挥发油、其制备方法及用途与流程

1.本技术涉及挥发油，特别是得自积雪草的挥发油，所述挥发油的制备方法及用途，特别是抗病毒用途，以及使用所述挥发油的抗病毒方法。


背景技术：

2.积雪草(centella asiatica(l.)urban)的化学成分复杂，主要有三萜类(如积雪草苷、羟基积雪草苷、波热米苷、参苦尼苷、积雪草酸等)、黄酮类(如槲皮素、山奈酚等)、挥发油类、多炔烯类等。积雪草的药理活性和它的化学成分是紧密相关的。
3.对积雪草的药理学研究主要关注三萜类成分。例如，研究显示，积雪草水提物具有中枢神经系统抑制作用、增强认知能力和记忆力的作用；积雪草三萜提取物具有促进伤口愈合的作用；积雪草苷对皮肤溃疡、瘢痕疙瘩、皮肤淀粉样变性具有疗效；积雪草总苷对皮肤具有抗炎作用；积雪草水提物或积雪草皂苷(积雪草水提物的活性成分)具有抗胃溃疡作用；等等。然而，对于积雪草挥发油的药理学研究较少。有报道显示，积雪草挥发油具有抗抑郁作用。
4.挥发油的提取方法主要包括水蒸汽蒸法、挤压法、有机溶剂萃取法、超声波或微波萃取法、超声波微波协同萃取法等。水蒸汽蒸馏法是是现代工业中提取挥发油最常用的方法，但是耗时较长，挥发油收率较低。挤压法是操作繁琐，收率较低。有机溶剂萃取法能够缩短提取时间，提高挥发油收率，但是易挥发的有机溶剂对人体有害，而且所得的挥发油中易残留有机溶剂，因而具有一定的应用局限性。超声波或微波萃取法以及超声波微波协同萃取法，虽然提取过程简单，但依然存在挥发油收率不高和溶剂残留的问题。
5.目前文献报道的用于提取积雪草挥发油的方法都存在收率低、溶剂残留等问题。例如，joshi,v.p.等用水蒸汽蒸馏法提取喜马拉雅山西部的积雪草中的挥发油成分，收率为0.03wt％(joshi v p,kumar n,singh b,et al.chemical composition of the essential oil of centella asiatica(l.)urb.from western himalaya,[j].natural product communications,2007,2(5):587-590.)；oyedeji,o.a.等以索氏提取法提取干燥积雪草全草中的挥发油，收率为0.06wt.％(oyedeji o a,afolayan a j.,chemical composition and antibacterial activity of the essential oil of centella asiatica growing in south africa,[j].pharmaceutical biology,2005,43(3):249-252.)。
[0006]
因此，仍然需要研究和开发积雪草挥发油的新用途以及提取积雪草挥发油的新方法。


技术实现要素：

[0007]
发明人发现，本发明的挥发油，特别是得自积雪草的挥发油(精油)，具有抗病毒作用，具有治疗由病毒引起的疾病或病症，或者抑制环境中的病毒的潜力。
[0008]
在一方面，本技术提供本发明的挥发油。
[0009]
在另一方面，本技术提供用于获得本发明的挥发油的方法。
[0010]
在另一方面，本技术提供包含本发明的挥发油的组合物。
[0011]
在另一方面，本技术提供本发明的挥发油或组合物用于制备抗病毒组合物的用途。
[0012]
在另一方面，本技术涉及用于治疗由病毒引起的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的个体施用有效量的所述挥发油或者包含所述挥发油的组合物。
[0013]
在又一方面，本技术涉及用于抑制或杀灭环境中的病毒的方法，其包括向所述环境施用有效量的所述挥发油或者包含所述挥发油的组合物。
[0014]
所述挥发油如下文所定义，其可以是合成的，或者优选地可得自植物，优选积雪草。
具体实施方式
[0015]
除非另外指明，本文所用的技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
[0016]
在本文中，术语“挥发油”与“精油”可互换地使用，意指合成的或从植物(例如花、叶、茎、根或果实)中提取的两种或更多种挥发性组分的组合或混合物。用于提取的方法包括但不限于水蒸汽蒸馏法、冷压榨法、脂吸法和溶剂萃取法(例如co2萃取法)。
[0017]
挥发油的组分可选自但不限于：反式石竹烯(cas no.87-44-5)、α-律草烯(cas no.6753-98-6)、石竹素(cas no.1139-30-6)、α-蒎烯(cas no.3856-25-5)、β-蒎烯(cas no.127-91-3)、β-榄香烯(cas no.515-13-9)、罗汉柏烯(cas no.470-40-6)、花侧柏烯(cas no.16982-00-6)、香树烯(cas no.25246-27-9)、异丁香烯(cas no.118-65-0)、乙酸癸酯(cas no.112-17-4)、花柏烯(cas no.18431-82-8)、桉叶油醇(cas no.470-82-6)、α-荜澄茄油烯(cas no.17699-14-8)、p-伞花烃(cas no.535-77-3)、α-松油醇(cas no.98-55-5)、芳樟醇(cas no.78-70-6)、d-樟脑(cas no.464-49-3)、马鞭烯酮(cas no.1196-01-6)、冰片(cas no.507-70-0)、左旋乙酸冰片酯(cas no.5655-61-8)、香叶醇(cas no.106-24-1)、柠檬烯(cas no.5989-27-5)、莰烯(cas no.79-92-5)以及它们中任意两种或更多种的组合或混合物。
[0018]
在文中，术语“积雪草”意指伞形科植物积雪草(centella asiatica(l.)urban)，例如其干燥全草。
[0019]
根据本发明的可以得自积雪草的挥发油可以通过水蒸汽蒸馏法或索氏提取法，或优选地通过组合利用co2超临界萃取和分子蒸馏技术，由积雪草得到。
[0020]
本文中所用的术语“个体”是指动物，包括但不限于灵长类动物(如猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、白鼬和类似啮齿动物)、兔形目动物、猪科动物(如猪、小型猪)、马科动物、犬科动物、猫科动物等；以及人。
[0021]
所述“环境”是指所述个体的居住环境、公共场所、生活用品、交通工具等等，包括例如空气或物品与所述个体接触的表面。
[0022]
本文中所用的术语“治疗”是指疾病的完全或部分治愈，包括但不限于选自下列中的一种、或者两种或更多种的组合：减轻或消除引起疾病或病症的病因；改善或消除其病理学改变；减轻或消除其一种或多种症状；延缓或停滞其进展；减轻其严重性；降低其发病率；
减少其复发；以及改善其预后。
[0023]
在本文中，抑制或杀灭病毒包括但不限于降低病毒的数量，减少病毒的复制，降低病毒的活性或毒力，破坏病毒的结构(例如衣壳或核酸)。
[0024]
如文中所使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤，尽管其它未列举的元素或方法步骤不一定存在(即，这些术语也涵盖术语“基本上由
……
组成”和“由
……
组成”)。
[0025]
在第一方面，本技术提供本发明的挥发油。
[0026]
在一些实施方案中，所述挥发油包含选自下列组分中的任意一种、或者任意两种或三种、或优选全部四种的组合：
[0027]
以所述挥发油的总重量计，
[0028]
约25wt％-约36wt％的反式石竹烯；
[0029]
约15wt％-约26wt％的α-律草烯；
[0030]
约12wt％-约25wt％的石竹素；和
[0031]
约6wt％-约17wt％的α-蒎烯。
[0032]
在一些实施方案中，所述挥发油包含下列组分中的任意一种、或者任意两种或三种、或优选全部四种的组合：
[0033]
以所述挥发油的总重量计，
[0034]
约28wt％-约35wt％的反式石竹烯；
[0035]
约18wt％-约25wt％的α-律草烯；
[0036]
约14wt％-约24wt％的石竹素；和
[0037]
约7wt％-约15wt％的α-蒎烯。
[0038]
在一些优选的实施方案中，所述挥发油包含下列组分中的任意一种、或者任意两种或三种、或优选全部四种的组合：
[0039]
以所述挥发油的总重量计，
[0040]
约30wt％-约34wt％(例如约31wt％-约33wt％)的反式石竹烯；
[0041]
约20wt％-约24wt％(例如约21wt％-约23wt％)的α-律草烯；
[0042]
约15wt％-约22wt％(例如约15wt％-约18wt％)的石竹素；和
[0043]
约8wt％-约13wt％(例如约9wt％-约12wt％)的α-蒎烯。
[0044]
在一些进一步的实施方案中，所述挥发油还包含下列组分中的任意一种、任意两种的组合、或所有三种的组合：
[0045]
以所述挥发油的总重量计，
[0046]
约1.5wt％-约5.0wt％的β-榄香烯；
[0047]
约1.5wt％-约5.0wt％的罗汉柏烯；和
[0048]
约1.5wt％-约4.5wt％的花侧柏烯。
[0049]
在一些优选的实施方案中，所述β-榄香烯的量为，以所述挥发油的总重量计，约2.5wt％-约4.0wt％，优选约2.8wt％-约3.5wt％(例如约2.8wt％-约3.2wt％或约2.9wt％-约3.1wt％)。
[0050]
在一些优选的实施方案中，所述罗汉柏烯的量为，以所述挥发油的总重量计，约
2.5wt％-约3.5wt％，优选约2.8wt％-约3.2wt％(例如约2.9wt％-约3.1wt％)。
[0051]
在一些优选的实施方案中，所述花侧柏烯的量为，以所述挥发油的总重量计，约2.4wt％-约3.5wt％，优选约2.6wt％-约3.2wt％(优选约2.6wt％-约3.0wt％或约2.6wt％-约2.9wt％)。
[0052]
在一些进一步的实施方案中，所述挥发油还包含，以所述挥发油的总重量计，约1.5wt％-约3.5wt％的香树烯；或
[0053]
约1.5wt％-约3.5wt％的异丁香烯；
[0054]
或者其组合。
[0055]
在一些优选的实施方案中，所述香树烯的量为，以所述挥发油的总重量计，约1.8wt％-约3.0wt％，优选约2.0wt％-约2.5wt％(例如约2.1wt％-约2.4wt％)。
[0056]
在一些优选的实施方案中，所述异丁香烯的量为，以所述挥发油的总重量计，约1.8wt％-约3.0wt％，更优选约2.0wt％-约2.5wt％的异丁香烯(例如约2.1wt％-约2.4wt％)。
[0057]
在一些进一步的实施方案中，所述挥发油还包含，以所述挥发油的总重量计，约1.2wt％-约3.0wt％的乙酸癸酯；或
[0058]
约1.2wt％-约3.0wt％的花柏烯；
[0059]
或者其组合。
[0060]
在一些优选的实施方案中，所述乙酸癸酯的量为，以所述挥发油的总重量计，约1.4wt％-约2.4wt％，优选约1.6wt％-约2.0wt％(例如约1.7wt％-约1.8wt％)。
[0061]
在一些优选的实施方案中，所述花柏烯的量为，以所述挥发油的总重量计，约1.4wt％-约2.4wt％，优选约1.6wt％-约2.0wt％(例如约1.6wt％-约1.7wt％)。
[0062]
在进一步优选的实施方案中，所述挥发油包含，以所述挥发油的总重量计，
[0063]
约25wt％-约32wt％(例如约31wt％-约32wt％)的反式石竹烯；
[0064]
约18wt％-约22wt％(例如约21wt％-约22wt％)的α-律草烯；
[0065]
约16wt％-约22wt％(例如约16wt％-约22wt％)的石竹素；
[0066]
约8wt％-约12wt％(例如约10wt％-约11wt％)的α-蒎烯(cas no.3856-25-5)；
[0067]
约2.8wt％-约4.0wt％(例如约2.8wt％-约3.0wt％)的β-榄香烯；
[0068]
约2.8wt％-约3.2wt％(例如约2.8wt％-约3.0wt％)的罗汉柏烯；
[0069]
约2.6wt％-约3.2wt％(例如约2.6wt％-约3.0wt％)的花侧柏烯；
[0070]
约2.0wt％-约2.5wt％的香树烯；
[0071]
约1.8wt％-约2.5wt％(例如约2.0wt％-约2.5wt％)的异丁香烯；
[0072]
约1.2wt％-约2.0wt％(例如约1.6wt％-约2.0wt％)的乙酸癸酯；和
[0073]
约1.6wt％-约2.0wt％的花柏烯。
[0074]
在一些进一步的实施方案中，所述挥发油还包含，以所述挥发油的总重量计，约2.0wt％-约5.0wt％的其他组分。
[0075]
在一些实施方案中，所述其他组分选自桉叶油醇、α-荜澄茄油烯、p-伞花烃、β-蒎烯、α-松油醇、芳樟醇、d-樟脑、马鞭烯酮、冰片、左旋乙酸冰片酯、香叶醇、柠檬烯、莰烯，以及它们中的任意两种或更多种的组合。
[0076]
在一些实施方案中，以所述挥发油的总重量计，
[0077]
所述桉叶油醇的量为约0.2wt％-约0.8wt％，优选约0.4wt％-约0.7wt％，更优选约0.5wt％-约0.6wt％；
[0078]
所述α-荜澄茄油烯的量为约0.3wt％-约0.8wt％，优选约0.4wt％-约0.6wt％，更优选约0.4wt％-约0.5wt％；
[0079]
所述p-伞花烃的量为约0.2wt％-约0.9wt％，优选约0.3wt％-约0.6wt％，更优选约0.3wt％-约0.5wt％；
[0080]
所述β-蒎烯的量为约0.1wt％-约1.9wt％，优选约0.2wt％-约1.5wt％；
[0081]
所述α-松油醇、芳樟醇和d-樟脑的量各自为约0.1wt％-约0.3wt％，优选约0.2wt％-约0.3wt％；
[0082]
所述马鞭烯酮、冰片和左旋乙酸冰片酯的量各自为约0.1wt％-约0.3wt％，约0.1wt％-约0.2wt％；
[0083]
所述香叶醇的量为约0.03wt％-约0.10wt％，优选约0.04wt％-约0.09wt％；
[0084]
所述柠檬烯的量为约0.03wt％-约0.20wt％，优选约0.04wt％-约0.18wt％；或
[0085]
所述莰烯的量为约0.03wt％-约0.16wt％，优选约0.04wt％-约0.15wt％。
[0086]
在一些优选的实施方案中，以所述挥发油的总重量计，
[0087]
所述桉叶油醇的量为约0.4wt％-约0.8wt％，优选约0.5wt％-约0.7wt％，更优选约0.5wt％-约0.6wt％；
[0088]
所述α-荜澄茄油烯的量为约0.3wt％-约0.8wt％，优选约0.4wt％-约0.6wt％，更优选约0.4wt％-约0.5wt％；
[0089]
所述p-伞花烃的量为约0.2wt％-约0.6wt％，优选约0.3wt％-约0.5wt％，更优选约0.3wt％-约0.4wt％；
[0090]
所述β-蒎烯的量为约0.1wt％-约0.6wt％，优选约0.2wt％-约0.5wt％；
[0091]
所述α-松油醇、芳樟醇和d-樟脑的量各自为约0.1wt％-约0.3wt％，优选约0.2wt％-约0.3wt％；
[0092]
所述马鞭烯酮、冰片和左旋乙酸冰片酯的量各自为约0.1wt％-约0.3wt％，约0.1wt％-约0.2wt％；或
[0093]
所述香叶醇、柠檬烯和莰烯的量各自为约0.03wt％-约0.06wt％，优选约0.04wt％-约0.06wt％。
[0094]
在一些特别优选的实施方案中，所述挥发油包含下表1所示的组分：
[0095]
表1
[0096]
[0097][0098]
在一些实施方案中，上文所述的每一种挥发油组分以及所述挥发油可以是合成的。
[0099]
在一些优选的实施方案中，上文所述的挥发油可得自植物，优选积雪草(即，积雪草精油)；甚至更优选地，所述挥发油包含下表2或表3所示的组分：
[0100]
表2
[0101][0102][0103]
在第二方面，本技术提供用于获得本发明的挥发油的方法。
[0104]
在一些实施方案中，所述挥发油可通过组合利用co2超临界萃取和分子蒸馏技术的提取方法，由积雪草得到。所述方法可以包括以下步骤：
[0105]
(1)对经片段化的积雪草茎叶进行超临界二氧化碳萃取，得到粗制的油状产物；
[0106]
(2)对步骤(1)中得到的油状产物进行第一分子蒸馏操作，收集第一馏出液，得到第一积雪草精油部分；
[0107]
(3)在与所述第一分子蒸馏操作不同的条件下，对所述第一分子蒸馏操作后的残余物进行第二分子蒸馏操作，收集第二馏出液，得到第二积雪草精油部分；和
[0108]
(4)合并所述第一和第二积雪草精油部分。
[0109]
在一些实施方案中，步骤(1)包括：
[0110]
(1-i)将所述经片段化的积雪草茎叶投入超临界二氧化碳萃取系统的萃取装置中，形成填充层；
[0111]
(1-ii)在约35至60℃的温度和约15至40mpa的压力下，使超临界二氧化碳流体由所述萃取装置的底部向上透过所述填充层以对所述经片段化的积雪草茎叶进行萃取；以及
[0112]
(1-iii)使步骤(1-ii)中得到的流体进入分离装置中，得到所述粗制的油状产物。
[0113]
优选地，在过程(1-ii)中，所述温度为约40至60℃，例如约45至55℃或约50至55℃。
[0114]
优选地，在过程(1-ii)中，所述压力为约16至38mpa，例如约18至36mpa或约20至32mpa。
[0115]
在一些实施方案中，与所述第一分子蒸馏操作相比，所述第二分子蒸馏操作在不同的温度，优选更高的温度下进行。在一些实施方案中，与所述第一分子蒸馏操作相比，所述第二分子蒸馏操作在不同的真空度，优选更低的真空度下进行。在另一些实施方案中，与所述第一分子蒸馏操作相比，所述第二分子蒸馏操作在不同的温度和不同的真空度，优选更高的温度和更低的真空度下进行。通过所述第二分子蒸馏操作，进一步提高了积雪草精油的收率。
[0116]
在一些实施方案中，所述第一分子蒸馏操作是在约80至170pa的真空度和约80至120℃的温度下进行的。优选地，所述真空度为约100至160pa，例如约120至140pa。优选地，所述温度为约90至120℃，例如约100至110℃。
[0117]
在一些实施方案中，所述第二分子蒸馏操作是在约3至15pa的真空度和约150至200℃的温度下进行的。优选地，所述真空度为约3至12pa，例如约5至8pa或约6至10pa。优选地，所述温度为约160至190℃，例如约170至180℃。
[0118]
任选地，所述步骤(2)和(3)各自包括将所述馏出液脱水，或者所述步骤(4)包括将合并的馏出液脱水。所述脱水可以利用干燥剂来进行。可以利用的干燥剂包括例如无水硫酸钠、无水硫酸钙、无水硫酸镁和无水氯化钙。脱水之后，可以通过过滤除去所述干燥剂，得到所述挥发油。
[0119]
在一些实施方案中，以步骤(1)中所述的经片段化的积雪草茎叶的重量计，所述挥发油的收率为约0.08至0.10wt％。
[0120]
发明人还发现，在步骤(1)中通过超临界二氧化碳萃取得到的油状产物具有较高的粘度，呈果冻状，流动性差。通过所述分子蒸馏操作得到的挥发油则具有适合的粘度和良好的流动性，流动顺畅，流速均匀。这种良好的流动性在例如挥发油的制剂方面提供优势。
[0121]
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：
[0122]
(pre-1)在烘干装置中，通过用约35至45℃的温度的热风循环加热，将新鲜的积雪草茎叶烘干，得到干燥的积雪草茎叶；以及
[0123]
(pre-2)将所述干燥的积雪草茎叶片段化。
[0124]
发明人发现，现有的积雪草精油提取方法存在的问题与积雪草原料的采收和加工方法有很大关系，因而在这两方面做了诸多改进。
[0125]
一般而言，由于主要包含在积雪草叶中，因此本技术的方法仅利用积雪草茎叶部分，而不是全草，因而避免了泥土随根混入原料中。
[0126]
现有技术中一般通过将采收的原料直接在太阳下暴晒来烘干所述原料。然而，这样会使部分挥发油在干燥过程中流失，或者由于遇到阴雨天气致使原料发霉而造成原料损失。本技术的方法通过在烘干装置中用约35至45℃的热风循环加热，将新鲜的积雪草茎叶
d virus)，i、ii、iii和iv型人类副流感病毒(hpiv-1、hpiv-2、hpiv-3、hpiv-4)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、风疹病毒(rubella virus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)(包括a类(cva)和b类(cvb)，特别是cvb3)、肠病毒(enterovirus)68-72型(ev 68-72)(特别是肠病毒71型(enterovirus 71))及其组合。
[0142]
在一些更优选的实施方案中，所述病毒选自：甲型h1n1病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、柯萨奇病毒b3(cvb3)、肠病毒71型(ev 71))及其组合。
[0143]
在另一些实施方案中，所述病毒为dna病毒，特别是双链dna病毒。在一些优选的实施方案中，所述病毒选自疱疹病毒(herpes virus)，例如单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)和水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，vzv)。在一些更优选的实施方案中，所述病毒为vzv-3。
[0144]
所述挥发油、包含所述挥发油的组合物或所述抗病毒组合物可用于医疗用途，例如，在一些实施方案中，用作药物组合物，用于预防或治疗有此需要的个体的由任意一种或多种上文所述的病毒引起的疾病或病症。
[0145]
所述疾病或病症可以选自：流感、上呼吸道感染、呼吸道合胞病毒肺炎、风疹、胃肠型感冒、急性胃肠炎、手足口病、疱疹性咽峡炎、非麻痹性类脊髓灰质炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、病毒性心肌炎、病毒性心包炎、流行性肌痛或胸痛、急性无力肢体麻痹(acute flaccid paralysis)、急性出血性结膜炎(acute hemorrhagic conjunctivitis)、肌肉僵直(myoclonic jerk)、水痘、带状疱疹、重症急性呼吸综合征和中东呼吸综合征。
[0146]
所述药物组合物可以通过吸入、局部、经皮或口服施用。所述药物组合物的“有效量”可以是，以所述挥发油的体积计，每单一剂量约0.1-5.0ml的所述挥发油，例如约0.3-4.9ml、约0.5-4.7ml、约1.0-4.5ml、约1.5-4.0ml、约2.0-3.5ml或约2.5-3.0ml。所述有效量一般取决于多种因素，包括所治疗的个体性别、年龄、体重、一般健康情况、病症或病况的严重性、施用的速率及处方医师的判断，因而可以变化。所述药物组合物用于每日一次、二次、三次或更多次施用。
[0147]
在另一些实施方案中，所述挥发油、根据第四方面的组合物、或所述抗病毒组合物用于抑制或杀灭环境中的所述病毒，例如用作消毒剂。为此目的，所述挥发油、根据第四方面的组合物、或所述抗病毒组合物的“有效量”可以是上文所述的量，也可以是更高或更低的量，取决于所述环境的一些因素，例如空间大小、封闭程度，等等。所述抗病毒组合物用于每日一次、二次、三次或更多次施用，或者连续施用。
[0148]
所述抗病毒组合物(包括所述药物组合物)还可以包含一种或多种生理上或药学上可接受的添加剂、载体和/或赋形剂，例如调味剂、芳香剂、防腐剂、包合剂(例如环糊精)、抛射剂及其组合。
[0149]
根据第四方面的组合物、或所述抗病毒组合物(包括所述药物组合物)可以为固体、半固体、液体或气体形式，例如喷雾剂、气雾剂、香氛、香薰剂、香囊、糖浆剂、酏剂或软胶囊的形式。
[0150]
在第八方面，本技术还提供用于治疗由病毒引起的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的个体施用有效量的如上文所述的挥发油、根据第四方面的组合物、或者所述抗病毒组合物。所述病毒以及疾病或病症如上文所述。
[0151]
在第九方面，本技术还提供用于抑制或杀灭环境中的病毒的方法，其包括向所述
环境施用有效量的如上文所述的挥发油、根据第四方面的组合物、或者所述抗病毒组合物。所述病毒如上文所述。
[0152]
有益效果
[0153]
发明人令人惊讶地发现，本发明的挥发油(例如所述积雪草精油)具有优良的抗病毒活性。与诸如水蒸气蒸馏法或索氏提取法的已知方法相比，本发明的用于获得所述挥发油的方法具有多种优势，例如工艺更稳定，更高的提取效率和收率，无有机溶剂残留，更高的安全性和成本效益。而且，本发明的挥发油(例如积雪草精油)具有适合的粘度和良好的流动性。
[0154]
实施例
[0155]
下面通过实施例更详细地例示本发明，但下述实施例并不对本发明构成任何限制，本发明的范围仅由所附权利要求定义。
[0156]
实施例1：
[0157]
超临界二氧化碳萃取
[0158]
取平均长度为约3-5cm的积雪草茎叶的片段10kg，投入超临界二氧化碳萃取系统的萃取罐中，在45-50℃的温度和15-36mpa的压力下，二氧化碳从底部进入萃取罐，向上透过填充层以对颗粒进行萃取2小时。使所得的二氧化碳流体进入分离罐中，在分离罐底部得到0.09kg油状产物，其具有较高的粘度，呈果冻状，流动性差。
[0159]
分子蒸馏
[0160]
将上述油状产物泵入蒸发器中，进行两次蒸馏。第一次分子蒸馏在120pa的真空度和90℃的温度下进行，收集所得的馏出液；第二次分子蒸馏在3～6pa的真空度和170℃的温度下进行，收集所得的馏出液。合并所得的馏出液，加入0.5wt％的食品级无水硫酸钠，搅拌10分钟并静止5h，然后过滤，得到0.0082kg积雪草精油，其具有良好的流动性，流动顺畅，流速均匀。
[0161]
成分分析
[0162]
通过gc-ms(气相色谱-质谱)分析，测得该积雪草精油具有表3所示的组分：
[0163]
表3
[0164][0165][0166]
蒎烯*：在gc-ms分析过程中，得到未分离开的α-蒎烯和β-蒎烯的混合物。
[0167]
实施例2
[0168]
超临界二氧化碳萃取
[0169]
取平均长度为约3-5cm积雪草茎叶的片段10kg，投入超临界二氧化碳萃取系统的萃取罐中，在50-56℃的温度和20-30mpa的温度下，二氧化碳从底部进入萃取罐，向上透过填充层以对颗粒进行萃取2h。使所得的二氧化碳流体进入分离罐中，在分离罐底部得到油状产物0.097kg，其具有较高的粘度，呈果冻状，流动性差。
[0170]
分子蒸馏
[0171]
将上述油状产物泵入蒸发器中，进行两次蒸馏。第一次分子蒸馏在140pa的真空度和100℃的温度下进行，收集所得的馏出液；第二次分子蒸馏在5～8pa的真空度和180℃的温度下进行，收集所得的馏出液。合并所得的馏出液，加入0.5wt％的食品级无水硫酸钠，搅拌10分钟并静止5h，然后过滤，得到0.0095kg积雪草精油，其具有良好的流动性，流动顺畅，流速均匀。
[0172]
该积雪草精油具有与实施例1中制备的积雪草精油类似的组成。
[0173]
实施例3
[0174]
超临界二氧化碳萃取
[0175]
取平均长度为约3-5cm积雪草茎叶的片段10kg，投入超临界二氧化碳萃取系统的萃取罐中，在55-60℃的温度和30-40mpa的压力下，二氧化碳从底部进入萃取罐，向上透过填充层以对颗粒进行萃取2h。使所得的二氧化碳流体进入分离罐中，在分离罐底部得到0.092kg油状产物，其具有较高的粘度，呈果冻状，流动性差。
[0176]
分子蒸馏
[0177]
将上述油状产物泵入蒸发器中，进行两次蒸馏。第一次分子蒸馏在160pa的真空度和120℃的温度下进行，收集所得的馏出液；第二次分子蒸馏在7-10pa的真空度和190℃的温度下进行，收集所得的馏出液。合并所得的馏出液，加入0.5wt％的食品级无水硫酸钠，搅拌10分钟并静止5h，然后过滤，得到0.0089kg积雪草精油，其具有良好的流动性，流动顺畅，流速均匀。
[0178]
该积雪草精油具有与实施例1中制备的积雪草精油类似的组成。
[0179]
实施例4：通过水蒸汽蒸馏法提取积雪草油
[0180]
将晒干的积雪草全草100kg投入到蒸馏罐中。通过从蒸馏罐的底部通入蒸汽(蒸汽温度是100～120℃)进行提取，持续8-10h，得到混合蒸汽。使该混合蒸汽经过冷凝器进行冷凝，将得到的油水混合物经过油水分离器，然后将分离出的油层脱水(0.5wt％的食品级无水硫酸钠)，得到0.032kg积雪草油。
[0181]
实施例5：通过水蒸汽蒸馏法提取积雪草油
[0182]
将烘干的平均长度为3-5cm的积雪草茎叶的片段100kg投入到蒸馏罐中。通过从蒸馏罐的底部通入蒸汽(蒸汽温度是100～120℃)进行提取，持续8-10h，得到混合蒸汽。使该混合蒸汽经过冷凝器进行冷凝，将得到的油水混合物经过油水分离器，然后将分离出的油层脱水(0.5wt％的食品级无水硫酸钠)，得到0.068kg积雪草油，其组分如表4所示：
[0183]
表4
[0184][0185]
蒎烯*：在gc-ms分析过程中，得到未分离开的α-蒎烯和β-蒎烯的混合物。
[0186]
实施例6：积雪草精油的抗病毒研究
[0187]
采用mtt法测定积雪草精油对培养病毒的4种细胞(mdck、hep-2、vero、llc-mk2)的毒性作用，设计合适浓度进行抗病毒试验。采用致细胞病变法(cpe法)进行体外抗病毒药效学试验，评价积雪草精油的对引起胃肠感冒、皮肤溃疡等病症的病毒的作用。
[0188]
1.试验方法
[0189]
1.1细胞培养
[0190]
非洲绿猴肾细胞(vero)、犬肾细胞(mdck)、人喉表皮样癌细胞(hep-2)和恒河猴肾细胞(llc-mk2)(4种细胞均来自武汉普诺赛生命科技有限公司)培养在含10％fbs(美国sciencell公司)的dmem培养基(hyclone公司)中，生长状态良好时，每隔2～3d可进行传代。在净化工作台中弃去培养基，用1
×
pbs清洗2～3次，然后加入适量的0.25％trypsin-edta消化，约2～5min后，待细胞脱落，加入适量的含10％fbs的dmem培养基以终止胰酶的消化作用，吹打成单细胞悬液，转入ep管中，以1000rpm离心5min。弃去培养基，加入新鲜的培养基重悬，按约105/ml的细胞密度接种到新的培养瓶中，放置于37℃、5％co2培养箱中培养。
[0191]
1.2病毒的扩增
[0192]
1.2.1甲型流感病毒(h1n1)：鸡胚扩增
[0193]
h1n1毒株(编号：a/pr/8，由广州呼吸疾病研究所惠赠)接种于9日龄鸡胚尿囊腔进行传代扩增。其具体步骤为：9日龄spf鸡胚经照射后，画出气室及胚胎的位置，在气室中心或远离胚胎侧气室边缘用75％酒精棉球消毒，用钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，随后用注射器针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，并注入0.1～0.3ml的病毒液，拔出针头，用石蜡封孔，于35℃培养48h后收集病毒，标注后于-80℃中短期保存或液氮中长期保存，备用。
[0194]
1.2.2乙型流感病毒(ibv)：mdck细胞扩增
[0195]
将mdck细胞接种于培养瓶中，当细胞密度达到70～80％时去掉部分的培养基，剩余的刚好覆盖好细胞，分别加入适量的ibv病毒(编号：b/guangdong/01.05szsyb7-o/2018，由武汉病毒研究所惠赠)，待病毒吸附于细胞表面后(约3h左右，每隔30min轻轻晃动培养板，使病毒吸附均匀)，更换不含fbs的新鲜培养基，置于35℃、5％co2加湿的恒温培养箱中培养。观察细胞开始产生病变至不再产生病变时(一般为2～3天)采取反复冻融法，于3000rpm离10min以除去细胞残渣，收集上清液分装于冻存管中，进行标注后于-80℃中短期保存或液氮中长期保存，备用。
[0196]
1.2.3呼吸道合胞病毒(rsv)：hep-2细胞扩增
[0197]
将hep-2细胞接种于培养瓶中，当细胞密度达到70～80％时去掉部分的培养基，剩余的刚好覆盖好细胞，加入适量的rsv病毒(atcc-vr-26pq)，待病毒吸附于细胞表面后(约3h左右，每隔30min轻轻晃动培养板，使病毒吸附均匀)，更换不含fbs的新鲜培养基，置于37℃、5％co2加湿的恒温培养箱中培养。观察细胞开始产生病变至不再产生病变时(一般为3～7天)采取反复冻融法，于3000rpm离10min以除去细胞残渣，收集上清液分装于冻存管中，进行标注后于-80℃中短期保存或液氮中长期保存，备用。
[0198]
1.2.4风疹病毒(ruv)：vero细胞扩增
[0199]
将vero细胞接种于培养瓶中，当细胞密度达到70～80％时去掉部分的培养基，剩余的刚好覆盖好细胞，加入适量的ruv病毒(atcc-vr-553)，待病毒吸附于细胞表面后(约3h左右，每隔30min轻轻晃动培养板，使病毒吸附均匀)，更换不含fbs的新鲜培养基，置于37℃、5％co2加湿的恒温培养箱中培养。观察细胞开始产生病变至不再产生病变时(一般为7天)采取反复冻融法，于3000rpm离10min以除去细胞残渣，收集上清液分装于冻存管中，进行标注后于-80℃中短期保存或液氮中长期保存，备用。
[0200]
1.2.5水痘带状疱疹病毒(vzv-3)：vero细胞扩增
[0201]
将vero细胞接种于培养瓶中，当细胞密度达到70～80％时去掉部分的培养基，剩余的刚好覆盖好细胞，加入适量的vzv-3病毒(atcc-vr-1433)，待病毒吸附于细胞表面后(约3h左右，每隔30min轻轻晃动培养板，使病毒吸附均匀)，更换不含fbs的新鲜培养基，置于37℃、5％co2加湿的恒温培养箱中培养。观察细胞开始产生病变至不再产生病变时(一般为5～7天)，用0.25％trypsin-edta消化收集细胞，用非血清细胞冻存液重悬，进行标注后于-80℃中短期保存或液氮中长期保存，备用。
[0202]
1.2.6柯萨奇病毒(cvb3)：llc-mk2细胞扩增
[0203]
将llc-mk2细胞接种于培养瓶中，当细胞密度达到80～90％时去掉部分的培养基，
剩余的刚好覆盖好细胞，加入适量的cvb3病毒，待病毒吸附于细胞表面后(约3h左右，每隔30min轻轻晃动培养板，使病毒吸附均匀)，加入病毒生长培养基终止吸附。置于37℃、5％co2加湿的恒温培养箱中培养。观察细胞开始产生病变至不再产生病变时(一般为1～4天)采取反复冻融法，于3000rpm离10min以除去细胞残渣，收集上清液分装于冻存管中，进行标注后于-80℃中短期保存或液氮中长期保存，备用。
[0204]
1.2.7肠病毒(ev71)：llc-mk2细胞扩增
[0205]
将llc-mk2细胞接种于培养瓶中，当细胞密度达到70～80％时去掉部分的培养基，剩余的刚好覆盖好细胞，加入适量的ev71(atcc-vr-1432)，在37℃加湿5％co2的环境中吸附1～2小时，加入病毒生长培养基终止吸附。观察细胞开始产生病变至不再产生病变时(一般为2～6天)采取反复冻融法，于3000rpm离10min以除去细胞残渣，收集上清液分装于冻存管中，进行标注后于-80℃中短期保存或液氮中长期保存，备用。
[0206]
1.3病毒半数组织培养感染浓度(tissue culture infective dose,tcid
50
)的测定将1.2.1～1.2.7收集的病毒液进行tcid
50
的测定：
[0207]
分别在96孔细胞培养板接种适宜密度的相应细胞悬液100μl，培养24h后吸去培养板中的培养液，加入用细胞维持液稀释的病毒液100μl(病毒进行10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
梯度稀释)，每个稀释度做10个复孔，于37℃、5％co2培养箱吸附培养3h，吸去未吸附的病毒液，每孔补加细胞生长维持液100μl，继续培养。逐日在倒置显微镜下观察细胞病变效应(cpe；病毒在培养细胞中所致cpe的特征：细胞变圆，折光性较强，融合细胞突起，部分脱壁，胞浆有丝状突起或伪足状，整个形状有如不规则的地图，形成大而圆的融合性多核巨细胞)。记录出现cpe的孔数，以最高稀释度不再出现病变时为终点，细胞病变程度用“－～++++”表示：无细胞病变“－”，≤25％细胞病变“+”，25％～50％细胞病变“++”，50％～75％细胞病变“+++”，》75％细胞病变“++++”。根据reed-muench公式计算tcid
50
：
[0208]
tcid
50
＝log(cpe低于50％的病毒稀释度)+距离比例
×
稀释度间距
[0209]
其中，距离比例＝(高于50％百分数-50)
÷
(高于50％的百分数-低于50％的百分数)。
[0210]
1.4受试物的浓度设计
[0211]
1.4.1细胞毒性检测
[0212]
利用实施例1制备的积雪草精油，用dmem培养基配制系列浓度的积雪草精油(浓度梯度为5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.16μl/ml)；还用dmem培养基配制系列浓度的奥司他韦(磷酸奥司他韦颗粒，宜昌东阳光长江药业股份有限公司，批号：0371912115)(浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml)、利巴韦林(利巴韦林喷雾剂，蓬莱诺康药业有限公司，批号：200218)(浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml)、阿昔洛韦(山东方明药业集团股份有限公司，批号：2007121)(浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml)。分别将受试物加入至培养好的mdck、hep-2、vero、llc-mk2细胞，在37℃、5％co2加湿的恒温培养箱中培养72h，然后加入mtt，继续培养4h，之后在492nm波长下测得各孔的od值，计算积雪草精油对各细胞的ec
50
。
[0213]
1.4.2当积雪草精油对细胞有毒性时，采用1/2ic50为最高浓度，以2倍间距向下稀释设置5个测试浓度；当积雪草精油对细胞无毒性时，采用5μl/ml为最高浓度，以2倍间距向下稀释设置5个测试浓度。
[0214]
1.5抗病毒作用的检测
[0215]
1.5.1细胞接种：病毒感染前24h，将生长良好的相应细胞株以适宜的密度(约105个/孔)均匀接种于96孔板中(100μl/孔)，于37℃、5％co2培养箱中培养；
[0216]
1.5.2待细胞密度达到70％～80％左右后，吸去部分培养基，剩余刚好覆盖细胞(使得病毒与细胞更好地吸附)，接种100个tcid
50
的病毒液50μl/孔，放入培养箱中培养3h后，吸去96孔板中的培养基，加入用不含血清的细胞维持液配制的不同浓度的受试物溶液(根据细胞毒性设置)(200μl/孔)，于35℃、5％co2培养箱中培养；
[0217]
1.5.3分组：正常对照组：未用病毒感染组；模型对照组：病毒感染组；阳性对照组：感染组+市售对照药，其中奥司他韦用于h1n1和ibv试验；利巴韦林用于风疹病毒ruv、rsv、cvb3和ev71试验；阿昔洛韦用于vzv-3试验；积雪草精油组：感染组+不同浓度的积雪草精油。
[0218]
1.5.4抗病毒活性评价(cpe法)
[0219]
逐日观察细胞病变，连续观察至细胞病变不再增加，记录每个浓度细胞病变孔数和未病变孔数。
[0220]
1.6结果评价
[0221]
以正常对照组细胞未病变率为100％，细胞病变率抑制率(％)＝(1-各组细胞未病变孔/8)
×
100％。
[0222]
试验数据的统计用软件spss 16.0进行。
[0223]
2.试验结果
[0224]
2.1对细胞增殖的影响
[0225]
如表5所示，积雪草精油在测试浓度范围内(0.16～5μl/ml)对mdck细胞、vero细胞具有不同程度的毒性，其ic
50
分别为5.736μl/ml、1.864μl/ml，对llc-mk2具有一定细胞毒性，其最大细胞毒性低于50％，其ic
50
》5μl/ml，对hep-2细胞无明显细胞毒性。故积雪草精油在抗病毒研究中的最高浓度设置为1μl/ml。
[0226]
奥司他韦、利巴韦林、阿昔洛韦在测试浓度范围内(0.625～20μg/ml)对mdck、hep-2、vero、llc-mk2均无明显细胞毒性，故在抗病毒研究中的最高浓度设置为20μg/ml。
[0227]
表5.积雪草精油对各细胞增殖的影响
[0228][0229]
2.2病毒滴度检测
[0230]
h1n1、ibv、rsv、ruv、vzv-3、cvb3和ev71的半数病毒感染量tcid
50
分别为10-4.05
/0.1ml、10-2.05
/0.1ml、10-5.30
/0.1ml、10-4.22
/0.1ml、10-3.05
/0.1ml、10-3.21
/0.1ml、10-4.65
/
0.1ml，病毒分别做8.91
×
105倍、8.91
×
103倍、5.01
×
106倍、6.03
×
104倍、8.91
×
104倍、6.17
×
104倍、2.24
×
105倍稀释时取0.1ml接种细胞，可使50％细胞产生病变。取100个tcid
50
病毒量，即分别稀释8910倍、89倍、50100倍、603倍、891倍、617倍、2240倍进行体外抗病毒试验。
[0231]
2.3对感染病毒后的细胞活力的影响
[0232]
积雪草精油对7株病毒均具有不同程度的抑制作用，均能不同程度提升感染细胞后细胞的存活能力。对h1n1、ibv、rsv、ruv、vzv-3、cvb3和ev71的ec
50
分别为0.350μl/ml、0.412μl/ml、0.594μl/ml、0.431μl/ml、0.503μl/ml、0.422μl/ml和0.467μl/ml。
[0233]
阳性对照药对7株病毒均具有不同程度的抑制作用，对h1n1、ibv、rsv、ruv、vzv-3、cvb3和ev71的ec
50
分别为2.454μg/ml、6.437μg/ml、4.117μg/ml、6.412μg/ml、4.269μg/ml、3.973μg/ml和4.021μg/ml。
[0234]
表6.积雪草精油对h1n1感染mdck细胞的影响
[0235][0236]
表7.积雪草精油对ibv感染mdck细胞的影响
[0237][0238]
表8.积雪草精油对rsv感染hep-2细胞的影响
[0239][0240]
表9.积雪草精油对ruv感染vero细胞的影响
[0241][0242]
表10.积雪草精油对vzv-3感染vero细胞的影响
[0243][0244]
表11.积雪草精油对cvb3感染llc-mk2细胞的影响
[0245][0246]
表12.积雪草精油对ev71感染llc-mk2细胞的影响
[0247][0248]
以上结果表明，积雪草精油(例如以0.03～1μl/ml的剂量)对多种病毒均具有不同程度的抑制作用，能保护细胞不受病毒感染。
[0249]
除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的各种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本技术中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。