一种重组TetR蛋白及其制备方法和试剂盒以及牛奶中四环素类抗生素残留的检测方法

tekqyetlen qlaflcqqgf slenalyals avehftlgcv ledqehqvak eeretpttds mppllrqaie lfdhqgaepa flfgleliic glekqlkces klaaalehhh hhh。
10.以及，本发明实施例还提供上述重组tetr蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
11.s1、将pet-32a-tetr质粒作为模板，以序列为5
′‑
cgggatccatgtctagattagataaaagt-3
′
和5
′‑
cccaagcttttaactttccatttaagt-3
′
的引物进行soe-pcr扩增，获得突变的pet-32a-tetr’质粒；所述突变的pet-32a-tetr’质粒的tetr’核苷酸序列如seq id no.2所示；
12.s2、对s1所得突变的pet-32a-tetr’质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，得到重组表达菌；将所述重组表达菌在lb培养液中进行培养，并在培养过程中以异丙基硫代半乳糖苷诱导；离心，收集沉淀；
13.s3、向所述沉淀中加入细菌裂解液，超声破碎后离心，收集上清液，向所述上清液中加入结合缓冲液，用琼脂糖凝胶纯化蛋白，即得。
14.该方法根据tetr蛋白的基因序列，利用基因克隆、构建重组质粒、原核表达等方法，能够获得上述重组tetr蛋白。
15.优选地，s1中所述soe-pcr扩增的反应体系为：
[0016][0017]
扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，25个循环；72℃延伸5min。
[0018]
优选地，所述结合缓冲液按以下方法配制而成：1m tris-hcl 4ml，1m咪唑缓冲液100ml，3m nacl 33.33ml，超纯水定容至200ml。
[0019]
优选地，所述lb培养液中含有50μl/ml氨苄青霉素。
[0020]
优选地，s2中在lb培养液中培养所述重组表达菌的条件为37℃、200转/min震荡培养2h。加入0.5mm iptg后，继续震荡培养2h，4000转/min离心10min收集沉淀。
[0021]
优选地，s3中超声破碎20min，4℃、12000转/min离心10min，收集上清液。
[0022]
优选地，s3中所述上清液与所述结合缓冲液的体积比为1：1。
[0023]
优选地，琼脂糖凝胶可选用ni-agarose resin。
[0024]
以及，本发明实施例还提供一种检测四环素类抗生素残留的试剂盒，所述试剂盒包括上述重组tetr蛋白。
[0025]
优选地，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记四环素半抗原，鲁米诺，4-(咪唑-1-基)苯酚和双氧水。以上试剂均可选择用于检测分析的市售试剂。
[0026]
以上述重组tetr蛋白作为核心元件，结合辣根过氧化物酶标记四环素半抗原，以鲁米诺、4-(咪唑-1-基)苯酚、双氧水作为化学发光试剂，可以通过直接竞争化学发光检测方法对牛奶等畜禽产品中四环素类药物残留进行高通量、快速、有效的检测。
[0027]
其中所述辣根过氧化物酶标记四环素半抗原的合成方法为：在正丁胺条件下，用10μl氯甲酸异丁酯(正丁胺与氯甲酸异丁酯的体积比为5.4～6.6：4，v/v)活化5mg四环素半抗原中的羧基，再与2ml的5mg/ml辣根过氧化物酶溶液反应8-12h；使用时稀释1000倍。
[0028]
以及，本发明实施例还提供了一种牛奶中四环素类抗生素残留的检测方法，包括以下操作：
[0029]
用上述重组tetr蛋白包被微孔板，向所述微孔板的微孔中依次加入辣根过氧化物酶标记四环素半抗原溶液、待测样品溶液，孵育后洗净，加入鲁米诺的乙腈溶液，4-(咪唑-1-基)苯酚的水溶液和双氧水稀释液，用酶标仪检测。
[0030]
该检测方法为化学发光免疫分析法，通过酶联免疫与化学发光相结合以实现高灵敏性。鲁米诺在碱性条件下可以被催化氧化并同时发光，通过结合其他反应试剂，可以获得良好的化学发光信号，并能够用于待测样品中痕量四环素类药物的检测。
[0031]
该方法中鲁米诺的乙腈溶液，4-(咪唑-1-基)苯酚的水溶液和双氧水稀释液均为化学发光试剂，三者体积比为1:(0.95～1.05):(0.95～1.05)，优选采用1:1:1。
[0032]
优选地，所述鲁米诺的乙腈溶液中鲁米诺的浓度为0.84～0.92g/l，优选采用0.88g/l；所述4-(咪唑-1-基)苯酚的水溶液中4-(咪唑-1-基)苯酚的浓度为0.15～0.17g/l，优选采用0.16g/l；所述双氧水稀释液中过氧化氢的浓度为0.095～0.105ml/l，优选采用0.1ml/l。
[0033]
以上化学发光试剂可采用以下方法制备得到：
[0034]
将0.84～0.92g鲁米诺用1mm的naoh溶解后用乙腈定容至100ml，得鲁米诺的乙腈溶液；
[0035]
将0.15～0.17g 4-(咪唑-1-基)苯酚用dmf溶解后用水定容至100ml，得4-(咪唑-1-基)苯酚的水溶液；
[0036]
将0.095～0.105ml过氧化氢加入蒸馏水中，定容至1l，得双氧水稀释液。
[0037]
优选地，用上述重组tetr蛋白包被微孔板可采用以下方法：
[0038]
第一步、用所述重组tetr蛋白水溶液作为包被液加入96孔板中，4℃，孵育12～14h，弃包被液；
[0039]
第二步、用磷酸盐缓冲液(pbst，ph7.5)清洗、控干，重复三～四次；
[0040]
第三步、加入封闭液于37℃，湿度60％
±
5％，孵育50～70min；其中封闭液可选用2％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液溶液。
[0041]
经上述方法包被后，包被量约为0.02μg/孔。
[0042]
优选地，所述磷酸盐缓冲液中含有0.05％v/v吐温。
[0043]
本发明的有益效果在于：
[0044]
本发明对天然tetr蛋白第103位和112位氨基酸的编码基因突变改造获得重组载体pet-32a-tetr质粒，利用该pet-32a-tetr质粒，通过大肠杆菌表达纯化后获得突变重组tetr蛋白。以该重组tetr蛋白为包被物，使用辣根过氧化物酶标记四环素半抗原，以鲁米诺、4-(咪唑-1-基)苯酚、双氧水组合作为发光试剂，建立直接竞争化学发光检测法，可以用于牛奶中四环素类药物残留快速分析和筛选，能够提高检测效率、缩短检测时间、降低检测成本。
附图说明
[0045]
图1为本发明实施例4中的抑制曲线；
[0046]
图2为本发明实施例4中的标准曲线。
具体实施方式
[0047]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0048]
以下实施例中的试剂如无特殊说明，均来源于市售或按照本领域公知方法取得。
[0049]
实施例1
[0050]
本发明实施例提供了一种重组tetr蛋白，其氨基酸序列(如seq id no.1所示)为：
[0051]
msdkiihltd dsfdtdvlka dgailvdfwa ewcgpckmia pildeiadey qgkltvakln idqnpgtapk ygirgiptll lfkngevaat kvgalskgql kefldanlag sgsghmhhhh hhssglvprg sgmketaaak ferqhmdspd lgtddddkam adigsmsrld kskvinsale llnevgiegl ttrklaqklg veqptlywhv knkralldal aiemldrhht hfcplegesw qdflrnnaks frcallshrd gakvhlgtrp tekqyetlen qlaflcqqgf slenalyals avehftlgcv ledqehqvak eeretpttds mppllrqaie lfdhqgaepa flfgleliic glekqlkces klaaalehhh hhh。
[0052]
该重组tetr蛋白的制备方法包括如下步骤：
[0053]
(1)取pet-32a-tetr质粒pcr产物1份，加无菌水99份，100℃煮沸10min，取1份作为模板；引物5
′‑
cgggatccatgtctagattagataaaagt-3’和5
′‑
cccaagcttttaactttccatttaagt-3
′
，各取1份；加入由taq dna聚合酶缓冲液、dntps、taq dna聚合酶和mgcl2组成的mix 12.5份；向上述反应体系中加入ddh2o 9.5份；按照95℃、3min；95℃、30s，55℃45sec，72℃、45sec，重复25次；72℃、5min在pcr仪上进行soe-pcr扩增，获得突变的pet-32a-tetr’质粒；
[0054]
soe-pcr扩增的反应体系为：
[0055][0056]
其中pet-32a-tetr质粒的制备方法为：
[0057]
以大肠杆菌标准菌株atcc25922作为模板，以序列为5
′‑
cgggatccatgtctagattagataaaagt-3
′
和5
′‑
cccaagcttttaactttcacatttaagt-3
′
的引物进行pcr扩增，反应条件：95℃，3min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，25个循环；72℃，5min。反应产物纯化后，在37℃经bamh i和hind iii双酶切2h，与同样经过双酶切的pet-32a(+)用琼脂糖凝胶电泳纯化并回收，二者按照1：1的比例，用t4dna连接酶在16℃连接过夜，得到重组的pet-32a-tetr质粒。
[0058]
该突变的pet-32a-tetr’质粒的tetr’核苷酸序列如seq id no.2所示：
[0059]
ggttccctcggggggaaattgcctctagaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggatccatgtctagattagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgaggtcggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagttaggtgtagagcagcctacattgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatgttagataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagattttttacgtaataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagtacatttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagcctttttatgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgctgtggagcattttactttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaaacacctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcga。
[0060]
(2)将步骤(1)得到的pcr产物和pet-32a载体经酶切、纯化、连接后转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞：冰浴反应30min，立即置于42℃中90s，再冰浴2min，与500μl lb培养液混匀后，200转/min、37℃培养1h，得到重组表达菌；取重组表达菌的菌液0.5ml涂布于含有氨苄青霉素的lb固体培养基，37℃培养过夜，挑去单克隆转移至含有氨苄青霉素的lb培养液(每50ml培养液中含2.5mg氨苄青霉素)，37℃、200转/min震荡培养2h，在od值＝0.6时，加入终浓度为0.5mm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导，继续震荡培养2h，4000转/min离心10min收集沉淀。
[0061]
(3)向沉淀中加入细菌裂解液，超声破碎20min，4℃、12000转/min离心10min，收集上清，按1：1的体积比加入结合缓冲液(1m tris-hcl 4ml，1m咪唑缓冲液100ml，3m nacl 33.33ml，超纯水定容至200ml)，利用琼脂糖凝胶(ni-agarose resin)纯化，获得重组tetr蛋白。
[0062]
实施例2
[0063]
本发明实施例提供了一种检测牛奶中四环素类抗生素残留的试剂盒，具体包括：
[0064]
(1)氨基酸序列如seq id no.1所示的重组tetr蛋白；
[0065]
(2)辣根过氧化物酶标记四环素半抗原，鲁米诺，4-(咪唑-1-基)苯酚和双氧水。
[0066]
其中辣根过氧化物酶标记四环素半抗原的合成方法为：在正丁胺条件下，用10μl氯甲酸异丁酯(正丁胺与氯甲酸异丁酯的体积比为6：4，v/v)活化5mg四环素半抗原中的羧基，再与2ml的5mg/ml辣根过氧化物酶溶液(上海源叶生物技术有限公司)反应8-12h；使用时稀释1000倍。
[0067]
实施例3
[0068]
本发明实施例提供了一种牛奶中四环素类抗生素残留的检测方法，主要包括以下步骤：
[0069]
(a)用100μl实施例1中的重组tetr蛋白水溶液作为包被液(浓度为0.25μg/ml)加入96孔板中，4℃，孵育12h，弃包被液；
[0070]
(b)用200μl pbst(ph7.5，含有0.05％v/v吐温)清洗、控干，重复三次；
[0071]
(c)加入150μl 2％脱脂奶粉溶液(溶剂为pbst)于37℃，湿度60％，孵育1h，弃液，200μl pbst洗3次；
[0072]
(d)每孔加50μl辣根过氧化物酶标记四环素半抗原(制备方法同实施例2)，再加入50μl四环素标准品溶液或待测牛奶样品溶液、对照加入pbst，37℃孵育1h，重复步骤(b)；
[0073]
(e)每孔加50μl 0.88g/l的鲁米诺乙腈溶液、50μl 0.16g/l的4-(咪唑-1-基)苯酚水溶液和50μl 0.1ml/l双氧水稀释液，静置1min；
[0074]
(f)用多功能酶标仪检测，室温，450nm/630nm读取化学发光数据。
[0075]
实施例4
[0076]
本发明实施例对实施例3中牛奶中四环素类抗生素残留的检测方法进行了方法学考察。
[0077]
(1)lod和ic
50
的测定
[0078]
标准溶液：四环素、土霉素、金霉素、米诺环素溶液浓度分别为0.001、0.01、0.1、1、10、100ng/ml。
[0079]
检测：ai为每个孔的吸光度值，a0为零标准吸光度值。以ai/a0×
100％为纵坐标，以
标准品浓度为横坐标，绘制抑制曲线，如图1所示；以ai/a0×
100％为纵坐标，以标准品浓度的对数值(lgc)为横坐标，绘制半对数曲线图，即标准曲线，计算待测牛奶样品中四环素类药品浓度时，根据每个样品的ai/a0×
100％计算lgci，即可获得样品浓度ci。将标准曲线中各标准品浓度平行测定6次，r2＞0.99。标准曲线以及平行测定结果如图2所示。
[0080]
根据标准曲线得出四环素、土霉素、金霉素、米诺环素的lod(ic
10
)为124、86、138、130pg/ml，ic
50
为0.5、0.5、2.2、1.0ng/ml。
[0081]
(2)添加回收率的测定
[0082]
添加溶液：向牛奶中添加标准品溶液，四环素、土霉素、金霉素、米诺环素溶液浓度分别为1、10、100ng/ml。
[0083]
样品处理：将0.1ml牛奶与0.9ml na2edta-mcllvaine缓冲液置于10ml离心管中漩涡混合1min，超声10min，4℃、5000rpm离心10min，每次取上清50μl。
[0084]
重复三次，根据标准曲线获得样品中药物浓度，经计算回收率大于80％、变异系数小于9％，如表1所示。
[0085]
表1精密度和回收率结果
[0086][0087]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。