番茄SlBTB19基因、蛋白及其在提高植物耐低温能力中的应用

番茄slbtb19基因、蛋白及其在提高植物耐低温能力中的应用
技术领域
1.本技术涉及基因工程及分子生物学领域，尤其涉及一种番茄slbtb19基因、蛋白及其在提高植物耐低温能力中的应用。


背景技术：

2.温度对作物的生长发育至关重，直接影响到作物的产量和品质。我国各地冬春季节的冷害、设施环境中早晚的低温威胁极大地影响了番茄等喜温作物的光合作用，限制了我国蔬菜的生产和供应。冷害会导致植株生长受到抑制，膜脂相变，代谢紊乱，导致果实产量品质下降，造成严重的经济损失。因此探究蔬菜作物在低温响应及信号传导过程中的关键基因，并利用现代分子技术手段提高蔬菜作物对低温的抗性具有非常重要的意义。
3.番茄(solanum lycopersicum l.)起源于南美洲的安第斯山脉，据考证明代时，中国的栽培番茄最早通过西洋传教士从欧洲传入，最初被人们作为观赏性食物，后来才逐渐对其果实进行食用。自上世纪50年代初以来，番茄产业发展迅速，如今已经成为人们家中常备的果菜种类。从研究角度来看，番茄为喜温植物，对低温敏感，其基因组小，且易于转化，因此被广泛用于功能基因组学、分子生物学等研究中。以番茄为对象进行研究，不仅能够直接促进番茄产业的发展，也能为探究植物在冷害冻害下的伤害机制及应答机制，提高植物的抗寒性提供理论依据。
4.btb蛋白是一类最早在果蝇中发现的含有保守结构域的蛋白，它参与真核生物生长发育过程的多个阶段，例如向光性生长、抗逆性、泛素、26s蛋白酶体降解过程、离子通道以及细胞循环调控等。btb-taz蛋白(bt蛋白)是属于btb蛋白的一个亚家族，它作为骨架蛋白，可以与不同的底物蛋白互作，参与不同的信号途径中调控植物的生长发育。目前关于bt蛋白的研究大多集中于拟南芥、苹果上，如atbt2能够与生长素相关激酶pid1互作，负调控其激酶活性，影响植物体内生长素信号；在苹果中，btb-taz蛋白bt2通过抑制myb1基因的表达显著减少了乙烯、aba、强光、干旱胁迫和机械损伤诱导的花青苷生物合成。这些均说明bt蛋白可能参与植物对逆境胁迫的应答过程。
5.然而关于番茄bt蛋白的研究极少，番茄中bt蛋白在低温胁迫中的作用及调控机制也未见报道。


技术实现要素：

6.鉴于此，本技术实施例提供一种番茄slbtb19基因、蛋白及其在提高植物耐低温能力中的应用。
7.根据本技术实施例的第一方面，提供一种提高番茄耐低温能力的基因，所述基因为番茄slbtb19基因，所述番茄slbtb19基因具有seq id no.1所示的核苷酸序列。
8.根据本技术实施例的第二方面，提供番茄slbtb19基因在提高番茄耐低温能力中的应用，通过基因crispr/cas9技术使得所述番茄slbtb19基因的表达水平下降，所述slbtb19的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.进一步地，通过基因crispr/cas9技术使得所述基因slbtb19发生突变；所述基因crispr/cas9技术具体如下：
10.利用crispr-p网站设计slbtb19基因靶序列，合成的靶序列退火后连接到u6-26-sgrna1-slbtb19-sk载体的bbs i位点，然后将新得到的u6-26-sgrna1-slbtb19-sk片段连接到pcambia1301载体的hind iii/kpn i位点，构建出番茄slbt19基因crispr表达载体；其中，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no:3所示；
11.将番茄slbt19基因crispr表达载体导入宿主细胞中，再利用其侵染目的植株，筛选阳性转基因植株，获得耐低温的转基因植株。
12.进一步地，所述番茄slbt19基因crispr表达载体为具有35s启动子的表达载体。
13.进一步地，所述35s启动子的表达载体为载体pcambia1301。
14.进一步地，基因crispr表达载体质粒为pcambia1301-u6-26-sgrna1-slbtb19-35s-cas9sk。
15.进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。
16.进一步地，所述农杆菌为gv3101。
17.根据本技术实施例的第三方面，提供一种提高番茄耐低温能力的蛋白，所述蛋白为番茄slbtb19蛋白，所述番茄slbtb19蛋白具有seq id no:2所示的氨基酸序列。
18.本技术的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
19.由上述实施例可知，本技术通过基因手段构建番茄slbtb19基因敲除植株，调控所述基因slbtb19的表达水平来研究其对番茄低温抗性的调控机制，结果发现，slbtb19基因敲除植株的低温抗性增强。本发明为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究番茄植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。
20.本发明首次构建了番茄slbt19基因敲除的转基因植株，并进行功能研究。通过低温处理实验，发现slbtb19基因在番茄耐低温胁迫中起到负向调控的作用。
21.应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本技术。
附图说明
22.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本技术的实施例，并与说明书一起用于解释本技术的原理。
23.图1为本技术实施例中slbtb19基因敲除番茄株系的sgrna序列的测序结果；
24.图2为本技术实施例中野生型和slbtb19 crispr/cas9基因敲除植株在低温处理6天后的表型；
25.图3为本技术实施例中野生型和slbtb19 crispr/cas9基因敲除植株在低温处理6天后的相对电导率；
26.图4为本技术实施例中野生型和slbtb19 crispr/cas9基因敲除植株在低温处理6天后的psii最大光化学效率(fv/fm)变化。
27.图5为本技术实施例中野生型和slbtb19 crispr/cas9基因敲除植株在低温处理6h抗冷基因表达水平的变化，其中a为番茄cbf1基因的表达水平，b为番茄cbf2基因的表达
水平，c为番茄cbf3基因的表达水平。
具体实施方式
28.这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本技术相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本技术的一些方面相一致的装置和方法的例子。
29.在本技术使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本技术。在本技术和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
30.实施例1：
31.slbtb19 crispr/cas9基因敲除载体的构建及slbtb19 crispr/cas9基因敲除植株的获得：为探究slbtb19缺失对番茄耐低温能力的影响，我们设计slbtb19的靶基因序列，通过酶切连接构建pcambia1301-u6-26-sgrna1-slbtb19-35s-cas9sk载体，利用crispr/cas9技术敲除slbtb19来进行研究。
32.首先，利用crispr-p网站((http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr)设计slbtb19基因的靶序列sgrna1:5
’‑
gggaagggtgtacgagcgta-3’。将合成的sgrna1序列(单链)进行退火，形成双链sgrna1，同时其两端具有bbsi限制性内切酶酶切位点。将形成的sgrna1与bbsi限制性内切酶酶切过的atu6-26sk载体进行连接，提取阳性质粒备用，命名为u6-26-sgrna1-slbtb19-sk。利用kpn i与sal i限制性内切酶同时对u6-26-sgrna1-slbtb19-sk和35s-cas9sk载体进行双酶切，将各自酶切产物回收并将酶切过的u6-26-sgrna1-slbtb19片段连接到同样酶切过的35s-cas9sk载体上。菌液pcr检测引物为，u6-26-f：5'-gacggccagtgaattgta-3'，u6-26-r：5'-tacgctcgtacacccttccc-3'，测序验证阳性克隆，提取阳性质粒备用，命名为u6-26-sgrna1-slbtb19-35s-cas9sk。利用kpn i与xba i限制性内切酶同时对u6-26-sgrna1-slbtb19-35s-cas9sk和pcambia1301载体进行双酶切，u6-26-sgrna1-slbtb19-35s-cas9sk回收约6kb的条带，即u6-26-sgrna-slbtb19-35s-cas9片段，连到酶切过的pcambia1301载体上。连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取单菌落，于含50mg/l卡那霉素(kan)的液体lb培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。在pcambia1301载体的5’端设计引物进行菌液pcr检测(～550bp)，上下游引物分别为，u6-26-cas9-f：5'-gctcgtatgttgtgtggaat-3'，u6-26-cas9-r：5'-tacgctcgtacacccttccc-3'。测序验证阳性克隆，提取阳性质粒备用，命名为pcambia1301-u6-26-sgrna1-slbtb19-35scas9sk。通过电击法将阳性质粒转入农杆菌gv3101，与甘油1:1混合，-80℃保存。
33.上述载体利用“叶盘法”通过gv3101农杆菌侵染野生型(ailsa craig)番茄子叶，获得转化pcambia1301-u6-26-sgrna1-slbtb19-35s-cas9sk敲除载体的抗性芽系，移栽后获得相应植株。最终，得到slbtb19 crispr/cas9基因敲除株系13个。提取株系#1和#2dna进行测序，结果显示，株系#1缺失10bp突变，株系#2增加1bp突变(图1)。
34.实施例2：slbtb19 crispr/cas9基因敲除植株耐低温能力检测
35.试验选用的番茄品种为野生型ailsa craig和实施例1中所得的slbtb19crispr/
cas9株系#1和#2，将种子播种于盛满3：1草炭和蛭石复合栽培基质的塑料盆中，出苗后按照基质水分情况浇水保持基质湿润，整个过程浇霍格兰营养液，待四叶一心时进行低温处理，处理温度为4℃。
36.试验共设6个处理：1)wt常温组；2)slbtb19 crispr/cas9#1常温组；3)slbtb19 crispr/cas9#2常温组；4)wt低温组；5)slbtb19 crispr/cas9#1低温组；6)slbtb19 crispr/cas9#2低温组。低温处理时间为6d。低温处理结束后进行表型拍摄、相对电导率测定和光系统ii最大光化学效率测定。
37.光系统ⅱ最大光化学效率具体测定方法为：将植株置于暗环境适应30分钟后，使用叶绿素荧光成像仪(imag-pam；heinz walz，germany)照射检测光(《0.5μmol m-2
s-1
)，测得最小荧光fo，再照射饱和脉冲光(4000μmol m-2
s-1
)，测得最大荧光fm。
38.荧光参数计算方法：psⅱ最大光化学效率(fv/fm)＝(fm-fo)/fm。
39.植株相对电导率测定方法为：将处理结束后的番茄叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉)，快速称取鲜样3份，每份0.1g，分别置于装有10ml去离子水的刻度离心管中，盖上盖子置于室温摇床中浸提2h。用电导仪测定浸提液电导r1.然后沸水浴加热15min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导r2。相对电导率＝r1/r2*100％.
40.结果显示，在低温条件下，与野生型相比，slbtb19 crispr/cas9植株表现出抗冷的表型(图2)、更低的电导率(图3)、更高的fv/fm(图4)和cbf基因的表达(图5)，这说明slbtb19基因敲除后能够显著提高番茄对低温的耐受能力。
41.本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的内容后，将容易想到本技术的其它实施方案。本技术旨在涵盖本技术的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本技术的一般性原理并包括本技术未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本技术的真正范围和精神由权利要求指出。
42.应当理解的是，本技术并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本技术的范围仅由所附的权利要求来限制。