MART-1(27-35)表位特异性T细胞受体及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种mart-1(27-35)表位特异性t细胞受体及其应用。

背景技术：

1、黑色素瘤，又称恶性黑色素瘤，是来源于黑色素细胞的一类恶性肿瘤，常见于皮肤，亦见于粘膜、眼脉络膜等部位。黑色素瘤是皮肤恶性程度最高的瘤种，容易出现远处转移。在亚洲人和有色人种中，原发于皮肤的黑色素瘤占50％～70％，欧美白种人中过度的紫外线照射是明确病因之一。紫外线可致使皮肤灼伤，并诱导dna突变，进而诱导黑色素瘤发生。此外，光敏型皮肤、存在大量普通痣或发育异常痣以及皮肤癌家族史者均为高危人群。多发于亚洲和非洲地区的肢端型黑色素瘤所受紫外线照射极少，病因仍不明确。

2、肿瘤相关抗原是在癌症上选择性表达或过表达的正常非突变的自身蛋白质，可以作为肿瘤免疫治疗的靶向抗原表位。已知mart-1 (melanoma antigen recognized by tcells 1)抗原肽在黑素瘤和皮肤、眼睛和耳朵中的健康黑色素细胞上表达，在子宫内膜、卵巢、淋巴结和睾丸上低表达，并且在黑色素瘤细胞中高表达。例如，在葡萄膜黑色素瘤病变(uveal melana lesions)中，mart-1高表达。因此，mart-1是一个很好的免疫治疗黑色素瘤的抗原表位。此外，melan-a也可用于血管平滑肌脂肪瘤蛋白质和mrna水平的检测。十肽的melan-a/mart-1 26-35(eaagigiltv)抗原表位和九肽的melan-a/mart-1 27-35(lagigiltv)抗原表位是mart-1的两种主要抗原表位。已经证实九肽具有强烈的免疫显性，被证明是特异性cd8+细胞溶解性t淋巴细胞(ctl)最常识别的肽。目前已经鉴别的dmf4和dmf5 t细胞受体 (tcr)识别相同的mart-1：27-35表位，并且具有交叉反应。在临床试验中，过继转移mart-1f5 tcr工程化外周血单个核细胞的治疗方法结果良好，肿瘤消退达到69％。另一临床反应显示使用dmf5 tcr 治疗的20名患者中有6名(30％)经历了recist标准定义的客观抗肿瘤反应。所以，抗mart-1tcr基因工程淋巴细胞过继治疗方法的开发对肿瘤特别是黑色素瘤的免疫治疗有着重要的意义和推动作用。

3、因此，本领域亟需开发出一种抗mart-1tcr基因工程淋巴细胞过继治疗方法，以有效地治疗黑色素瘤。

技术实现思路

1、如上所述，本发明旨在提供一种抗mart-1tcr基因工程淋巴细胞过继治疗方法，以有效地治疗黑色素瘤。

2、因此，在第一方面，本发明提供了一种特异性识别mart-1(27-35) 表位的t细胞受体(tcr)，其包含α链和β链，其中所述α链包含三个互补决定区cdr1α、cdr2α和cdr3α，所述β链包含三个互补决定区cdr1β、cdr2β和cdr3β，并且所述cdr1α、cdr2α、cdr3α、 cdr1β、cdr2β和cdr3β的氨基酸序列分别如seq id no:1-6、seq id no:7-12、seq id no:13-18或seq idno:19-24所示，或者为与所述氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸改变并且保留特异性识别 mart-1(27-35)表位能力的变体。

3、在一个实施方案中，所述α链可变区包含seq id no:25、seq id no:33、seq idno:41或seq id no:49所示的氨基酸序列或与seq id no:25、seq id no:33、seq id no:41或seq id no:49具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

4、在一个实施方案中，所述β链可变区包含seq id no:26、seq id no:34、seq idno:42或seq id no:50所示的氨基酸序列或与seq id no:26、seq id no:34、seq id no:42或seq id no:50具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

5、在一个实施方案中，所述α链可变区和所述β链可变区各自与恒定区连接。在一个优选的实施方案中，与所述α链可变区连接的恒定区的氨基酸序列如seq id no:57所示。在又一个优选的实施方案中，与所述β链可变区连接的恒定区的氨基酸序列如seq id no:58所示。

6、在一个实施方案中，所述α链和所述β链各自进一步与信号肽融合。在一个优选的实施方案中，与所述α链融合的信号肽的氨基酸序列如seq id no:27、seq id no:35、seqid no:43或seq id no:51 所示。在又一个优选的实施方案中，与所述β链融合的信号肽的氨基酸序列如seq id no:28、seq id no:36、seq id no:44或seq id no: 52所示。

7、在一个实施方案中，所述与信号肽融合的α链和所述与信号肽融合的β链经由2a肽例如p2a肽连接在一起。在一个优选的实施方案中，所述t细胞受体(tcr)的氨基酸序列如seq id no:29、seq id no: 37、seq id no:45或seq id no:53所示。

8、在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面的t细胞受体(tcr)。

9、在一个实施方案中，所述t细胞受体(tcr)的α链可变区由 seq id no:30、seq idno:38、seq id no:46或seq id no:54所示的核酸序列或其简并序列编码。

10、在一个实施方案中，所述t细胞受体(tcr)的β链可变区由 seq id no:31、seq idno:39、seq id no:47或seq id no:55所示的核酸序列或其简并序列编码。

11、在一个实施方案中，所述t细胞受体(tcr)由seq id no:32、 seq id no:40、seqid no:48或seq id no:56所示的核酸序列或其简并序列编码。

12、在第三方面，本发明提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面的核酸分子。

13、在一个实施方案中，所述载体为病毒载体如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒表达载体。

14、在第四方面，本发明提供了一种效应细胞，所述效应细胞包含本发明第一方面的t细胞受体、本发明第二方面的核酸分子、或者本发明第三方面的载体。

15、在一个实施方案中，所述细胞为t细胞、自然杀伤细胞、人胚胎干细胞、淋巴祖细胞和/或t细胞前体细胞，所述t细胞例如细胞毒性 t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞及抑制t细胞。

16、在第五方面，本发明提供了一种杀伤黑色素瘤细胞的方法，包括使本发明第一方面的t细胞受体或者本发明第四方面的效应细胞与黑色素瘤细胞接触。

17、在一个优选的实施方案中，所述黑色素瘤细胞为mart-1阳性、 hla:a0201分型的黑色素瘤细胞。

18、在第六方面，本发明提供了一种治疗黑色素瘤的方法，包括将本发明第一方面的t细胞受体或者本发明第四方面的效应细胞给予黑色素瘤患者。

19、在一个优选的实施方案中，所述黑色素瘤为mart-1阳性、 hla:a0201分型的黑色素瘤。

20、在第七方面，本发明提供了本发明第一方面的t细胞受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的载体、或者本发明第四方面的效应细胞在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

21、在一个优选的实施方案中，所述黑色素瘤为mart-1阳性、 hla:a0201分型的黑色素瘤。

22、在第八方面，本发明提供了一种试剂盒，包括本发明第一方面的 t细胞受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的载体、或者本发明第四方面的效应细胞。

23、通过使用本发明的t细胞受体，可以有效地杀伤携带mart-1 (27-35)抗原肽的细胞，从而实现对黑色素瘤的治疗。