙门氏菌的应用。
[0042]
本发明原理：
[0043]
噬菌体(感染细菌的天然病毒)是一类专门吸附细菌的生物体，其具有高特异性的识别宿主细菌的特性，这一特性使得噬菌体成为食源性病原菌检测的探针；和抗体相比，噬菌体的获得和纯化相对容易且成本低廉，宿主范围可以很广，也可以很窄，在温度、ph值和离子强度方面也比抗体更稳定。正是噬菌体具有的上述优点，使得其具有用于快速检测食源性病原体的潜力。
[0044]
本发明的有益效果：
[0045]
本发明能够在20min左右富集到沙门氏菌，并且对于103cfu/ml的沙门氏菌捕获率能够达到76.12％。另外，噬菌体能够作为特异性识别沙门氏菌的识别元件，替代目前免疫磁珠中所使用的抗体，减低富集技术的成本。
[0046]
综上所述，本发明以噬菌体作为特异性识别沙门氏菌的元件，与羧基化磁珠偶联形成具有特异性捕获沙门氏菌与磁响应的双功能性分离探针，能够作为病原菌检测前处理富集分离的有效手段，并且进一步扩展噬菌体在食品安全检测中的应用范围。
附图说明
[0047]
图1为噬菌体pu29双层平板中的噬菌斑的图片，
[0048]
图2为噬菌体pu29透射电镜照片，
[0049]
图3为噬菌体pu29生物学特性图，
[0050]
图中，a为噬菌体pu29的最佳感染复数图，
[0051]
b为噬菌体pu29一步生长曲线图，
[0052]
c为噬菌体pu29吸附速率曲线图，
[0053]
d为噬菌体pu29的温度稳定性图，
[0054]
e为噬菌体pu29的ph稳定性图；
[0055]
图4为偶联物phagepu29-mbs与偶联物phagepu29-mbs/细菌复合物透射电镜照片。
[0056]
图中，a为偶联物phagepu29-mbs透射电镜图，
[0057]
b为偶联物phagepu29-mbs/细菌复合物透射电镜图。
[0058]
图5为偶联物phagepu29-mbs条件优化图；
[0059]
图中，a为噬菌体pu29与磁珠偶联时间的影响图，
[0060]
b为加入偶联物phagepu29-mbs的量对于捕获效率的影响图，
[0061]
c为偶联物phagepu29-mbs捕获沙门氏菌的时间对捕获效率的影响，
[0062]
d反应温度对于捕获效率的影响图。
[0063]
图6为偶联物phagepu29-mbs捕获不同菌液浓度沙门氏菌的捕获效率图；
[0064]
图7为偶联物phagepu29-mbs捕获效率的特异性图。
[0065]
图8为测定在不同基质包括luria-bertani培养基、pbs缓冲液、脱脂牛奶、全脂牛奶中，使用偶联物phagepu29-mbs富集沙门氏菌的捕获效率图。
具体实施方式
[0066]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
[0067]
实施例1噬菌体分离纯化及形态学分析
[0068]
1.噬菌体分离纯化
[0069]
将从自然界中取样的样品与培养至对数期的鸡白痢沙门氏菌cvcc c519过夜液体培养12h，经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液按照上述方法重复一次，得到噬菌体原液。纯化噬菌体采用双层平板法，连续纯化5-10次，直至双层平板出现的噬菌斑大小、透明度一致，即为纯化好的噬菌体(图1)。
[0070]
2.噬菌体形态学分析
[0071]
将噬菌体采用磷钨酸负染色后，置于投射电子显微镜下观察噬菌体形态，具体操作步骤如下：铜网浸没于噬菌体液中10min之后用滤纸吸去多余液体，再将铜网置于磷钨酸染料中染色自然晾干至完全干燥，制备好的铜网在透射电子显微镜下观察噬菌体形态，并用软件digital micrograph demo 3.9.1测量其大小(图2)。
[0072]
结果显示：噬菌体pu29有一个二十面体的头部，尾部较长且弯曲，不可收缩，头部直径为68.63
±
1.68nm，尾部长度为179.91
±
3.5nm，尾部直径为9.23
±
0.21nm。根据噬菌体的形态学分类标准，pu29属于长尾噬菌体科(siphoviridae)。
[0073]
上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体(salmonella pullorum bacteriophage)pu29，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：cctcc m2021169，保藏日期为2021年1月29日，地址：中国武汉武汉大学。
[0074]
实施例2噬菌体pu29生物学特性分析
[0075]
1.噬菌体pu29宿主谱分析
[0076]
噬菌体宿主谱的测定采用点样法。取100μl培养至对数期的待测定菌液加入到温热的半固体培养基中，混匀后倒入预先制备好的lb琼脂平板上，待凝固后，取5μl效价109pfu/ml的噬菌体滴加至上层平板表面，干燥后倒置于37℃培养箱培养4h～6h，观察裂解情况。结果如表1，噬菌体pu29可以裂解沙门氏菌30株(30/36＝83.33％)，其中对13株非耐药沙门氏菌均可裂解，且出现较清晰透明的噬菌斑，特别是对两株鸡白痢沙门氏菌的裂解效果最佳。另外，还可以裂解耐药沙门氏菌17株(17/23＝73.91％)，且裂解效果较好，还可以裂解大肠杆菌5株(5/10＝50.00％)，对单增李斯特菌atcc 19114、金黄色葡萄球菌atcc 29213和atcc 6538无裂解效果。
[0077]
表1 噬菌体pu29宿主谱
[0078]
[0079][0080]
注：1：g
+
为革兰氏阳性菌，g-为革兰氏阴性菌。
[0081]
2：耐药性中r代表耐药(resistant)菌株，s代表敏感(sensitive)菌株。
[0082]
3：“+4、+3、+2、+1、0”代表了噬菌体对细菌不同程度的侵染能力，“+4”表示有非常透明且清晰地噬菌斑，“+3”表示噬菌斑较澄清且较透明，“+2”表示噬菌斑有朦胧的背景，“+1”表示噬菌斑不易观察且非常模糊，“0”表示毫无噬菌斑现象。
[0083]
2.噬菌体最佳感染复数(moi)
[0084]
感染复数(multiplicity of infection，moi)是指初始感染时噬菌体的数量与宿主菌数量的比值。按一定的moi值(0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000)将噬菌体与宿主菌混合，37℃培养3.5h，11000r/min离心10min，用双层平板法测定不同moi值样品中上清液的噬菌体效价。试验设3个平行。结果见图3a，噬菌体pu29在感染复数为0.001时，噬菌体效价最高，达到9.33
×
108pfu/ml，而当moi＝10时，噬菌体吸附、侵染效果最差，效价为9.00
×
107pfu/ml。结果表明当噬菌体效价与宿主菌菌量以0.001的比例侵染时，噬菌体宿主菌内能够增殖更多的子代噬菌体并裂解释放。
[0085]
3.一步生长曲线
[0086]
噬菌体的一步生长曲线反应其生长规律。将噬菌体和宿主菌按最适moi值混合，37
℃温育10min左右，使噬菌体吸附于细菌上，于4℃、8000r/min离心2min，弃上清，用等体积lb重悬，重复2次，以除去未吸附的噬菌体。将上述液体加入到9ml lb液体培养基中，每隔10min取样300μl，8000r/min离心2min，采用双层平板法测定上清液中噬菌体的效价。试验设3个平行。结果见图3b，噬菌体pu29在最佳moi＝0.001时的潜伏期为30min，裂解期为180min。短时间孵育后，pu29在30min～180min呈指数增长。通过2.3.5的计算公式得出，pu29的裂解量大约为115.74pfu/cell。
[0087]
4.吸附速率
[0088]
按最适moi值将新鲜噬菌体液与宿主菌悬液混合于离心管中，置于37℃摇床培养。从0min开始，每隔3min采用双层平板法测定上清液中噬菌体的效价。试验设3个平行。吸附速率＝1－(每个时间点未吸附的噬菌体效价/0min时噬菌体效价)
×
100％，噬菌体对宿主菌的吸附速率结果如图3c所示。由图3c可以看出，噬菌体pu29的吸附速率在0～15min呈上升趋势，15min时达到峰值，最佳吸附速率可达88.67％，表明噬菌体pu29在15min时能够最大量地吸附在宿主细菌上。
[0089]
5.噬菌体pu29稳定性分析
[0090]
将噬菌体原液稀释至106pfu/ml，并分装于1ml无菌离心管中，将离心管分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴锅中，0min、30min和60min时测定各管中噬菌体的效价。试验设3个平行。由图3d可知，其中噬菌体pu29在30℃到50℃之间噬菌体活性一直维持在与初始时相当的水平，当在60℃的环境下孵育1h之后，其效价下降到3.25
×
108pfu/ml。在70～90℃温度之间，随着温度的升高，噬菌体的效价急剧降低，但是在90℃孵育1h后，并没有完全失活，仍然有一定的效价。
[0091]
取已知效价的噬菌体悬液(107pfu/ml)100μl加入到900μl不同ph值(2～13)的pbs缓冲液中，将其置于37℃水浴锅2h后测定各离心管中噬菌体的效价。试验设3个平行。由图3e可知，噬菌体在ph 3～12时均保持稳定的滴度即高活性，而在ph 2和ph 13时，效价基本降为0，说明强酸强碱直接破坏噬菌体的活性。
[0092]
实施例3沙门氏菌噬菌体pu29纳米磁珠的制备
[0093]
1.噬菌体活化
[0094]
从-80℃取出保存的噬菌体pu29储存液，100μl活化后的宿主菌菌悬液(108cfu/ml)和100μl噬菌体保存液加入15ml lb培养基，放置于37℃、180r/min的恒温培养箱中培养16h左右。在8000r/min、4℃的离心20min。使用0.22μm微孔滤膜过滤，过滤液即为噬菌体原液，采用双层平板法测定噬菌体滴度，得到10
10
pfu/ml的噬菌体pu29，存放于4℃备用。
[0095]
2.nhs/edc活化羧基化磁珠
[0096]
1)将直径为200nm的羧酸修饰的磁珠经超声分散充分混匀后，得到分散磁珠，
[0097]
2)取100μl分散磁珠到1.5ml离心管中，置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，保留磁珠；加入200μl 2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)溶液到上述离心管中，混匀置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，重复该步骤1次，加入n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)(100μl，20mg/ml)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)(200μl，20mg/ml)来活化磁珠上的羧基；
[0098]
3)活化后的磁珠在37℃下以180r/min的速度垂直混合30min，然后用100μl预冷的磷酸盐(pbs)缓冲液清洗磁珠3次，以除去多余的nhs和edc，得到活化的羧基磁珠mbs。
[0099]
上述噬菌体pu29与活化的羧基磁珠偶联方法如下：
[0100]
1)将200μl 1.0
×
10
10
pfu/ml的噬菌体pu29与1mg活化的羧基化磁珠在4℃下过夜，
[0101]
2)用200μl磷酸盐吐温缓冲液(pbst)洗涤磁珠两次，以除去多余的噬菌体。然后将phagepu29-mbs偶联物重新悬浮在1ml含3％牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(pbs)中，在37℃下振荡(180r/min)30min，以阻断残留位点。清洗phagepu29-mbs偶联物两次，以除去残留的阻断缓冲液；
[0102]
3)最后，将phagepu29-mbs偶联物重悬于含1.5％牛血清白蛋白(bsa)的pbs(ph 7.4)中，4℃保存直至使用，得到含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液。
[0103]
实施例4沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs使用条件的优化
[0104]
1.噬菌体pu29与磁珠偶联时间的优化
[0105]
1)将200μl 1.0
×
10
10
pfu/ml的噬菌体pu29与1mg活化后的mbs在37℃下分别振荡(180r/min)30min、2h、4h、6h以及在4℃下过夜偶联；
[0106]
2)用200μl pbst洗涤phagepu29-mbs两次，以除去多余的噬菌体。然后将偶联物phagepu29-mbs重新悬浮在1ml含5％牛血清白蛋白(bsa)的pbs中，在37℃下振荡(180r/min)30min，以阻断残留位点。偶联物phagepu29-mbs被清洗2次，以除去残留的阻断缓冲液。随后对phagepu29-mbs进行10倍梯度稀释；
[0107]
3)最后，采用双层平板法取用10μl上述5个偶联时间的phagepu29-mbs稀释液在铺满沙门氏菌的平板上点样，观察噬菌斑的形成。
[0108]
2.沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs最佳使用量的确定
[0109]
取10μg、25μg、50μg、75μg、100μg、200μg的phagepu29-mbs，分别加入到100μl细菌培养液中(106cfu/ml)，37℃作用20min后，将其放置在磁力架上5min，使得磁珠充分与液体分离，采用平板计数法测定上清液中的菌量。
[0110]
3.沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs最佳捕获时间的优化
[0111]
取25μg phagepu29-mbs，加入到100μl细菌培养液中(106cfu/ml)，37℃作用，设置不同时间组，每5min取一次样，共测定30min，将不同作用时间的管子放置在磁力架上2～3min，使得磁珠充分与液体分离，采用平板计数法测定上清液中的菌量。
[0112]
4.沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs最佳反应温度的确定
[0113]
取25μg phagepu29-mbs，加入到100μl细菌培养液中(106cfu/ml)，分别在4℃、25℃、37℃作用20min后，将其放置在磁力架上2～3min，使得磁珠充分与液体分离，采用平板计数法测定上清液中的菌量。
[0114]
结果如图5所示，当加入25μg phagepu29-mbs时，在37℃下捕获时间为20min时，捕获效率达到最高(70％以上)。
[0115]
实施例5沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs灵敏度评估
[0116]
取25μg phagepu29-mbs，按照上述操作步骤分别加入到不同菌液浓度的沙门氏菌中(101、102、103、104、105、106、107、108、109cfu/ml)进行富集分离后，取上清液，采用平板计数法测定上清液中的菌量。
[0117]
结果见图6所示，对于109cfu/ml的捕获效率可达67.41％。当依次加入梯度稀释至103cfu/ml的菌液过程中，随着菌液浓度的梯度降低，phage pu29-mbs的捕获效率不断增
长，当加入100μl 4.5
×
103cfu/ml浓度的菌液时，其捕获率最高，可达83.93％。在phagepu29-mbs中加入100μl 4.5
×
102cfu/ml的宿主菌液时，测得上清液的菌量为1.9
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102cfu/ml，捕获效率为57.78％。在加入最低菌量100μl 45cfu/ml的条件下，phagepu29-mbs仍能捕获25cfu/ml的宿主细菌，因此phagepu29-mbs偶联物对宿主细菌cvcc c519有良好的前处理富集效果。
[0118]
实施例6富集分离沙门氏菌的试剂盒及其方法
[0119]
富集分离沙门氏菌的试剂盒包括含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液，阴性对照品、阳性对照品和pbs缓冲溶液。
[0120]
其中，含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液，且含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的pbs缓冲液中，pbs的摩尔浓度为0.05mol/l，牛血清白蛋白(bsa)的质量体积浓度为15g/l，
[0121]
每毫升pbs缓冲液中，沙门氏菌phagepu29-mbs偶联物的含量为2mg。
[0122]
阴性对照品为含有bsa的pbs缓冲液，其中，牛血清白蛋白(bsa)的质量体积浓度(m/v)为15g/l，
[0123]
pbs缓冲液摩尔浓度为0.05mol/l；
[0124]
阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鸡白痢沙门氏菌cvcc c519。
[0125]
利用上述试剂盒对样品材料富集分离沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
[0126]
1.当样品中含有沙门氏菌时，按样品:偶联物phagepu29-mbs＝1:4(m/v)的比例在样品加入偶联物phagepu29-mbs，于180rpm转速的摇床上，37℃条件作用20min；
[0127]
2.将样品置于磁力架上2～3min使磁珠充分吸附后，采用平板计数法测定上清液中的菌量，按照下述公式，计算捕获率：
[0128][0129]
其中，n0是初始样品中存在的沙门氏菌菌液浓度(cfu/ml)，na是未与颗粒结合的沙门氏菌菌液浓度(cfu/ml)。
[0130]
实施例7沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs特异性评估
[0131]
按照上述使用方法，使用肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌，对沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs的捕获能力进行评估。
[0132]
结果见图7所示：沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs可以特异性捕获不同血清型的沙门氏菌，但是对其他属的细菌不具有捕获能力。
[0133]
实施例8沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs在不同基质中富集分离沙门氏菌
[0134]
将鸡白痢沙门氏菌cvcc c519接种到lb培养基中，并在37℃下以180r/min，过夜振荡。将培养完成的沙门氏菌在8000rpm，4℃下离心20min，弃去上清液，分别使用lb培养基、pbs、5％(15％)脱脂牛奶或5％(15％)全脂牛奶重悬菌体，并调整菌液浓度。
[0135]
将沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs(25μg)加入到含有103或是106cfu/ml沙门氏菌的lb培养基、pbs、5％(15％)脱脂牛奶或5％(15％)全脂牛奶的样本中。噬菌体pu29-mbs在37℃下以180rpm的速度孵育20min。磁分离后，用pbs(ph 7.4)洗涤偶联
物phagepu29-mbs 3次。在la固体培养基上用平板计数法计算上清液中的鸡白痢沙门氏菌的浓度，按照上述计算公式ce计算捕获率。
[0136]
结果见图8所示：phagepu29-mbs对脱脂牛奶的整体富集效果最佳，当在5％脱脂牛奶中加入100μl 3.77
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103cfu/ml的菌液时，经过磁分离后测得的上清液菌量为2.67
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102cfu/ml，捕获率达到最大值，为92.92％。在lb中富集宿主菌的效率较低，当对100μl 3.77
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103cfu/ml的菌液进行富集后，捕获效率为75.90％，对100μl 3.77
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106cfu/ml菌液的捕获率相比之下有所下降，为63.98％。然而在从市场购买的全脂奶粉配制成的5％及15％牛奶中，phagepu29-mbs对宿主菌c519的富集效率明显降低，在15％全脂牛奶中加入100μl3.77
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106cfu/ml的菌液后，经过37℃振荡20min的富集作用，phage pu29-mbs的捕获率最低，仅达到51.69％。沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物phagepu29-mbs在pbs、lb培养基、不同浓度的脱脂牛奶和全脂牛奶中能够高效的捕获到沙门氏菌，达到分离富集沙门氏菌的目的，极大程度下缩短了沙门氏菌前处理分离富集的时间。
[0137]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。