一种海洋原位环境单细胞高通量分选装置及方法

1.本发明涉及海洋微生物技术领域，特别是涉及一种海洋原位环境单细胞高通量分选装置及方法。


背景技术：

2.浩瀚的海洋是地球生命的摇篮，蕴含着资源丰富、种类繁多的微生物。海洋微生物是重要的海洋生物资源。海水、海洋沉积物里面的海洋细菌、海洋真菌、海洋放线菌、海洋古菌等的代谢产物存在大量的生物活性物质，在能源、材料、环境、医药等领域有着重要的应用前景。比如，深海冷泉、热液环境发现的能够产生生物能源的自养型微生物；能够降解塑料的海洋微生物已经被发现；科学家从海洋细菌和放线菌中分离出了有效的抗生素；海洋嗜甲烷菌等古菌具有较强的甲烷代谢能力，作为海洋极端生态环境的初级生产者，通过化能合成，与后生动物共生，为它们提供重要的碳源和能源。因此，海洋微生物是重要生物资源，具有重要的开发利用价值。
3.分离和培养是开发利用海洋微生物的重要前提。目前，对于海洋微生物的分离，多数是在常压环境下采用平板划线或者单细胞分选仪，但已被分离出的海洋微生物仍然很少于1%，而微生物的生理学、生物地球化学和生态学等机理和特性不容易从自然界中直接获得，将微生物从自然环境中分离出来并建立纯培养，是研究其基因序列、形态特征、生理特征和生态特征的重要基础。然而，由于海洋微生物多生活在极端环境，例如嗜压微生物几乎不能在常压环境进分离和培养得到，这限制了我们对海洋微生物的认识和开发利用价值。因此，亟需开发针对海洋高压环境下的微生物有效识别和分选技术。
4.现有技术公开了一种基于单细胞拉曼光谱的好氧不产氧光合细菌检测方法，实现了环境水体的好氧不产氧光合细菌单细胞检测。且其采用拉曼光谱检测是非破坏性检测，检测出的好氧不产氧光合细菌可用于单细胞分选和测序。但由于深海微生物所生活的环境特殊，上述方案并不适用于深海微生物的识别与分选。


技术实现要素：

5.本发明为了解决以上至少一种技术缺陷，提供一种海洋原位环境单细胞高通量分选装置及方法，在高压环境下，通过光学和光谱检测，实现海洋微生物的高通量单细胞识别和分选，提高海洋微生物的可培养性。
6.为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种海洋原位环境单细胞高通量分选装置，包括富集微生物注入系统、耐压可视分选舱、环壁温度控制系统、增压系统、环压控制系统、光学识别系统、自动分选系统和数据采集与处理系统；其中：所述富集微生物注入系统用于培养并向耐压可视分选舱注入含微生物的菌液；所述耐压可视分选舱内设置有载物芯片，所述载物芯片由可视材料制成，内嵌有刻蚀微流体通道，用于实现富集微生物在通道内分散通过；富集微生物微通过载物芯片时，通过光学识别系统对微生物进行观察和识别；耐压可视分选舱出口端与所述自动分选
系统连接，自动分选系统根据光学识别系统对微生物识别的结果对微生物进行自动分选；所述环壁温度控制系统用于保证耐压可视分选舱内部温度一致；所述增压系统用于满足耐压可视分选舱内部压力与所述富集微生物注入系统内部压力一致的功能需求；所述环压控制系统用于根据自动分选系统内压力值变化保持耐压可视分选舱内部压力与其一致，避免载物芯片承受压差产生形变或破坏；所述富集微生物注入系统、环壁温度控制系统、增压系统、环压控制系统、光学识别系统、自动分选系统均与所述数据采集与处理系统电性连接。
7.上述方案中，载物芯片上设置有微细进出通道，进入通道主要是从富集微生物注入系统里面泵入含微生物的菌液，以及从增压系统里面注入气体和液体增压。
8.上述方案中，提出了一种载物芯片，实现微生物的分散通过，通过光学识别系统进行观察识别后，由自动分选系统智能地进行分选，实现了在高压环境下，通过光学和光谱检测对海洋微生物的高通量单细胞识别和分选过程，有效提高海洋微生物的可培养性。
9.本方案针对目前海洋微生物难分离的难题，提出了针对高压环境进行高通量单细胞分选的装置与技术。相对于现有的常压分离培养，能够满足微生物在深海原位高压环境进行富集、分离，解决深海原位嗜压菌在常压环境培养不能存活或者表达差异等难题。另一方面，本方案相比常规的富集、平板划线分离技术，提供了一种根据特定形态和代谢特征高通量筛选微生物的思路与方法，既解决海洋高压环境微生物在脱离高压环境富集、分离、培养困难的问题，又可以实现高压情况下，单细胞尺度的海洋微生物高通量识别和筛选难题，提高分离效率。
10.其中，所述富集微生物注入系统包括微流泵、高压微生物富集培养室和进口压力检测装置；其中：所述微流泵控制端与所述数据采集与处理系统电性连接；所述微流泵输入端与所述高压微生物富集培养室的出液端连接，输出端通过进口压力检测装置与所述耐压可视分选舱入口端连接；所述高压微生物富集培养室用于培养含微生物的菌液，并通过所述微流泵注入耐压可视分选舱中。
11.其中，所述耐压可视分选舱还包括耐压可视腔、环壁载冷/热腔和环壁高压腔；其中：耐压可视腔由耐压和防腐金属材料制成，其正面和背面镶嵌耐压可视材料，整个可承受5000米水深的压力，其与增压系统连接；所述载物芯片设置在所述耐压可视腔中央；载物芯片的微流体通道入口与所述富集微生物注入系统连接，其出口为耐压可视分选舱的出口端，与所述自动分选系统连接；所述环壁高压腔设置在耐压可视腔外环，用于保护载物芯片在耐压可视腔中不受损坏；所述环壁高压腔与增压系统、环压控制系统连接；所述环壁载冷/热腔包裹在耐压可视腔外壁，用于装载载冷/热流体，并通过载冷/热流体与环壁温度控制系统连接。
12.上述方案中，耐压可视腔设置有放空阀，其输出端与数据采集与处理系统电性连接，方便进行腔内的压力调节。为了保护载物芯片在耐压可视腔内不受损坏，耐压可视腔设置有环壁高压腔，在耐压可视腔的外环同时增压，并且设置有环压控制系统，根据耐压可视腔压力变化自动增减环壁高压腔的压力，实现耐压可视腔和环壁高压腔的压力平衡，保证载物芯片承受最小的压力差，而不受破坏。
13.其中，所述环壁温度控制系统采用循环制冷/热装置和温度传感器；所述循环制冷/热装置控制端与所述数据采集与处理系统电性连接，用于制冷/热并使环壁载冷/热腔内的载冷/热流体循环流动；所述温度传感器探头设置在耐压可视腔内，其信号输出端与所
述数据采集与处理系统电性连接。
14.上述方案中，耐压可视腔的温度主要是通过在环壁载冷/热腔内注入载冷/热流体，并且通过将流体进行循环制冷或者加热保证环壁载冷/热腔内流体的低温或者高温状态，然后通过载冷/热流体与耐压可视腔内的热交换保证耐压可视腔内的低温或者高温状态。
15.其中，所述增压系统包括空气压缩机、增压泵、储气罐、调压阀和压力传感器；所述空气压缩机、增压泵、储气罐、调压阀依次连接后，与所述耐压可视腔、环壁高压腔分别连接；所述压力传感器探头设置在耐压可视腔内，其信号输出端与所述数据采集与处理系统电性连接。
16.上述方案中，温度传感器、压力传感器的设置，用于在整个微生物分选过程中，对耐压可视腔的温度和压力进行测量和监控。
17.其中，所述环压控制系统包括环压检测装置、第一回压跟踪泵、回压检测装置、回压阀、缓冲罐和第二回压跟踪泵；其中：所述环压检测装置探头设置在所述环壁高压腔内，其输出端与所述数据采集与处理系统电性连接；所述回压跟踪泵与所述环壁高压腔连接，其控制端与所述数据采集与处理系统电性连接；所述回压检测装置检测端与所述耐压可视腔连接，其信号输出端与所述数据采集与处理系统电性连接；所述回压阀一端与所述自动分选系统连接，另一端通过缓冲罐与第二回压跟踪泵连接；所述第二回压跟踪泵控制端与所述数据采集与处理系统电性连接。
18.其中，所述光学识别系统采用光谱/光学观察模块，在富集微生物微通过载物芯片时，通过光谱/光学观察模块对微生物进行观察和识别，并将识别结果发送至所述数据采集与处理系统。
19.在富集的微生物通过载物芯片的过程中，利用光谱/光学观察模块对微生物进行观察和识别。可以通过高分辨光学显微镜在芯片上方观测对单细胞的形态进行识别，以及通过拉曼光谱对胞内的标志生物化合物进行识别，结合光学和光谱学识别信号，可判定芯片中的微生物是否为研究人员需要的目标微生物。
20.其中，所述自动分选系统包括智能控制三通模块、目标微生物存储模块和非目标微生物存储模块；其中，目标微生物存储模块、非目标微生物存储模块分别连接在智能控制三通模块的两个连接端上，智能控制三通模块另一个连接端与所述耐压可视分选舱出口端连接；智能控制三通模块控制端与所述数据采集与处理系统电性连接。
21.上述方案中，在耐压可视腔的出口端设置有自动分选系统，对识别的微生物进行定向分选。自动分选系统主要是通过智能控制三通模块控制，智能控制三通模块为自动启闭的三通，当识别的单细胞被判定为目标微生物时，目标微生物存储模块通路的阀门打开，单细胞进入目标微生物存储模块。当识别的单细胞被判定为非目标微生物时，则开启目标微生物存储模块通路，该细胞进入目标微生物存储模块，以此达到高通量单细胞分选的目的。目标微生物存储模块可根据实验需要，选择常压容器或高压容器，容器内均装有相应培养基，满足分选后的微生物继续培养的需求。
22.本方案还提供一种海洋原位环境单细胞高通量分选方法，采用一种海洋原位环境单细胞高通量分选装置实现，具体包括以下步骤：s1：根据富集微生物注入系统的压力值确定耐压可视分选舱内的压力值；通过增
压系统往耐压可视腔内注入气体，使得耐压可视腔内的压力值与富集微生物注入系统一致；s2：打开环压控制系统，使得耐压可视腔与环壁高压腔的压力一致；s3：根据富集微生物注入系统内的温度值确定耐压可视腔内的温度值，通过开启环壁温度控制系统，使得环壁载冷/热腔内的温度值与耐压可视腔内的温度值一致；s4：对光学识别系统进行调试，使其能清楚的观测到载物芯片内的情况；s5：将含微生物的菌液从富集微生物注入系统通过微流泵注入耐压可视腔中，使得菌液缓慢通过载物芯片，使其能以单细胞的形式在刻蚀通道内通过；打开环壁温度控制系统，保持液体流出耐压可视腔时，耐压可视腔出口端压力恒定；s6：在菌液通过载物芯片过程中，通过光学识别系统充分观测采集细胞的形态，以及胞内和胞外代谢化合物的光谱学信息，判断该细胞是否为目标微生物，并将识别结果发送至数据采集与处理系统；s7：自动分选系统根据识别结果智能开启智能控制三通模块，将目标微生物送至目标微生物存储模块中，将非目标微生物送至非目标微生物存储模块中；s8：待目标微生物存储模块中的目标微生物数量符合，结束分选过程。
23.其中，在执行步骤s1之前，还需要对海洋原位环境单细胞高通量分选装置进行预处理，具体为：打开耐压可视腔出口端，通过泵入去离子水对耐压可视腔进行反复清洗；待冲洗干净后，泵入75%酒精；待耐压可视腔内酒精完全注满后，关闭耐压可视腔，静置24小时，再将耐压可视腔中的酒精放空即完成预处理。
24.在整个分选过程中，保持耐压可视腔内的压力、温度值与微生物最初所在的富集微生物注入系统内的压力、温度环境一致，使得微生物在原位高压情况内实现分选。在分选过程中，打开环压控制系统，根据耐压可视腔内的压力值变化保持环壁高压腔内的压力值与其一致，使得载物芯片不承受压差，不产生形变和破坏。
25.本方案提出的海洋微生物高压环境高通量单细胞分选芯片及分选技术，能够实现海洋高压环境下，微生物的识别和分选，满足后续纯化培养的需求。相比目前传统的常压环境富集、分离海洋微生物的技术，可有效的解决海洋耐压菌、嗜压菌在常压环境下存活率低，且深海土著特征在常压环境下不能有效表达等难题，解决目前海洋微生物培养度低，难培养纯菌的问题。同时，本方案可以实现高压环境下，单细胞尺度的高通量识别和自动分选，相比常规的微生物分离培养技术，有效的提高了微生物培养、纯化的效率。
26.与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：本发明提出了一种海洋原位环境单细胞高通量分选装置及方法，提出了一种载物芯片，实现微生物的分散通过，通过光学识别系统进行观察识别后，由自动分选系统智能地进行分选，实现了在高压环境下，通过光学和光谱检测对海洋微生物的高通量单细胞识别和分选过程，有效提高海洋微生物的可培养性。
附图说明
27.图1为本发明中的海洋原位环境单细胞高通量分选装置的结构示意图；图2为本发明中的数据采集与处理系统与各个系统模块连接的示意图；图3为本发明中的海洋原位环境单细胞高通量分选方法的流程示意图；
其中：1、富集微生物注入系统；11、微流泵；12、高压微生物富集培养室；13、进口压力检测装置；2、耐压可视分选舱；21、载物芯片；22、环壁载冷/热腔；23、放空阀；3、环壁温度控制系统；31、循环制冷/热装置；32、温度传感器；4、增压系统；41、空气压缩机；42、增压泵；43、储气罐；44、调压阀；45、压力传感器；5、环压控制系统；51、环压检测装置；52、第一回压跟踪泵；53、回压检测装置；54、回压阀；55、缓冲罐；56、第二回压跟踪泵；6、光学识别系统；7、自动分选系统；71、智能控制三通模块；72、目标微生物存储模块；73、非目标微生物存储模块；8、数据采集与处理系统。
具体实施方式
28.附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；本实施例为完整的使用示例，内容较丰富为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
29.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
30.实施例1如图1、图2所示，本实施例提出一种海洋原位环境单细胞高通量分选装置，包括富集微生物注入系统1、耐压可视分选舱2、环壁温度控制系统3、增压系统4、环压控制系统5、光学识别系统6、自动分选系统7和数据采集与处理系统8；其中：所述富集微生物注入系统1用于培养并向耐压可视分选舱2注入含微生物的菌液；所述耐压可视分选舱2内设置有载物芯片21，所述载物芯片21由可视材料制成，内嵌由刻蚀微流体通道，用于实现富集微生物在通道内分散通过；富集微生物微通过载物芯片21时，通过光学识别系统6对微生物进行观察和识别；耐压可视分选舱2出口端与所述自动分选系统7连接，自动分选系统7根据光学识别系统6对微生物识别的结果对微生物进行自动分选；所述环壁温度控制系统3用于保证耐压可视分选舱2内部温度一致；所述增压系统4用于令耐压可视分选舱2内部压力与所述富集微生物注入系统1内部压力一致；所述环压控制系统5用于根据自动分选系统7内压力值变化保持耐压可视分选舱2内部压力与其一致，避免载物芯片21承受压差产生形变或破坏；所述富集微生物注入系统1、环壁温度控制系统3、增压系统4、环压控制系统5、光学识别系统6、自动分选系统7均与所述数据采集与处理系统8电性连接。
31.在具体实施过程中，载物芯片21上设置有微细进出通道，进入通道主要是从富集微生物注入系统1里面泵入含微生物的菌液，以及从增压系统4里面注入气体和液体增压。
32.在具体实施过程中，本实施例提出了一种载物芯片21，实现微生物的分散通过，通过光学识别系统6进行观察识别后，由自动分选系统7智能地进行分选，实现了在高压环境下，通过光学和光谱检测对海洋微生物的高通量单细胞识别和分选过程，有效提高海洋微生物的可培养性。
33.本实施例针对目前海洋微生物难分离的难题，提出了针对高压环境进行高通量单细胞分选的装置与技术。相对于现有的常压分离培养，能够满足微生物在深海原位高压环境进行富集、分离，解决深海原位嗜压菌在常压环境培养不能存活或者表达差异等难题。另
一方面，本实施例相比常规的富集、平板划线分离技术，提供了一种根据特定形态和代谢特征高通量筛选微生物的思路与方法，既解决海洋高压环境微生物在脱离高压环境富集、分离、培养困难的问题，又可以实现高压情况下，单细胞尺度的海洋微生物高通量识别和筛选难题，提高分离效率。
34.更具体的，所述富集微生物注入系统1包括微流泵11、高压微生物富集培养室12和进口压力检测装置13；其中：所述微流泵11控制端与所述数据采集与处理系统8电性连接；所述微流泵11输入端与所述高压微生物富集培养室12出液端连接，输出端通过进口压力检测装置13与所述耐压可视分选舱2入口端连接；所述高压微生物富集培养室12用于培养含微生物的菌液，并通过所述微流泵11注入耐压可视分选舱2中。
35.更具体的，所述耐压可视分选舱2还包括耐压可视腔、环壁载冷/热腔22和环壁高压腔；其中：耐压可视腔由耐压和防腐金属材料制成，其正面和背面镶嵌耐压可视材料，整个可承受5000米水深的压力，其与增压系统4连接；所述载物芯片21设置在所述耐压可视腔中央；载物芯片21的微流体通道入口与所述富集微生物注入系统1连接，其出口为耐压可视分选舱2的出口端，与所述自动分选系统7连接；所述环壁高压腔设置在耐压可视腔外环，用于保护载物芯片21在耐压可视腔中不受损坏；所述环壁高压腔与增压系统4、环压控制系统5连接；所述环壁载冷/热腔22包裹在耐压可视腔外壁，用于填充载冷/热流体，并通过载冷/热流体与环壁温度控制系统3连接。
36.在具体实施过程中，耐压可视腔设置有放空阀23，其输出端与数据采集与处理系统8电性连接，方便进行腔内的压力调节。为了保护载物芯片21在耐压可视腔内不受损坏，耐压可视腔设置有环壁高压腔，在耐压可视腔的外环同时增压，并且设置有环压控制系统5，根据耐压可视腔压力变化自动增减环壁高压腔的压力，实现耐压可视腔和环壁高压腔的压力平衡，保证载物芯片21承受最小的压力差，而不受破坏。
37.在具体实施过程中，所述环壁温度控制系统3采用循环制冷/热装置31和温度传感器32；所述循环制冷/热装置31控制端与所述数据采集与处理系统8电性连接，用于制冷/热并使环壁载冷/热腔22内的载冷/热流体循环流动；所述温度传感器32探头设置在耐压可视腔内，其信号输出端与所述数据采集与处理系统8电性连接。
38.在具体实施过程中，耐压可视腔的温度主要是通过在环壁载冷/热腔22内注入载冷/热流体，并且通过将流体进行循环制冷或者加热保证环壁载冷/热腔22内流体的低温或者高温状态，然后通过载冷/热流体与耐压可视腔内的热交换保证耐压可视腔内的低温或者高温状态。
39.更具体的，所述增压系统4包括空气压缩机41、增压泵42、储气罐43、调压阀44和压力传感器45；所述空气压缩机41、增压泵42、储气罐43、调压阀44依次连接后，与所述耐压可视腔、环壁高压腔分别连接；所述压力传感器45探头设置在耐压可视腔内，其信号输出端与所述数据采集与处理系统8电性连接。
40.在具体实施过程中，温度传感器32、压力传感器45的设置，用于在整个微生物分选过程中，对耐压可视腔的温度和压力进行测量和监控。
41.更具体的，所述环压控制系统5包括环压检测装置51、第一回压跟踪泵52、回压检测装置53、回压阀54、缓冲罐55和第二回压跟踪泵56；其中：所述环压检测装置51探头设置在所述环壁高压腔内，其输出端与所述数据采集与处理系统8电性连接；所述回压跟踪泵与
所述环壁高压腔连接，其控制端与所述数据采集与处理系统8电性连接；所述回压检测装置53检测端与所述耐压可视腔连接，其信号输出端与所述数据采集与处理系统8电性连接；所述回压阀54一端与所述自动分选系统7连接，另一端通过缓冲罐55与第二回压跟踪泵56连接；所述第二回压跟踪泵56控制端与所述数据采集与处理系统8电性连接。
42.更具体的，所述光学识别系统6采用光谱/光学观察模块，在富集微生物微通过载物芯片21时，通过光谱/光学观察模块对微生物进行观察和识别，并将识别结果发送至所述数据采集与处理系统8。
43.在富集的微生物通过载物芯片21的过程中，利用光谱/光学观察模块对微生物进行观察和识别。可以通过高分辨光学显微镜在芯片上方观测对单细胞的形态进行识别，以及通过拉曼光谱对胞内的标志生物化合物进行识别，结合光学和光谱学识别信号，可判定芯片中的微生物是否为研究人员需要的目标微生物。
44.更具体的，所述自动分选系统7包括智能控制三通模块71、目标微生物存储模块72和非目标微生物存储模块7372；其中，目标微生物存储模块72、非目标微生物存储模块7372分别连接在智能控制三通模块71的两个连接端上，智能控制三通模块71另一个连接端与所述耐压可视分选舱2出口端连接；智能控制三通模块71控制端与所述数据采集与处理系统8电性连接。
45.在具体实施过程中，在耐压可视腔的出口端设置有自动分选系统7，对识别的微生物进行定向分选。自动分选系统7主要是通过智能控制三通模块71控制，智能控制三通模块71为自动启闭的三通，当识别的单细胞被判定为目标微生物时，目标微生物存储模块72通路的阀门打开，单细胞进入目标微生物存储模块72。当识别的单细胞被判定为非目标微生物时，则开启目标微生物存储模块72通路，该细胞进入目标微生物存储模块72，以此达到高通量单细胞分选的目的。目标微生物存储模块72可根据实验需要，选择常压容器或高压容器，容器内均装有相应培养基，满足分选后的微生物继续培养的需求。
46.实施例2更具体的，如图3所示，本方案还提供一种海洋原位环境单细胞高通量分选方法，采用一种海洋原位环境单细胞高通量分选装置实现，具体包括以下步骤：s1：根据富集微生物注入系统1的压力值确定耐压可视分选舱2内的压力值；通过增压系统4往耐压可视腔内注入气体，使得耐压可视腔内的压力值与富集微生物注入系统1一致；s2：打开环压控制系统5，使得耐压可视腔与环壁高压腔的压力一致；s3：根据富集微生物注入系统1内的温度值确定耐压可视腔内的温度值，通过开启环壁温度控制系统3，使得环壁载冷/热腔22内的温度值与耐压可视腔内的温度值一致；s4：对光学识别系统6进行调试，使其能清楚的观测到载物芯片21内的情况；s5：将含微生物的菌液从富集微生物注入系统1通过微流泵11注入耐压可视腔中，使得菌液缓慢通过载物芯片21，使其能以单细胞的形式在刻蚀通道内通过；打开环壁温度控制系统3，保持液体流出耐压可视腔时，耐压可视腔出口端压力恒定；s6：在菌液通过载物芯片21过程中，通过光学识别系统6充分观测采集细胞的形态，以及胞内和胞外代谢化合物的光谱学信息，判断该细胞是否为目标微生物，并将识别结果发送至数据采集与处理系统8；
s7：自动分选系统7根据识别结果智能开启智能控制三通模块71，将目标微生物送至目标微生物存储模块72中，将非目标微生物送至非目标微生物存储模块7372中；s8：待目标微生物存储模块72中的目标微生物数量符合，结束分选过程。
47.更具体的，在执行步骤s1之前，还需要对海洋原位环境单细胞高通量分选装置进行预处理，具体为：打开耐压可视腔的出口端，通过泵入去离子水对耐压可视腔进行反复清洗；待冲洗干净后，泵入75%酒精；待耐压可视腔内酒精完全注满后，关闭耐压可视腔，静置24小时，再将耐压可视腔中的酒精放空即完成预处理。
48.在整个分选过程中，保持耐压可视腔内的压力、温度值与微生物最初所在的富集微生物注入系统1内的压力、温度环境一致，使得微生物在原位高压情况内实现分选。在分选过程中，打开环压控制系统5，根据耐压可视腔内的压力值变化保持环壁高压腔内的压力值与其一致，使得载物芯片21不承受压差，不产生形变和破坏。
49.本实施例提出的海洋微生物高压环境高通量单细胞分选芯片及分选技术，能够实现海洋高压环境下，微生物的识别和分选，满足后续纯化培养的需求。相比目前传统的常压环境富集、分离海洋微生物的技术，可有效的解决海洋耐压菌、嗜压菌在常压环境下存活率低，且深海土著特征在常压环境下不能有效表达等难题，解决目前海洋微生物培养度低，难培养纯菌的问题。同时，本方案可以实现高压环境下，单细胞尺度的高通量识别和自动分选，相比常规的微生物分离培养技术，有效的提高了微生物培养、纯化的效率。
50.实施例3更具体的，为了进一步说明本方案的技术实现过程和技术效果，本实施例涉及的深海嗜甲烷菌的高通量单细胞分选的高压环境的微流控芯片可以实现在原位的高压环境下对富集的深海嗜甲烷菌进行高通量的单细胞分选，满足后续的培养及功能坚定等工作。本实例的核心是耐高压且可视的耐压可视分选舱2。其它部分主要包括增压系统4、环压控制系统5、光学识别系统6、自动分选系统7和数据采集与处理系统8。
51.核心部件耐压可视分选舱2主要包括耐压可视腔、载物芯片21、环壁载冷/热腔22和环壁高压腔。耐压可视腔由耐压和防腐钛合金材料制成，腔体的正面和背面镶嵌耐压可视蓝宝石材料，整个可承受5000米水深的压力。耐压可视腔的中央设有载物芯片21，载物芯片21上设置有微流体通道，将含微生物的菌液从高压微生物富集培养室12通过微流泵11注入耐压可视腔，使得菌液缓慢通过载物芯片21，以及从增压系统4注入甲烷。在富集微生物注入系统1和耐压可视分选舱2之间设置有进口压力检测装置13。耐压可视腔出口端主要是用于分选后的含深海嗜甲烷菌富集液的流体离开耐压可视腔进入自动分选系统7。在出口端设置环压控制系统5进行回压控制，主要包括回压检测装置53、回压阀54、缓冲罐55和第二回压跟踪泵56，保证含微生物流体在设定压力条件下流出分选系统，在整个分选过程中，耐压可视腔内的压力保持恒定。耐压可视腔设置有放空阀23，方便进行腔内的压力调节。耐压可视腔设置有温度传感器32和压力传感器45，对深海嗜甲烷菌分选过程中，腔内的温度和压力进行测量和监控。载物芯片21由可视材料做成，内嵌有刻蚀微流体通道，便于富集的深海嗜甲烷菌液进入耐压可视分选腔后在芯片内以较小的流速通过，实现单细胞在通道内进行分散通过。为了保护载物芯片21在耐压可视腔内不受损坏，耐压可视腔设置有环壁高压腔，在耐压可视腔的外环同时增压，并且设置有环压控制系统5，根据耐压可视腔压力变化自动增减环壁高压腔的压力，实现耐压可视腔和环壁高压腔的压力平衡，保证载物芯片
21承受最小的压力差，而不受破坏。耐压可视腔的温度主要是通过在环壁载冷/热腔22内注入载冷/热流体，如含乙二醇的制冷溶液，并且通过将流体进行循环制冷/热装置31保证环壁腔内流体保持4℃低温状态，然后通过载冷流体与耐压可视腔内的热交换保证耐压可视腔内的低温状态。
52.在富集的微生物通过分选芯片的过程中，利用光谱/光学观察模块对微生物进行观察和识别。如可以通过高分辨光学显微镜在芯片上方观测对单细胞的形态进行识别，以及通过拉曼光谱对胞内的标志生物化合物进行识别，结合光学和光谱学识别信号，可判定芯片中的微生物是否为深海嗜甲烷菌。在耐压可视腔的出口设置有自动分选系统7，对识别的微生物进行定向分选。自动分选系统上设置有智能控制三通模块71，智能控制三通模块71是自动启闭的三通，当识别的单细胞被判定为深海嗜甲烷菌时，目标微生物存储模块72通路的阀门打开，单细胞进入目标微生物存储模块72。当识别的单细胞被判定为非深海嗜甲烷菌时，则开启非目标微生物存储模块73收集通路，该细胞进入非目标微生物存储模块73，以此达到高通量单细胞分选的目的。目标微生物存储模块72可以为常压容器，也可以为高压容器，满足分选后的深海嗜甲烷菌继续在高压环境内培养的需求。
53.本实例涉及的高通量的海洋微生物高压环境单细胞分选技术主要是需要在耐压可视腔内构建与深海嗜甲烷菌在深海环境中生活一样的高压环境。首先清洗耐压可视腔，打开进出口，泵入去离子水反复冲洗，待冲洗干净后，泵入75%酒精，待耐压可视腔内酒精完全注满后，关闭耐压可视腔，静置24小时，放空。然后根据富集微生物注入系统1内的初始压力值12mpa确定耐压可视腔内的压力值，通过增压系统4，往耐压可视腔内注入ch4气体，使耐压可视腔内的压力增至12mpa；并打开环压控制系统5，使得环壁高压腔内的压力值与耐压可视腔内的压力一致。在分选过程中，倘若耐压可视腔内有压力变化，通过第一回压跟踪泵52向环壁高压腔内注入气体，或者打开阀门泄压，使得环壁高压腔的压力与耐压可视腔的压力保持一致。然后，根据富集微生物注入系统1内的温度值4℃确定耐压可视腔内的温度值，通过开启环壁温度控制系统3，使得环壁载冷/热腔内的温度值与耐压可视腔内的温度一致。然后，调试好光谱/光学观察模块，使其能清楚的观测到载物芯片21内情况。然后将含深海噬甲烷菌的菌液从富集微生物注入系统1通过微流泵11注入耐压可视腔，并且打开出口回压，设定出口压力为11.5mpa，使得菌液缓慢通过载物芯片21，使其能以单细胞的形式在刻蚀通道内通过，在菌液通过载物芯片21的过程中，开启谱/光学观察模块，充分观测采集细胞的形态，以及单细胞微生物的光谱学信息，判定该细胞是否为嗜甲烷菌，若为嗜甲烷菌，开启自动分选系统7的阀门，使其进入嗜甲烷菌收集模块，倘若不是，进入非目标菌收集模块。当富集微生物注入系统1内的流体全部被分选识别后，分选过程结束。在整个分选过程中，保持耐压可视腔内的压力、温度值与深海嗜甲烷菌最初所在的富集微生物注入系统1内的压力、温度环境一致，使得微生物在原位高压情况内实现分选。在分选过程中，打开环压控制系统5，根据耐压可视腔内的压力值变化保持环壁高压腔内的压力值与其一致，使得载物芯片21不承受压差，不产生形变和破坏。
54.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求
的保护范围之内。