基于坏死性凋亡相关基因组合构建的模型在制备预测低级别胶质瘤预后产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及基于坏死性凋亡相关基因组合构建的模型在制备预测低级别胶质瘤预后产品中的应用。


背景技术：

2.胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，据美国脑肿瘤注册中心统计，胶质瘤约占所有中枢神经系统恶性肿瘤的80％。who中枢神经系统分类将胶质瘤分为whoi-iv级，i、ⅱ级为低级别，ⅲ、iv级为高级别。低级别胶质瘤(low grade glioma,lgg)虽然只占20％,其治疗方案的选择，受诸多因素影响。低级别胶质瘤具有侵袭性生长、对放化疗耐药等恶性生物学特征，有发展为高级别胶质瘤的趋势。随着对其研究的逐渐深入，循证医学证据不断积累，尤其是分子病理诊断在临床实践中的应用，各权威指南对低分级脑胶质瘤临床诊疗方案的推荐均做出相应更新，同时因为对低分级脑胶质瘤的研究还很不深入，因此临床诊疗的许多环节还存在争议。因此，建立一种有效的低级别胶质瘤预后评估模型用于lgg患者预后和免疫治疗反应的临床预测是很有必要的。
3.近年来，坏死性凋亡的信号通路得到了广泛的研究。坏死性凋亡是一种依赖于ripk1和ripk3激酶活性的细胞死亡模式。坏死性凋亡与多种癌症密切相关，包括低级别胶质瘤，其形成受坏死小体、坏死凋亡小体等一系列因素调控。bid在细胞凋亡过程中起主要作用，并与特定类型胃癌的生长有关。mapk9在nsclc组织的正常组织中表达上调，circrnf20通过激活mapk9加速非小细胞肺癌进展。yipf2通过增强tnfrsf10b向非小细胞肺癌细胞质膜的再循环来促进细胞凋亡，然而这些基因在lgg中的应用还未见报道。


技术实现要素：

4.针对上述情况，本发明之目的在于提供基于坏死性凋亡相关基因(necsig)组合构建的模型在制备预测低级别胶质瘤(lgg)预后产品中的应用。
5.其解决的技术方案是：
6.基于坏死性凋亡相关基因组合构建的模型在制备预测低级别胶质瘤预后产品中的应用。
7.进一步的，所述坏死性凋亡相关基因组合包括bid、h2afy2、mapk9、tnfrsf10b；所述bid、h2afy2、mapk9、tnfrsf10b的序列为sequencelisting所示。
8.进一步的，所述应用是通过检测所述坏死性凋亡相关基因组合的表达水平，从而预测低级别胶质瘤预后和指导临床应用。
9.进一步的，所述检测采用的试剂包括特异性扩增坏死性凋亡相关基因的上下游引物或者特异性识别坏死性凋亡相关基因的探针；所述上下游引物为sequence listing所示；所述产品包括试剂盒和芯片。
10.一种预测低级别胶质瘤预后的产品包括检测离体低级别胶质瘤组织样本中坏死
性凋亡相关基因：bid、h2afy2、mapk9、tnfrsf10b表达水平的试剂。
11.进一步的，采用所述产品检测坏死性凋亡相关基因的表达水平，使用风险评分公式进行风险评分；其中，n为坏死性凋亡相关基因的数量，βi为坏死性凋亡相关基因的系数，expofmrna为纳入风险评分系统的基因表达水平；所纳入组合的4个坏死性凋亡相关基因：bid、h2afy2、mapk9、tnfrsf10b的系数分别为
–
0.073、-0.047、-0.071、0.089；预测低级别胶质瘤预后情况时，风险评分临界值(0.87)将患者分为高风险组和低风险组。
12.进一步的，采用以上所述风险评分公式的构建方法获得的预测低级别胶质瘤预后模型为：风险评分＝(-0.073
×
bid表达水平)+(-0.047
×
h2afy2表达水平)+(-0.071
×
mapk9表达水平)+(0.089
×
tnfrsf10b表达水平)；当风险评分大于0.87092时，患者为高风险患者；当风险评分小于0.87042时，患者为低风险患者。
13.进一步的，根据cox回归分析得到独立临床因素，结合风险评分模型，绘制列线图，评估患者的预后生存率并制定个性化治疗方案。
14.由于以上技术方案的采用，本发明具有如下优点；
15.本发明将坏死性凋亡相关基因：bid、h2afy2、mapk9、tnfrsf10b作为检测靶标，构建的预后模型预测性能良好；构建结合坏死性凋亡相关基因风险评估模型和临床因素的列线图对生存率具有更高的预测性能,对模型中的高风险和低风险在免疫浸润方面的差异比较和预后模型对预后治疗的用药指导有望将基于坏死性凋亡相关基因构建的模型用于lgg患者预后和免疫治疗反应的临床预测。
附图说明
16.图1是预后相关的坏死性凋亡相关基因及差异基因富集分析图；其中，a为差异基因分析图，b为差异基因表达分析图，c-d为差异基因富集分析图；
17.图2是风险模型的预后价值分析图；其中，a为单因素cox分析差异基因与生存的关系图，b为基于每个样本的风险评分的风险曲线图，c为基于每个样本的生存状态的散点图，d为4个与坏死性凋亡相关的mrna在高危和低危组中的表达热图，e为高风险和低风险组的kaplan-meier曲线图，f为1,3,5,7,9年时间依赖性roc的auc曲线图；
18.图3是lgg患者预后的单多因素cox回归分析图；其中，a为单因素cox回归森林图，b为多因素cox回归森林图，c为5年os的时间依赖性roc曲线图；
19.图4是将lgg患者根据a为年龄，b为生存状态，c为分期，d为放射治疗，e为用药治疗的亚组中，necsig风险评分图；
20.图5是构建结合mrna的风险评分系统的列线图，其中，a为列线图，b-d为3、5、7年的列线图的准确率分析图；
21.图6是高风险和低风险组患者的免疫浸润分析、免疫检查点基因表达图，其中，a为应用timer、cibersort、quantiseq、mcpcounter、xcell、epic算法六种算法分别量化高风险和低风险组lgg肿瘤组织中免疫细胞的活性或富集水平图，b为高风险和低风险组之间患者免疫检查点基因表达量箱线图；
22.图7是高风险和低风险组对免疫细胞亚群的相关性评分图，其中，a为免疫细胞评
分，b为免疫功能评分，c为免疫细胞亚型基因表达量，d为免疫浸润结果图；
23.图8.a-e是低风险组患者药物敏感性检测结果图，其中，a为硼替佐米(bortezomib)，b为环巴胺(cyclopamine)，c为达沙替尼(dasatinib)，d为雷帕霉素(rapamycin)，e为罗斯科维汀(roscovitine)，f为高风险组患者和低风险组患者的tide评分图。
具体实施方式
24.有关本发明的前述及其他技术内容、特点与功效，在以下配合参考附图1-8对实施例的详细说明中，将可清楚的呈现。以下实施例中所提到的结构内容，均是以说明书附图为参考。
25.实施例1
26.筛选用于lgg预后预测的坏死性凋亡相关基因及模型构建
27.(一)患者信息获取：从thecancergenomeatlas(tcga)网站下载了低级别胶质瘤rna测序数据(rna-seq)和相应的临床资料，包括年龄、性别、分期、总体生存时间和生存状态。为了减少统计偏移，没有生存信息或生存时间小于30天的患者被排除在进一步的评估中，经过筛选，tcga数据库中的529例lgg患者最终纳入分析。
28.(二)筛选预后相关的坏死性凋亡相关基因，作为预后生物标记物或构建预后模型：从kegg收集坏死性凋亡相关基因，根据tcga中lgg的可用mrna表达数据，检索出161个坏死性凋亡相关基因。通过比较肿瘤组织和正常组织，提取的161个坏死性凋亡相关基因中有12个基因上调，13个基因下调(图1a，表s1，设定差异筛选标准为:|logfc|＞1和p＜0.001)。箱线图显示了每个差异基因在正常组织和肿瘤组织中的表达情况(图1b)。然后进行go和kegg富集分析(图1c-1d)。将绝对相关系数r≥0.4和p＜0.001的坏死性凋亡相关基因定义为低级别胶质瘤相关的坏死性凋亡相关基因，然后采用单因素cox回归分析筛选获得10个与总生存期(os)显著相关的低级别胶质瘤相关坏死性凋亡相关基因，分别为pygl、tnfrsf10b、ifnar2、casp1、il1a、tlr3、bid、mapk9、h2afy2、hist3h2a(图2a)。
29.(三)预后模型的构建和性能验证：
30.将纳入完整临床资料的低级别胶质瘤患者做预后分析：首先，采用(lasso)和cox回归分析10个与总生存期(os)显著相关的坏死性凋亡相关基因来确定最佳候选坏死性凋亡相关基因构建预后模型，最终获得了包含4个坏死性凋亡相关基因(bid、h2afy2、mapk9、tnfrsf10b)用于构建最优模型。根据该模型中各低级别胶质瘤相关坏死性凋亡相关基因的系数和表达量，计算患者的风险评分。公式如下：(n为坏死性凋亡相关基因的数量，βi为坏死性凋亡相关基因的系数，expofmrna为纳入风险评分系统的基因表达水平)。具体计算方法为风险评分＝(-0.073
×
bid表达水平)+(-0.047
×
h2afy2表达水平)+(-0.071
×
mapk9表达水平)+(0.089
×
tnfrsf10b表达水平)。然后，通过使用中值风险评分作为阈值，将患者分为高风险组和低风险组，高风险组和低风险组之间生存状态存在明显差异(图2b-c)，基于每个样本的生存状态的热图(图2d)显示了necsig在每个样本中的表达存在差异，采用kaplan-meier(k-m)和log-rank检验比较低风险组和高风险组之间的生存率，k-m生存曲线显示，高风险患者的生存率显着低于低风险患者(p《0.001，图2e)，
用r包“survivalroc”进行roc分析曲线下面积(auc)，评价风险评分预测1、2、3、5、7、9年低级别胶质瘤患者os的特异性和敏感性，结果显示1年、2年、3年、5年、7年和9年的低级别胶质瘤患者os的auc分别为0.839、0.815和0.835、0.688、0.713、0.784(图2f)。此外，通过单变量和多变量cox回归分析来判断低级别胶质瘤相关坏死性凋亡相关基因是否独立于患者os的预后模型。在单变量cox回归分析中，风险评分的hr(95％ci)为1.286(1.240-1.354)(p《0.001，图3a)，在多变量cox回归分析中为1.234(1.176-1.294)(p《0.001，图3b)，通过风险评分及年龄、性别、肿瘤分期、是否化疗，是否药物治疗预测5年与时间相关生成5年os的roc曲线和auc值临床预后列线图为0.828，高于年龄、性别、肿瘤分期、是否化疗、是否药物治疗的auc值高(图3c)，necsig结合临床病理因素具有较高的预测lgg生存率的能力。
31.(五)预后模型的临床应用价值
32.1.预后模型在不同亚组中的预后价值
33.为了进一步评估necsig的临床应用价值，将lgg患者根据a为年龄，b为生存状态，c为分期，d是否接受放疗，e是否药物分为不同的亚组。necsig的风险评分值在45岁以上组显著高于45岁以下组(图4a，p《0.001)，且该necsig与肿瘤分级程度有关，肿瘤分级3级患者的necsig风险评分显著高于肿瘤分级2级患者(图4b，p《0.001)。死亡患者的necsig风险评分显著高于低风险组的幸存患者(图4c，p《0.001)。接受放疗(图4d，p＝0.004)和药物治疗(图4e，p＝0.037)的患者necsig风险评分高于未接受放疗和药物治疗的患者。
34.2.构建列线图
35.为了开发一种定量方法来预测lgg患者的预后，我们结合临床病理学特征(年龄、性别、肿瘤分级)和necsig的临床适应性列线图，用于估计lgg患者的1、2、3、5和7年生存概率(图5a)。绘制了1年、2年、3年、5年和7年的列线图(图5b-e)，从列线图中可以看出估计的死亡率接近实际死亡率，说明我们的列线图适合临床应用。该列线图可以帮助医生评估患者的预后生存率并制定个性化治疗方案。
36.3.高风险和低风险人群免疫浸润分析、免疫检查点的反应差异
37.免疫系统的细胞彼此相互作用并与肿瘤细胞相互作用，为了开发坏死性凋亡信号通路的潜在生物标志物和治疗靶点以期为lgg患者更好的治疗，我们应用timer、cibersort、quantiseq、mcpcounter、xcell、epic六种算法来分别量化高低风险组lgg肿瘤组织中免疫细胞的活性或富集水平(p《0.05，图6a，表s1)。免疫细胞的比较分析显示，髓树突细胞、普通淋巴祖细胞、巨噬细胞m2、巨噬细胞和中性粒细胞是两个风险组之间排名前5位的不同免疫细胞。鉴于基于检查点的免疫疗法的重要性，我们进一步探讨了两组之间免疫检查点基因表达的差异。发现大多数免疫检查点在高风险组中表达较高，如pdcd-1(pd-1)、ctla4、cd274(p《0.05，图6b)。基于tcga-lgg数据的ssgsea对免疫细胞亚群的相关性分析表明，免疫细胞的评分包括b细胞、cd8+t细胞、dcs、idcs、巨噬细胞、中性粒细胞、nk细胞、pdcs、t辅助细胞、th2细胞、til和treg在低风险组和高风险组之间存在显着差异(p《0.05，图7a)。此外，免疫功能评分包括apc共抑制、apc共刺激、ccr、检查点、溶细胞活性、hla、炎症促进、mhci类、副炎症、t细胞共抑制、t细胞共刺激、i型ifn反应和ii型ifn反应在低风险和高风险组之间存在显着差异(p《0.05，图7b)。免疫细胞和免疫功能的表达在高风险组患者中更高(p《0.05，图7c)。模型中的高风险和低风险在免疫浸润方面存在显着差异，其中免疫浸润型c5的样本最多(p《0.05，图7d)。这些结果表明坏死性凋亡相关基因在一定程度上与
免疫细胞浸润相关，为坏死性凋亡信号通路的潜在生物标志物和治疗靶点提供了信息。
38.实施例2
39.4.预后模型对预后治疗的指导意义
40.使用r中的prrophetic和ggplot2使用wilcoxon符号秩检验对几种高风险和低风险药物(推荐用于低级别胶质瘤治疗的各种抗肿瘤药物的ic50值:硼替佐米、环巴胺、达沙替尼、雷帕霉素和罗斯科维汀的敏感性在组间进行比较分析，结果如图8，低风险评分患者对硼替佐米(p《0.0001)、达沙替尼(p《0.0001)和罗斯科维汀(p《0.0001)(图8a-e)敏感。此外，我们使用肿瘤免疫功能障碍和排斥(tide)来评估两组之间免疫治疗的潜在临床疗效。我们计算了每位患者的tide评分，范围从-0.5-1.23，高风险组患者的tide评分高于低风险组(图8f)。由于较高的tide评分表示抗肿瘤免疫逃逸的可能性较高，从免疫检查点阻断治疗中获益的可能性较小,因此，高风险组患者可能发生免疫逃逸，这也解释高风险组患者对药物的敏感性较低的原因，进而可能为lgg患者术后化疗提供新的治疗方案。
41.以上所述是结合具体实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明具体实施仅局限于此；对于本发明所属及相关技术领域的技术人员来说，在基于本发明技术方案思路前提下，所作的拓展以及操作方法、数据的替换，都应当落在本发明保护范围之内。
42.表s1.25个坏死性凋亡相关基因的差异性表达
43.geneconmeantreatmeanlogfcpvaluefdrbid8.010055617.286971981.1098010240.0011905810.007533686camk2a219.55404831.10969302-2.819140070.0007697930.006142153camk2b56.58668210.07345039-2.4899046220.0004073960.006142153capn210.286382823.295711811.1793286650.0002220630.006142153casp10.788254162.5301475681.6824887470.0127809750.031230597ifna130.0530094160.007358842-2.848697970.0002772820.006142153ifna20.0753838240.006455226-3.5457154040.0004034780.006142153ifna210.109899960.031913427-1.7839554350.0056203530.018013953ifna60.075829740.007831461-3.2754104582.68e-050.003346536ifna80.0224626060.00420875-2.4160616230.0035869780.014011632ifnar21.77824323.6174374461.0245154230.0003688070.006142153il1a1.340149680.414073598-1.694435020.0138667550.03270461il334.403989212.070244181.4545720260.0070057430.021089109h2afy26.449501218.635603281.530802030.0061938240.019355699mapk921.631117.924800123-1.4486612460.000329950.006142153pla2g4d0.0676768840.014017233-2.2714616030.0012515550.007533686pla2g4e0.0140015780.004612635-1.601926240.0042768310.01571255pygl1.677668565.5581484361.7281466380.0051341620.017195761slc25a310.0353093580.009883541-1.8369507090.0010010450.007360627stat42.931609780.638695007-2.1984940040.0017979020.009771209tlr30.381681781.2598829221.722847450.0022744110.011148718
tlr43.31152669.5728524711.5314524290.0164156590.035378574tnfrsf10b2.04085565.6475230271.4684441390.002505120.011400696tead13.192948411.780968091.8834969530.0002351280.006142153hist3h2a8.11201551418.259769561.1705362420.0162855410.035378574