一种抗前胃泌素释放肽单链抗体及其制备方法与用途与流程

1.本发明属于抗体药物技术领域，涉及一种抗前胃泌素释放肽单链抗体及其制备方法与用途。


背景技术：

2.肺癌(lung cancer)是发病率和死亡率都极高的恶性肿瘤，其中小细胞肺癌(small cell lung cancer，sclc)是恶性度较高，治愈率较低的一种肺癌，约占肺癌的15％-20％。sclc的特点是瘤体倍增时间短、预后差、分化程度最低、极易转移，5年生存率仅为1％-7％。但sclc对放化疗敏感，如早期发现采用全身化疗伴局部放疗等综合治疗手段，3年生存率可达30％以上。但是sclc患者早期症状不明显，通过病理学和影像学检查获得早期诊断殊为不易，确诊时病情往往已经发展至广泛期，错过最佳治疗时间，因此sclc的早期诊断和治疗至关重要。
3.前胃泌素释放肽(pro-gastrin releasing peptide，pgrp)是sclc的可靠、灵敏、特异性的肿瘤标志物，在血液中相对稳定。在物理诊断尚不明确前即可检测到pgrp，阳性率高达76％，已被用于sclc早期临床诊断。pgrp由信号肽、胃泌素释放肽(gastrin releasing peptide，grp)、酶切位点、恒定区以及可变的羧基末端组成。
4.随着基因工程技术的发展，治疗性抗体药物逐渐占据全球市场，用于对恶性肿瘤和自身免疫病等疾病的诊断和治疗。抗pgrp单克隆抗体及基因工程抗体的研制是sclc靶向诊治方向之一，可为sclc病人的诊断和治疗奠定一定的技术和物质基础。
5.人源化基因工程抗体包括全长抗体以及小型抗体等。其中，全长抗体包括嵌合抗体、cdr移植型抗体；小型抗体包括单链抗体、fab及f(ab)’2片段抗体，双特异性抗体以及域抗体等。其中，单链抗体(single chain antibody，scfv)是抗体分子保留抗原结合部位的最小功能片段，其全长约为完整抗体分子的1/6。scfv的关键技术是通过一段约15～25个氨基酸残基构成的连接肽将抗体的重链可变区(heavy-chain variable region，vh)和轻链可变区(light-chain variable region，v
l
)进行连接重组。相对于完整抗体，scfv能够降低其免疫原性，且scfv分子量较小，更容易进入肿瘤组织。人们还可以根据治疗的需要，制备新型抗体以携带治疗药物，并且可以采用原核、真核细胞等多种方式大量表达，降低生产成本。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的是提供一种抗前胃泌素释放肽单链抗体，以能够更好的用于sclc靶向诊治。
7.为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种抗前胃泌素释放肽单链抗体，所述的单链抗体包含重链可变区vh和轻链可变区v
l
，并可选的包含用于连接重链可变区vh和轻链可变区v
l
的连接肽，
8.所述的重链可变区vh包含hcdr1(重链互补决定区1)、hcdr2(重链互补决定区2)、
hcdr3(重链互补决定区3)，三者的氨基酸序列分别如seq id no.5-7所示，
9.所述的轻链可变区v
l
包含lcdr1(轻链互补决定区1)、lcdr2(轻链互补决定区2)、lcdr3(轻链互补决定区3)，三者的氨基酸序列分别如seq id no.8-10所示。
10.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种抗前胃泌素释放肽单链抗体，其中所述的重链可变区vh的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述的轻链可变区v
l
的氨基酸序列如seq id no.4所示。
11.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种抗前胃泌素释放肽单链抗体，其中所述的连接肽为(gly4ser)3。
12.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种抗前胃泌素释放肽单链抗体，其中所述的单链抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
13.本发明的第二个目的是提供一种上述抗前胃泌素释放肽单链抗体的制备方法，以能够更好的制备上述抗前胃泌素释放肽单链抗体，制得抗前胃泌素释放肽单链抗体可更好的用于sclc靶向诊治。
14.为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种上述抗前胃泌素释放肽单链抗体的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
15.(1)将表达所述的抗前胃泌素释放肽单链抗体的核苷酸序列重组至原核表达载体中，构建获得表达抗前胃泌素释放肽单链抗体的重组表达载体，导入基因工程菌中构建重组工程菌；
16.(2)将步骤(1)得到的重组工程菌进行发酵培养，对离心获得的菌体进行分离纯化，获得纯化的所述的抗前胃泌素释放肽单链抗体。
17.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种上述抗前胃泌素释放肽单链抗体的制备方法，其中步骤(1)中，所述的核苷酸序列如seq id no.2所示。
18.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种上述抗前胃泌素释放肽单链抗体的制备方法，其中步骤(1)中，所述的原核表达载体选自pet-28a(+)、pet-32a(+)、pgex-4t-1或pe-sumo。
19.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种上述抗前胃泌素释放肽单链抗体的制备方法，其中步骤(1)中，所述的基因工程菌选自大肠杆菌bl21(de3)、bl21、bl21(ai)、bl21(de3)plyss或rosetta(de3)。
20.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种上述抗前胃泌素释放肽单链抗体的制备方法，其中步骤(2)中，
21.所述的发酵培养的过程中加iptg过夜诱导培养，
22.所述的分离纯化是收集离心菌体，超声破碎后利用镍金属螯合层析柱进行蛋白纯化。
23.本发明的第三个目的是提供上述抗前胃泌素释放肽单链抗体用于制备诊断或治疗肺癌的试剂或药物的用途，以能够更好的用于肺癌，尤其是sclc的靶向诊治。
24.为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供上述抗前胃泌素释放肽单链抗体用于制备诊断或治疗肺癌的试剂或药物的用途。
25.本发明的有益效果在于，利用本发明的抗前胃泌素释放肽单链抗体及其制备方法，能够更好的制备抗前胃泌素释放肽单链抗体，制得抗前胃泌素释放肽单链抗体可更好
的用于sclc靶向诊治。
26.本发明利用连接肽(gly4ser)3连接重链和轻链的可变区，获得prgp-scfv单链抗体基因，并成功构建原核表达系统。通过亲和纯化获得带有6
×
his标签的目标单链抗体；通过western-blot和elisa检测单链抗体的特异性和亲和性，表明pgrp-scfv单链抗体可特异性结合pgrp，pgrp-scfv具有靶向性。因此，本发明的prgp-scfv单链抗体具有潜在的医学和药学价值，为肿瘤的靶向性治疗提供了一种新的方法。
附图说明
27.图1为实施例1中构建的pet-pgrp-scfv重组质粒鉴定图，其中泳道1：v
l pcr扩增产物；泳道2：v
h pcr扩增产物；泳道3：pgrp-scfv pcr扩增产物；泳道4：linker pcr扩增产物。
28.图2为实施例2中纯化的抗pgrp单链抗体的sds-page图。
29.图3为实施例3中抗pgrp单链抗体western-blotting鉴定图。
30.图4为实施例3中初始浓度为0.5mg/ml的抗pgrp单链抗体在不同温度下放置3h后的浓度图。
31.图5为实施例3中初始浓度为0.5mg/ml的抗pgrp单链抗体在4℃放置不同时间后的sds-page检测结果图。
具体实施方式
32.以下结合实施例和附图对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
33.实施例1：pgrp-scfv原核表达系统的构建
34.1、pgrp-scfv单链抗体表达基因获取
35.(1)pgrp-scfv单链抗体表达基因扩增
36.以分泌抗前胃泌素释放肽单克隆抗体的细胞株cdna为模板，通过pcr方法扩增v
l
、vh和连接肽基因片段，通过胶回收试剂盒(takaraagarose gel dna purification kit)纯化获得3段基因片段。以3种基因片段为模板，进行pcr扩增，获得pgrp-scfv单链抗体表达基因。pcr反应体系如下：10
×
buffer：5μl，dntp mix：5μl，f、r各1.5μl，模板(v
l
、vh和连接肽基因片段)各2μl，taq dna聚合酶：0.5μl，ddh2o补足到50μl。pcr扩增反应条件：94℃30s、54℃30s、72℃1min,30循环；72℃10min。pcr反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
37.将完整的pgrp-scfv表达基因连接到pgem-t easy vector，4℃过夜连接反应：2
×
快速连接缓冲液：5μl；pgem-t easy vector：0.5μl；pcr产物：3.5μl；t
4 dna连接酶：1μl。
38.(2)连接产物的转化
39.取出-80℃保存的大肠杆菌dh5α感受态细胞，放在冰上缓慢解冻；将连接产物加入感受态细胞中混匀，冰上放置30min；42℃热激90s；冰浴2min后，加入800μl无抗性的lb培养基；37℃培养45min；8000rpm离心1min，弃大部分上清，留约50～100μl，重悬菌体，选择amp抗性的lb平板，涂板；晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。
40.(3)重组质粒的筛选与鉴定
41.挑取平板上长势良好的单克隆菌落，用阳性克隆筛选的方法进行菌株的筛选。将阳性克隆转至5ml具有氨苄抗性的液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养，用质粒小提试剂
盒提取质粒并鉴定。
42.2、原核表达载体构建
43.(1)用限制性内切酶ecorⅰ和notⅰ分别对含有单链抗体表达基因片段的质粒pgem-t-pgrp-scfv和原核表达质粒载体pet-28a(+)进行双酶切，37℃水浴4h；1.5％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段与载体，将目的片段和载体回收，t
4 dna ligase连接，4℃过夜，将pgrp-scfv表达基因重组至pet-28a(+)中。
44.表1 pgem-t-pgrp-scfv和pet-28a(+)的双酶切体系
[0045][0046][0047]
表2 pet-pgrp-scfv的连接反应体系
[0048][0049]
(2)pet-pgrp-scfv重组质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，通过kan抗性筛选后，提取质粒并鉴定，结果如图1所示。结果显示pet-pgrp-scfv重组质粒构建成功。
[0050]
实施例2：抗pgrp单链抗体表达纯化
[0051]
1、抗pgrp单链抗体的原核表达
[0052]
(1)将构建好的重组质粒pet-pgrp-scfv转化至大肠杆菌bl21(de3)，在lb固体培养基平板上37℃培养箱中过夜培养。
[0053]
(2)在超净工作台中从平板上挑取bl21/pet-pgrp-scfv单菌落于含有100μg/ml kan的5ml的lb液体培养基中，37℃，180rpm振荡过夜培养。
[0054]
(3)按1:100的比例将过夜培养的菌液转接至100ml lb液体培养基中，37℃摇床培养约2-3h，到od
600
约0.6至0.8；加入不同浓度iptg诱导后，选择不同诱导温度及诱导时间，于180rpm摇床培养；收集菌体，4℃，8500rpm离心15min，去掉上清；预冷的pbs缓冲液重新悬浮菌体并洗涤，4℃，8000rpm离心10min，弃掉上清；用pbs缓冲液将菌体悬浮，加入1mm蛋白
酶抑制剂pmsf，将菌液放置在冰上用超声波细胞破碎仪超声破碎菌体细胞，直至细胞完全破碎。
[0055]
(4)取100μl全菌液加入5
×
sds上样缓冲液，100℃静置5min，以备sds-page电泳检测；将裂解后的全菌液4℃，13000rpm离心30分钟，收集上清，取100μl上清加入5
×
sds上样缓冲液，100℃静置5min，以备sds-page电泳检测；沉淀用pbs缓冲液重悬，取100μl上清加入5
×
sds上样缓冲液，100℃静置5min，以备sds-page电泳检测。蛋白样进行12％sds-page分析。
[0056]
2、抗pgrp单链抗体包涵体蛋白的变性、纯化和复性
[0057]
将表达的菌体沉淀重悬于预冷的50mmol/l tris-hcl、100mmol/l nacl、1mmol/l edta(ph7.0)中溶解，超声破碎细菌，4℃，30000g离心30min。沉淀用3mol/l尿素和50mmol/l tris-hcl(ph7.0)洗涤，30000g，4℃离心30min收集包涵体。6mol/l盐酸胍和0.1mol/l tris-hcl(ph7.0)，于4℃摇动过夜溶解包涵体。4℃，30000g离心30min去除沉淀，用0.45μm滤膜过滤，上清用于纯化。上样于镍金属螯合亲和层析柱，用6mol/l尿素、50mmol/l tris-hcl和50mmol/l咪唑(ph7.0)洗柱，用含有250mmol/l咪唑、6mol/l尿素和50mmol/l tris-hcl洗脱结合在镍柱上的scfv。将洗脱液加到透析袋中用tea缓冲液充分复性24h后继续用pbs透析24h。超滤浓缩样品至适当体积，bca法测定蛋白含量，-20℃分装保存。
[0058]
sds-page分析结果如图2所示，结果显示，成功纯化出带有6
×
his标签的抗pgrp单链抗体。
[0059]
实施例3：抗pgrp单链抗体鉴定
[0060]
1、抗pgrp单链抗体western-blotting检测
[0061]
取纯化产物5μl，进行12％sds-page电泳；电泳完成后将其转移至醋酸纤维素膜上，100v转膜1h30min；tbst洗涤5min，5％脱脂奶粉4℃过夜封闭，基于表达产物末端的6个his-tag短肽，用鼠抗his-tag抗体室温孵育2h，pbs充分洗涤3次后，加入稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg多抗，室温孵育1h，pbs-tween洗涤3次，每次10min，再用二氨基联苯胺(dba)显色。
[0062]
western-blotting检测结果如图3所示，结果显示融合蛋白6
×
his-pgrp-scfv纯化成功。
[0063]
2、抗pgrp单链抗体亲和力和稳定性检测
[0064]
采用竞争性elisa方法进行抗pgrp单链抗体的scfv抗原结合活性，即抗pgrp单链抗体亲和力测定。具体检测方法为：
[0065]
抗原pgrp
(31-98)
(制备方法见cn200510065889.2)和bsa蛋白分别用pbs稀释至3μg/ml，并分别以100μl/孔包被elisa板孔，4℃孵育过夜；弃尽板孔内溶液，pbst洗涤3次，每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h；弃尽板孔内溶液，加入不同浓度配比的抗-pgrp-scfv和单克隆抗体100μl，阴性对照组加100μl pbs，4℃孵育1h，pbs(含0.25％tween20)洗板3次，加hrp标记的羊抗鼠ig100μl(2000
×
)；4c孵育1h，pbs(含0.25％tween20)洗板3次；加显色液(dab)室温反应约15min，2m的浓硫酸终止反应，酶标仪读取450nm波长处吸光度值(od值)，记录读数。
[0066]
利用elisa方法检测6
×
his-pgrp-scfv抗体与pgrp
(31-98)
亲和能力的强弱。具体而言，在上述elisa实验的基础上，将6
×
his-pgrp-scfv抗体稀释后，检测不同浓度梯度下其
亲和能力。
[0067]
利用sds-page方法检测6
×
his-pgrp-scfv抗体的稳定性。具体而言，将单链抗体置于不同温度下3h，取样检测其浓度变化；同时将单链抗体在4℃条件下放置不同时间，取样sds-page电泳后通过灰度分析检测其降解程度，从而鉴定其稳定性。
[0068]
亲和力检测结果如表3所示，结果显示此单链抗体可以特异性识别并结合pgrp
(31-98)
，且在较低浓度时，依旧保持与前胃泌素释放肽(pgrp)较好的亲和能力。
[0069]
稳定性检测结果如图4和图5所示，结果显示：将初始浓度为0.5mg/ml的单链抗体分别置于25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃温度下3h后，单链抗体浓度分别为0.420mg/ml、0.289mg/ml、0.092mg/ml、0.032mg/ml、0.020mg/ml、0.031mg/ml；将单链抗体在4℃条件下放置1d、2d、3d、5d、7d后，该抗体分别降解16.74％、39.87％、40.97％、70.94％、79.02％。
[0070]
表3抗pgrp单链抗体亲和力检测
[0071][0072][0073]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。