一种可胞外分泌表达的蔗糖磷酸化酶及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种可胞外分泌表达的蔗糖磷酸化酶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase，ec 2.4.1.7)，是糖基水解酶13(gh13)家族中的一员。该酶能以较廉价的蔗糖作为转糖苷反应中葡萄糖基的有效供体，以无机磷酸、含有酚羟基、醇羟基或羧基的物质作为受体，能够催化合成α-熊果苷、曲二糖、2-o-α-葡萄糖基甘油等多种衍生物。蔗糖磷酸化酶在食品、化妆品及医药方面有广泛的应用价值。
3.蔗糖磷酸化酶属于胞内酶，酶基因的主要来源有长双歧杆菌(bifidobacterium longum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)、肠膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)、变异链球菌(streptococcus mutans)等。
4.目前蔗糖磷酸化酶主要在大肠杆菌中获得胞内表达。为了获得大量的目标蛋白，需要将细胞进行破坏以使细胞内的蛋白释放出来，这一附加的过程势必将增加蛋白的生产成本。研究者试图通过一些手段，使得蔗糖磷酸化酶被释放到大肠杆菌胞外，实现胞外分泌表达。文献(highly efficient extracellular expression of naturally cytoplasmic leuconostoc mesenteroides sucrose phosphorylase)通过蔗糖磷酸化酶与磷酯酶c(phospholipase c)共表达，首次实现蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中的分泌表达。但采用该技术进行蔗糖磷酸化酶胞外分泌表达时，胞内残留酶活仍然较高(胞内蔗糖磷酸酶活残留量达到18.4％)，文献(discovering and efficiently promoting the extracellular secretory expression of thermobacillus sp.zcth02-b1 sucrose phosphorylase in escherichia coli)通过将蔗糖磷酸化酶与thermobacillus sp.zcth02-b1内源渗透压诱导型蛋白y(endogenous osmotically-inducible protein y)融合表达，以实现蔗糖磷酸化酶的分泌表达。但通过上述技术分泌表达的胞外蔗糖磷酸化酶活性极低，仅为6.2u/ml。
5.针对上述领域内需要解决的技术问题和不足，本发明通过将动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)来源的蔗糖磷酸化酶与n20信号肽连接进行融合表达，实现该蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中的高效胞外分泌表达。同时，本专利利用上述可向胞外分泌表达的融合蔗糖磷酸化酶用于α-熊果苷的酶法转化生产。
6.因此，如何提供一种可胞外分泌表达的蔗糖磷酸化酶及其制备方法和应用是本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.本发明公开了一种可胞外分泌表达的蔗糖磷酸化酶及其制备方法和应用。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种可胞外分泌表达的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1所示；
10.megntrednfkhllgndnvkrpmknkvqlityadrlgdgnlasmtdilrtrfdgvyegvhilpfftpfdgadagfdpidhtkvdarlgdwddiaelakthdimvdaivnhmswqskqfqdvlangedseyypmfltmssvfpdgateeelagiyrprpglpfthysfagktrlvwvtftpqqvdidtdsakgweylmsifdqmskshvkyirldavgygakeagtscfmtpktfelisrlreegakrgleilievhsyykkqveiaakvdrvydfalpplllhslftgkvdalahwteirpnnavtvldthdgigvidigsdqldrslkglvpdadvdnmvetiaknthgeskaatgaaasnldlyqvnstyysalgcndqhyiaaravqfflpgvpqvyyvgalagendmellkrtnvgrdinrhyyttseidknlerpvvkalnalarfrnelpafdgdfsysvgddesiafswngfgssatltftpskgmgvenpqsvatlvwtdstgehrtddlianppvmqas；
11.上述的融合蛋白质的相关的生物材料，为下述a)-d)中至少一种：
12.a)编码所述融合蛋白质的核酸分子；
13.b)含有a)所述核酸分子的表达盒；
14.c)含有a)所述核酸分子的重组载体或含有b)所述表达盒的重组载体；
15.d)含有a)所述核酸分子的重组微生物、含有b)所述表达盒的重组微生物或含有c)所述重组载体的重组微生物；
16.如上所述的生物材料，其特征在于，a)中，所述核酸分子的序列为与seq id no.2同源相似度达90％或90％以上的核酸分子；
17.atggaaggaaacactcgtgaagacaattttaaacatttattaggtaatgacaatgttaaacgccctatgaagaacaaagttcagctgatcacctatgcggatcgcttgggtgacggcaaccttgcttcgatgaccgacattctgcgcacgcgattcgacggcgtgtacgagggcgtgcacattctgccgttcttcaccccgttcgatggcgcggacgcaggcttcgacccgatcgaccacaccaaggtcgacgcccgcctcggtgactgggatgacatcgccgagctcgccaagacgcatgacatcatggtcgatgccatcgtcaaccacatgagctggcagtccaagcagttccaggatgtgctcgcgaacggcgaggattccgagtactacccgatgttcctcacgatgagctccgtgttccccgacggcgcgaccgaggaggagctcgccggcatctaccgcccgcgcccgggcctgccgttcacccactacagcttcgccggcaagacccgcttggtgtgggtcacgttcacgccgcagcaggtcgacattgacaccgactccgccaagggctgggaatacctgatgtcgatcttcgaccagatgagcaagtcgcacgtcaagtacattcgcctcgacgccgtcggctacggcgccaaggaggccggcaccagctgcttcatgacccccaagaccttcgaactcatctcgcgactgcgcgaggagggtgccaagcgcggtctggagattctcatcgaggtgcactcgtactacaagaagcaggtggagatcgccgccaaggtggatcgcgtctatgacttcgcgctgccgccattgctgctgcactcgctgttcaccggcaaggtggacgcgctcgcgcactggaccgagattcgcccgaacaatgcggtcaccgtgctcgacacgcacgacggcatcggcgtcatcgacatcggctccgaccagctcgaccgttcgctcaagggtctggtgcccgacgcggacgtcgacaacatggtcgagacgatcgcgaagaacacccatggcgagtcgaaggccgcaaccggcgccgccgcttcgaacctcgacctctaccaggtgaactccacatattattcggcgctcggctgcaatgaccagcattacattgccgcacgcgccgtgcagttcttcctgccgggcgttccgcaggtgtactatgtgggcgcgctcgccggcgagaacgacatggagctgctcaagcgcacgaatgtgggccgcgacatcaaccgccactattacacgacctccgagatcgacaagaacctcgaacgtccggtggtcaaggccctgaacgcgctcgccagattccgcaacgagctgccggcgttcgacggcgacttcagctactcggtgggcgatgacgagtcgattgcgttctcctggaacggtttcggatcctccgctacgctcacgttcacgccgtccaagggcatgggtgtcgagaacccacagtccgtcgccacgctcgtctggacggattccactggcgagcaccgcaccgacgacctcattgcgaacccgcccgtcatgcaggcgagctga；
18.优选的，所述核酸分子的序列为与seq id no.2同源相似度达95％或95％以上的核酸分子；
19.优选的，所述核酸分子的序列为与seq id no.2同源相似度达100％的核酸分子；
20.如上所述的生物材料，c)中，所述重组载体为pet-蔗糖磷酸化酶；所述pet为pet表达载体；
21.优选的，所述pet表达载体为pet28。；
22.如上所述的生物材料，d)中，所述重组微生物为原核表达微生物；
23.优选的，所述原核表达微生物为bl21；
24.优选的，所述bl21为bl21(de3)；
25.一种可胞外分泌表达的蔗糖磷酸化酶的提取方法，步骤为：使用硫酸铵对蔗糖磷酸化酶进行沉淀；
26.一种可胞外分泌表达的蔗糖磷酸化酶的缓冲液，缓冲液ph 5.0-8.0，优选的，所述ph为6.5；
27.优选的，所述缓冲液含有0.2mol/l磷酸氢二钠和0.1mol/l柠檬酸缓冲液；
28.如上所述的蔗糖磷酸化酶、如上所述的生物材料、如上所述的提取试剂和如上所述的缓冲液在制备可胞外分泌表达的蔗糖磷酸化酶制剂中的应用；
29.如上所述的应用，所述的蔗糖磷酸化酶的提取方法为：在发酵上清液中缓慢加入硫酸铵至饱和度为60％；
30.优选的，所述发酵上清液为冰浴预；
31.优选的，还包括离心收集沉淀；更优选的，所述离心收集沉淀为4℃、12000rpm离心10min；
32.如上所述的应用，其特征在于，所述缓冲液温度低于60℃；
33.优选的，所述缓冲液温度为50℃。
34.综上所述，本发明公开了一种可胞外分泌表达的蔗糖磷酸化酶及其制备方法和应用，本发明将来源于动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis sub sp.lactis)的蔗糖磷酸化酶基因basp与一种信号肽n20连接，构建重组表达质粒pet-n20-basp并转化大肠杆菌bl21(de3)，实现了basp在大肠杆菌中的高效诱导胞外分泌表达。
附图说明
35.图1为重组表达载体pet-n20-basp的质粒图谱；
36.图2为基因工程菌分泌表达蔗糖磷酸化酶的sds-page图谱；
37.m：低分子量蛋白标准；
38.1：基因工程菌诱导表达的全发酵液；
39.2：发酵液上清
40.3：发酵后的菌体；
41.图3为ph对于蔗糖磷酸化酶活性影响的曲线图；
42.图4为温度对于蔗糖磷酸化酶活性影响的曲线图；
43.图5为hplc检测熊果苷和氢醌含量的典型图谱。
具体实施方式
44.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例
仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
45.以蔗糖和磷酸为底物测量蔗糖磷酸化酶的活性。将100μl适当稀释的酶液，加入到100μl含有5％蔗糖的50mm磷酸缓冲液(ph 6.5)中，随后在50℃反应10min，接着加入200μl dns溶液中止反应，并煮沸10min显色。冷却后，于540nm下测吸光度。定义每分钟水解产生1μmol果糖所需要蔗糖磷酸化酶的量为一个单位的酶活力(1u)。
46.实施例1表达蔗糖磷酸化酶的重组菌
47.本发明将来源于动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lact is)的蔗糖磷酸化酶基因basp与一种信号肽n20连接，构建重组表达质粒pet-n20-basp并转化大肠杆菌bl21(de3)，实现了basp在大肠杆菌中的高效诱导胞外分泌表达。
48.表达蔗糖磷酸化酶的重组菌
49.以bifidobacterium animalis subsp.lactis bb-12基因组为模板，使用引物b asp-f和basp-r，进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction；pcr)扩增b asp基因。pcr条件如下：在94℃下变性5min后，25个循环由94℃下30s、60℃下30s以及在72℃下1min组成，接着在72℃下延伸5min。以引物n20-f和n20-r，互为模板和引物，pcr扩增n20信号肽序列。pcr条件如下：在94℃下变性30min后，5个循环由94℃下30s、50℃下30s以及在72℃下30min组成，接着在72℃下延伸5min。分别将basp基因、n20信号肽片段经琼脂糖电泳、凝胶回收后，经一步克隆试剂盒连接到酶切(ncoi和hindiii)处理后的pet28载体中，以构建表达载体pet-n20-basp。图1为表达载体pet-n20-basp的质粒图谱。
50.n20-f：
51.ctttaagaaggagatataccatggaaggaaacactcgtgaagacaattttaaacatttattaggtaatgacaatgttaaacg
52.n20-r：catatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctagggcgtttaacattgtcattacct
53.basp-f：gtgccgcgcggcagccatatgaagaacaaagttcagctgatc
54.basp-r：cgagtgcggccgcaagcttagctcgcctgcatgacgggcgggt
55.使用热激转化法将表达载体pet-n20-basp引入到大肠杆菌bl21(de3)中，以制备表达来源于动物双歧杆菌乳亚种的蔗糖磷酸化酶的重组菌株。所述重组菌被命名为bl21-n20-basp。
56.实施例2蔗糖磷酸化酶的诱导分泌表达
57.将重组菌bl21-n20-basp接种在装有50ml液体lb培养基的250ml三角烧瓶中，并在37℃摇床中活化培养过夜，制备用于蔗糖磷酸化酶发酵的种子液。
58.将该种子液按照1％的接种量接种自诱导培养基(5g/l甘油，10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，2.31g/l kh2po4，12.54g/l k2hpo4
·
12h20，2g/l乳糖，0.4g/l葡萄糖，50mg/l卡那霉素；装液量50ml/250ml三角烧瓶)，37℃震荡培养24小时。未经任何处理的发酵液为全发酵液。全发酵液经12000rpm离心5min，以去除重组大肠杆菌的菌体，获得发酵液上清。将离心后的菌体经去离子水清洗后，重悬于pbs缓冲液中。重悬的菌体使用超声波进行破壁，然后经12000rpm离心5min，获得破碎细胞上清。
59.取发酵液上清和破碎细胞上清分别测定酶活。结果显示，胞外与破碎后的细胞上
清液中的蔗糖磷酸化酶的酶活分别为53u/ml和小于0.5u/ml，结果表明蔗糖磷酸化酶胞内残留量仅为0.93％。对全发酵液、发酵液上清和发酵后的菌体进行sds-page检测。sds-page电泳图如图2所示，重组的蔗糖磷酸化酶(理论分子量59.7kda)几乎完全位于发酵液上清中。以上结果说明蔗糖磷酸化酶几乎完全被分泌到大肠杆菌胞外。
60.实施例3 ph和温度对蔗糖磷酸化酶的影响
61.在冰浴预冷的发酵液上清中缓慢加入硫酸铵至饱和度为60％，4℃、12000rpm离心10min收集沉淀。沉淀溶解于适量的mes缓冲液(ph6.5)中，为蔗糖磷酸化酶的粗酶液。
62.为了研究不同ph和温度对该蔗糖磷酸化酶的影响，在不同的温度(20-70℃)和ph条件(ph 3.5-8.0)下测定其活性。为了研究不同ph对蔗糖磷酸化酶稳定性的影响，将上述粗酶液用不同的缓冲液(ph 3.5-8.0)稀释后，置于50℃保温1h。为了研究不同温度对蔗糖磷酸化酶稳定性的影响，将蔗糖磷酸化酶置于不同温度(20-70℃)下保温1h。研究中所使用的缓冲液为0.2mol/l磷酸氢二钠-0.1mol/l柠檬酸缓冲液。结果如图3和图4所示，该蔗糖磷酸化酶的最适ph和最适温度分别为ph 6.5和50℃。蔗糖磷酸化酶在温度低于60℃，ph 5.0-8.0保持稳定(残余酶活大于90％)。
63.实施例4蔗糖磷酸化酶转化制备α-熊果苷
64.蔗糖磷酸化酶可用于转化制备α-熊果苷。基本反应条件为：250g/l蔗糖，20g/l氢醌，50mm mes，300u/ml蔗糖磷酸化酶，1mm维生素c，ph＝6.5。37℃避光反应24小时。反应结束后，沸水浴保温10min中止反应，产物用hplc进行检测。
65.hplc检测条件为：色谱柱c18(100mm
×
0.3mm
×
0.3μm)，流动性0.05％甲酸溶液和甲醇(95：5)，流速为0.3ml/min，柱温设置为20℃，检测波长为280nm。采用外标法，根据保留时间和峰面积确定相应α-熊果苷和氢醌的浓度。
66.转化率按公式计算：
67.hplc的色谱图见图4，计算反应24小时α-熊果苷的转化率为76％。
68.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
69.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。