皮肌炎特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途

1.本公开属于生物医药领域，涉及一种皮肌炎特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途。具体来说，本公开涉及一种单克隆抗体，所述抗体特异性结合mda5抗原蛋白，单克隆抗体的制备方法及其前述单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗炎症性肌病或其并发症的药物中的用途。


背景技术：

2.炎症性肌病(inflammatory myopathy，im)是一组以骨骼肌炎性细胞浸润和肌纤维坏死为主要病理特征的异质性疾病。皮肌炎(dermatomyositis，dm)是炎性肌病最常见的亚型，主要表现为不同程度的皮肤、肌肉和肺部受累，成人dm发病率为(1-6)/10万。dm常见的并发症为肺间质病变(interstial lung diseases，ild)，其发生率为23.1％-65％。临床上观察到一类并没有明显的肌肉受累表现的dm称为临床无肌病性皮肌炎(clinically amyopathic dermatomyositis，cadm)。当cadm患者合并急性间质性肺炎(acute interstitial pneumonia，aip)时，具有起病急、进展快、病死率高的特点，患者6个月内的死亡率高达50％。
3.自从20世纪70年代以来，肌炎特异性抗体(myositis-specific autoantibodies,msas)逐渐在im患者的血清中检测出来。dm的主要抗体包括抗mi-2抗体、抗转录中介因子1-γ抗体、抗mda5抗体和抗基质蛋白2抗体。mda5是一种病毒rna(包括冠状病毒)的细胞内传感器，为黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation related genes，mda5)编码的蛋白，可触发先天免疫反应。21世纪初期从结缔组织病和特发性ild患者的血清抗体中筛选出cadm-140抗体，该抗体所识别的抗原即为mda5蛋白。抗mda5抗体存在于35％的dm患者和75％的cadm患者血清中，且抗体阳性患者伴发急进型ild的发生率显著高于抗体阴性者(50％：6％，p＝0.008)。
4.研究表明，抗mda5抗体水平与dm、cadm患者的皮肤溃疡严重程度、ild病情严重程度以及治疗、预后密切相关。在抗mda5抗体水平≥500u/ml的患者中，溃疡为多发性、深在性，而抗体水平＜500u/ml患者的溃疡较为浅表且单发。相对于抗mda5抗体阴性的患者(aip发生率约为20％)，抗mda5抗体阳性的dm和cadm患者aip发生率较高(4％-33％)，提示抗mda5抗体是aip的血清学标志物。抗mda5抗体阳性dm和cadm患者中ild的发生率(42％-100％)，显著高于抗mda5抗体阴性患者(10％-30％)，而且多数患者合并ild时病情呈急进性或亚急性临床模式，短期内(6个月内)死于ild及其并发症。此外，高滴度抗mda5抗体cadm-ild患者预后较差，且经免疫治疗后，抗mda5抗体滴度显著降低，甚至消失。由此可见，抗mda5抗体定量检测不仅有利于ild进展的早期判断，且对监测疾病活动及治疗效果评价也颇有意义。
5.国内针对抗mda5抗体检测方法均为定性的免疫印迹法和免疫膜条法，检测结果一致性较差，且无法定量检测患者血清中抗mda5抗体水平。因此，如何快速准确诊断此类疾病并定量检测患者血清中抗mda5抗体水平，是目前亟需解决的重要问题。
6.人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向，而噬菌体抗体库技术的出现为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台，并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一。噬菌体展示技术在1985年由smith首次建立，经过三十多年的发展和完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体抗体库技术是运用聚合酶链反应(pcr)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把fab段或单链抗体(scfv)表达在噬菌体的表面，从而筛选并富集特异性抗体。已经提出了可以从单pot抗体文库系统中筛选出几乎所有与抗原发生特异性反应的重组人单克隆抗体可能性。因此，当使用噬菌体抗体技术时，能获得可应用于体内诊断或治疗的各种抗体片段。


技术实现要素：

7.发明要解决的问题
8.基于现有技术中存在的问题，本公开筛选出一种针对抗皮肌炎特异性抗原mda5的人源性单克隆抗体。
9.用于解决问题的方案
10.(1)分离的抗mda5的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，其中，所述轻链可变区包含如下所示序列中的一种或多种：
11.(a1)如seq id no：3所示的氨基酸序列；
12.(a2)与seq id no：3所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
13.(a3)如seq id no：4所示的氨基酸序列；
14.(a4)与seq id no：4所示的序列相比，存在1个或2个保守突变的氨基酸序列；
15.(a5)如seq id no：5所示的氨基酸序列；
16.(a6)与seq id no：5所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
17.所述轻链可变区为根据imgt的分析方法编码。
18.(2)根据(1)所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，其中，所述重链可变区包含如下所示序列中的一种或多种：
19.(b1)如seq id no：6所示的氨基酸序列；
20.(b2)与seq id no：6所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
21.(b3)如seq id no：7所示的氨基酸序列；
22.(b4)与seq id no：7所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
23.(b5)如seq id no：8所示的氨基酸序列；
24.(b6)与seq id no：8所示的序列相比，存在1个、2个或3个保守突变的氨基酸序列；
25.所述重链可变区为根据imgt的分析方法编码。
26.(3)根据(1)或(2)所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述重链可变区包含hcdr1、hcdr2和hcdr3；并且，
27.所述lcdr1包含如seq id no：3所示的氨基酸序列，所述lcdr2包含如seq id no：4所示的氨基酸序列，所述lcdr3包含如seq id no：5所示的氨基酸序列；
28.所述hcdr1包含如seq id no：6所示的氨基酸序列，所述hcdr2包含如seq id no：7
所示的氨基酸序列，所述hcdr3包含如seq id no：8所示的氨基酸序列。
29.(4)根据(1)-(3)任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含如下所示序列中的一种或多种：
30.(i)重链可变区包含如seq id no：22所示的氨基酸序列，和轻链可变区包含如seq id no：21所示的氨基酸序列；
31.(ii)与(i)所示序列相比，存在保守突变的序列；
32.优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含如下所示序列中的一种或多种：
33.(iii)重链包含如seq id no：18所示的氨基酸序列，和轻链可变区包含如seq id no：20所示的氨基酸序列；
34.(iv)与(iii)所示序列相比，存在保守突变的序列。
35.(5)一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自(a)-(d)中的任一项：
36.(a)包含如seq id no：17、seq id no：19任一序列或其组合所示的核苷酸序列；
37.(b)包含如seq id no：17、seq id no：19任一序列或其组合所示的核苷酸序列的反向互补序列的核苷酸序列；
38.(c)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(a)-(b)中的任一项所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
39.(d)与(a)-(c)中的任一项所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的序列。
40.(6)一种载体，其中，所述载体包含根据(5)所述的多核苷酸。
41.(7)一种分离的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含如(6)所述的载体。
42.(8)一种制备稳定表达目标蛋白的宿主细胞的方法，其中，所述方法包含利用(6)所述的载体，转化初始宿主细胞的步骤。
43.(9)一种制备目标蛋白的方法，所述方法包含利用(7)所述的宿主细胞或通过(8)所述的方法，制备所述目标蛋白。
44.(10)根据(9)所述的方法制备的抗体或其结合片段。
45.(11)一种检测抗mda5抗体的方法，其中，所述方法包括使用(1)-(4)任一项或(10)所述的抗体或其抗原结合片段对待测样品进行检测的步骤；
46.可选地，所述方法包括对待测样品中的抗bp180抗体进行定量的步骤。
47.(12)一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含根据(1)-(4)任一项或根据(10)所述的抗体或其抗原结合片段。
48.(13)一种组合物，其中，所述组合物中含有根据(1)-(4)任一项或根据(10)所述的抗体或其抗原结合片段。
49.(14)根据(1)-(4)任一项或(10)所述的抗体或其抗原结合片段，或根据(13)所述的组合物在如下(1)-(4)至少一项中的用途：
50.(1)检测抗mda5抗体，或制备用于检测抗mda5抗体的试剂或试剂盒；
51.(2)制备用于诊断炎症性肌病或其并发症的试剂或试剂盒；
52.(3)制备用于监测炎症性肌病或其并发症的病情进展的试剂或试剂盒；
53.(4)制备用于研究炎症性肌病或其并发症的致病机理的试剂或试剂盒；
54.可选地，所述炎症性肌病选自如下的至少一种：皮肌炎dm，无肌病性皮肌炎cadm；可选地，所述并发症选自如下的至少一种：肺间质病变ild，急性间质性肺炎aip。
55.(15)一种预防或治疗炎症性肌病或其并发症的方法，其中，使用根据(1)-(4)任一项或(10)所述的抗体或其抗原结合片段，或根据(13)所述的组合物给予受试者；
56.可选地，所述炎症性肌病选自如下的至少一种：皮肌炎dm，无肌病性皮肌炎cadm；可选地，所述并发症选自如下的至少一种：肺间质病变ild，急性间质性肺炎aip。
57.发明的效果
58.本公开筛选得到了抗皮肌炎特异性抗原mda5的人源性单克隆抗体。该抗体活性高、稳定性好，且具有较强的结合mda5的特异性，通过与mda5结合，能够作为定性检测抗mda5抗体阳性的参考标准，也能定量检测炎症性肌病或其并发症患者中抗mda5自身抗体水平，为dm、camd，dm合并ild(又称，dm-ild)，camd合并ild(又称，cadm-ild)等患者诊断、病情监测、预后评估，以及疾病机理研究等提供有效依据，用于im、im-ild患者的临床诊断和治疗。
附图说明
59.图1示出了vl噬菌体文库的单克隆菌pcr琼脂糖凝胶电泳图；其中，lane m:dl2000，lane 1-16:21000076f pata-vk，lane17-32:21000076f pata-vλ。
60.图2示出了kh噬菌体文库的单克隆菌pcr琼脂糖凝胶电泳图；其中，lane m:dl2000，lane 1-48:21000076f pata-scfv-kh。
61.图3示出了λh噬菌体文库的单克隆菌pcr琼脂糖凝胶电泳图；其中，lane m:dl2000，lane 1-48:21000076f pata-scfv-λh。
62.图4示出了对噬菌体展示文库进行单克隆测序分析结果；其中，左图为文库序列轻链分析结果，右图为文库序列重链分析结果。
63.图5示出了重组蛋白mda5的sds-page电泳图；蛋白大小130kda，纯度大于95％。
64.图6示出了抗体不同浓度稀释下的elisa结果。
65.图7示出了76f-mda5-r2p1-g5抗体在a549细胞和raw细胞内表达的蛋白印迹检测结果。
具体实施方式
66.定义
67.在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
68.如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
69.在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
70.虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
71.术语“炎症性肌病”又称“inflammatory myopathy，im”，是一组以骨骼肌炎性细胞浸润和肌纤维坏死为主要病理特征的异质性疾病。“炎症性肌病”与“im”可以互换地使用。
72.术语“皮肌炎”又称“dermatomyositis，dm”，是一种主要累及横纹肌，以淋巴细胞浸润为主的非化脓性炎症病变，可伴有或不伴有多种皮肤损害。术语“皮肌炎”与“dm”可以互换地使用。
73.术语“无肌病性皮肌炎”又称“clinically amyopathic dermatomyositis，cadm”，指仅有皮肤损害或者以皮肤损害为主的皮肌炎类型。“无肌病性皮肌炎”与“cadm”可以互换地使用。
74.术语“肺间质病变”又称“interstial lung diseases，ild”，由多种原因引起的肺间质的炎症性疾病，病变主要累及肺间质，也可累及肺泡上皮细胞及肺血管。“肺间质病变”与“ild”可以互换地使用。
75.术语“急性间质性肺炎”又称“acute interstitial pneumonia，aip”，是一种发展迅速的暴发性肺损伤，为肺的急性损伤性病变。“急性间质性肺炎”与“aip”可以互换的使用。
76.本发明上下文中使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
77.如本公开所使用的，术语“mda5”、“mda5抗原”、“mda5蛋白”可以互换地使用。mda5有2个n端模式识别受体(caspase activation and recruitment domain，card)和一个rna螺旋酶结构域，card结构域负责信号toll样受体转导，而螺旋酶结构域负责识别病毒rna。被病毒感染的细胞，尤其是成纤维细胞、树突状细胞及巨噬细胞高表达mda5，可识别细胞质内病毒衍生的核酸分子，启动i型干扰素通路，并导致一系列炎症介质的产生。
78.如本公开所使用的，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变(例如，氨基酸的置换、插入和/或缺失)。示例性的，保守突变为保守置换。
79.如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出ala向ser或thr的置换、arg向gln、his或lys的置换、asn向glu、gln、lys、his或asp的置换、asp向asn、glu或gln的置换、cys向ser或ala的置换、gln向asn、glu、lys、his、asp或arg的置换、glu向gly、asn、gln、lys或asp的置换、gly向pro的置换、his向asn、lys、gln、arg或tyr的置换、ile向leu、met、val或phe的置换、leu向ile、met、val或phe的置换、lys向asn、glu、gln、his或arg的置换、met向ile、leu、val或phe的置换、phe向trp、tyr、met、ile或leu的置换、ser向thr或ala的置换、thr向ser或ala的置换、trp向phe或tyr的置换、tyr向his、phe或trp的置换、及val向met、ile或leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
80.本公开中的“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺
失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
81.本公开中的术语“噬菌体展示技术”，是将外源蛋白或多肽的dna序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
82.本公开中的术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。
83.本公开中的术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组dna技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于fv，fab，fab’，fab
’‑
sh，f(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scfv)；单域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体(重链抗体)；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。
84.本公开中的术语“单链抗体”(scfv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过有限个氨基酸的短肽(也被称为连接子，linker)连接而成的抗体。
85.本公开中的术语“fab”片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(ch1)。fab’片段因在重链ch1结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与fab片段不同。f(ab’)2抗体片段最初是作为成对fab’片段生成的，在fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。
86.术语“互补决定区”或“cdr区”或“cdr”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。cdr主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的cdr通常被称作cdr1、cdr2和cdr3，从n-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的cdr被称作hcdr1、hcdr2和hcdr3，而位于抗体轻链可变结构域内的cdr被称作lcdr1、lcdr2和lcdr3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各cdr的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体cdr指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和cdr环的拓扑学的chothia(chothia等人.(1989)nature 342：877-883，al-lazikani等人，“standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”，journal of molecular biology，273，927-948(1997))，基于抗体序列可变性的kabat(kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第4版，u.s.department of health and human services，national institutes of health(1987))，abm(university of bath)，contact(university college london)，国际immunogenetics database(imgt)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的north cdr定义。
87.在本公开所描述的技术方案中，除非特别说明，否则本公开中针对抗体所采用的抗体编号方案均为imgt编号方案。
88.在一些技术方案中，本公开涉及用于限定两个多核苷酸互补程度的杂交条件严格性。可选的，前述多核苷酸可以选自dna。本公开使用的“严格性”指杂交期间的温度和离子强度条件以及是否存在某些有机溶剂。严格性越高，靶核苷酸序列与经标记的多核苷酸序列之间的互补程度越高。“严格条件”指仅具有高频率互补碱基的核苷酸序列将杂交的温度和离子条件。本文使用的术语“在高严格性或非常高的严格性条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可见于current protocols in molecμlar biology，john wiley和sons，n.y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。本公开提及的具体杂交条件如下：1)高严格性杂交条件：在约45℃的6x氯化钠/柠檬酸钠(ssc)中，然后于65℃下用0.2x ssc、0.1％sds洗涤一次或更多次；2)非常高严格性杂交条件：65℃的0.5m磷酸钠，7％sds，然后于65℃下用0.2x ssc、1％sds洗涤一次或更多次。
89.技术方案
90.在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：
91.seq id no：1所示序列为mda5抗原的氨基酸序列；
92.seq id no：2所示序列为编码mda5抗原的核苷酸序列；
93.seq id no：3所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体lcdr1的氨基酸序列；
94.seq id no：4所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体lcdr2的氨基酸序列；
95.seq id no：5所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体lcdr3的氨基酸序列；
96.seq id no：6所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体hcdr1的氨基酸序列；
97.seq id no：7所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体hcdr2的氨基酸序列；
98.seq id no：8所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体hcdr3的氨基酸序列；
99.seq id no：9所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体vl fr1的氨基酸序列；
100.seq id no：10所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体vl fr2的氨基酸序列；
101.seq id no：11所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体vl fr3的氨基酸序列；
102.seq id no：12所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体vl fr4的氨基酸序列；
103.seq id no：13所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体vh fr1的氨基酸序列；
104.seq id no：14所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体vh fr2的氨基酸序列；
105.seq id no：15所示序列为编码76f-mda5-r2p1-g5抗体vh fr3的核苷酸序列；
106.seq id no：16所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体vh fr4的氨基酸序列；
107.seq id no：17所示序列为编码76f-mda5-r2p1-g5抗体重链的核苷酸序列；
108.seq id no：18所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体重链的氨基酸序列；
109.seq id no：19所示序列为编码76f-mda5-r2p1-g5抗体轻链的核苷酸序列；
110.seq id no：20所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体轻链的氨基酸序列；
111.seq id no：21所示序列为编码76f-mda5-r2p1-g5抗体vh的核苷酸序列；
112.seq id no：22所示序列为76f-mda5-r2p1-g5抗体vl的氨基酸序列；
113.seq id no：23～40所示序列为引物序列。
114.抗mda5抗体或其抗原结合片段
115.抗mda5抗体存在于dm患者和cadm患者血清中，且抗mda5抗体阳性患者伴发急进型ild的发生率显著高于抗体阴性者。mda5抗体阳性皮肌炎是一种罕发但致死率极高的自身
免疫病，该亚型以mda5抗体为血清学标志。由于肺部病症发展速度很快，患者六个月生存率只有50％左右，往往死于ild导致的呼吸衰竭。目前医学界对mda5抗体阳性皮肌炎的发病机制尚不清楚，而采用激素联合传统免疫抑制剂的主流治疗方案往往疗效并不理想，无法明显改善mda5抗体阳性皮肌炎合并快速进展型间质性肺炎患者的生存率。经典的杂交瘤技术是一项周期长、连续性强的实验技术系统。它的问题在于长时间的制备过程和不完全的抗原表位的识别，需要进行后续的人源化改造，导致难以获得高亲和力的人源单克隆抗体，无法对抗体水平做到绝对定量。因此这些治疗方式缺乏特异性，疗效差且疗程长。
116.噬菌体抗体库技术可对人和其他动物的b细胞抗体库进行体外建库筛选，避开了免疫和细胞融合等步骤从而缩短实验周期并增加了稳定性，实现短期内筛选到较高亲和力的全人源抗体序列。本公开中分离mda5抗体阳性患者的pbmcs构建噬菌体人源抗体库，筛选出一种人源性抗mda5抗原单克隆抗体。该抗体通过与mda5特异性结合，能够定量检测dm患者中抗mda5自身抗体水平，从而监测病情活动度，用于dm患者的临床诊断。我们的研究为特异性治疗dm提供了理论与实验依据，同时也为治疗以自身抗体为主要致病机制的自身免疫病提供了一个新的研究方向。
117.在一些实施方式中，本公开制备了mda5蛋白。在一些具体的实施方式中，制备mda5蛋白的步骤包括：
118.(1)将人工合成的mda5结构域的基因重组到表达载体质粒pfastbac1中，得到mda5-pfastbac1表达载体；
119.(2)将mda5-pfastbac1表达载体转染到dh10bac感受态中培养，纯化得到mda5抗原蛋白。
120.在一些实施方式中，本公开利用提供了筛选抗mda5抗体的方法，其包括如下步骤：
121.(1)利用来源于抗mda5抗体阳性患者的pbmcs，构建噬菌体展示文库；
122.(2)利用mda5抗原蛋白对噬菌体展示文库进行筛选，得到特异性结合抗mda5抗原蛋白的抗mda5抗体或其抗原结合片段。
123.在一些更为具体的实施方式中，筛选抗mda5抗体的方法包括：
124.分离了mda5抗体阳性患者的pbmcs，提取rna并对rna进行质检。采用rt-pcr技术将质检合格的rna反转录成cdna，扩增其中全部的抗体vh、vl基因片段，组成vk文库和vλ文库。使用质粒提取试剂盒提取vk文库和vλ文库的质粒载体，将体外扩增的vh基因片段插入vk文库和vλ文库的质粒载体，构成kh文库和λh文库。
125.将抗体基因组合文库插入噬菌体编码的膜蛋白的基因iii(g3)的先导系列的紧邻下游，通过辅助噬菌体的超感染，使外源抗体基因表达的多肽或蛋白可以以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白piii的n端。每个噬菌体颗粒编码并呈递不同的抗体，其含有数十亿个单个克隆。在这些抗体文库中，编码可与抗原结合的那些抗体的基因通过在体外对抗原进行亲和力富集-温和洗脱-噬菌体扩增，再继续重复以上富集筛选过程，直至数个循环后获得特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库，从抗体噬菌体库中筛选阳性克隆。通过elisa方法对阳性克隆进行鉴定，最后从中筛选特异性好、亲和力强的全人源抗体。将淘筛获得的人源单克隆抗体与人非小细胞肺癌细胞系a549、小鼠腹腔巨噬细胞系raw进行蛋白质印迹，分别以gapdh、actin作为内参，验证抗体效果。
126.本公开经过三轮抗体噬菌体库的筛选，将抗原组大于3倍对照组的克隆定为阳性
克隆，对这些单克隆进行测序分析。排除掉错误抗体序列和重复抗体序列，并结合elisa实验所反映的抗原抗体特异性结合能力，最终得到了1条高亲和力的抗体，命名为76f-mda5-r2p1-g5。经过elisa和蛋白印迹验证，该抗体活性高、稳定性好，且具有较强的特异性，能作为定性检测mda5阳性的参考标准，也能定量检测im、im-ild(例如，dm，cadm，dm-ild，cadm-ild等)无肌病性皮肌炎患者中抗mda5自身抗体水平。
127.实施例
128.本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
129.实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获得。
130.实施例一：人源scfv噬菌体展示文库的构建方法
131.表1本实施例中使用的主要试剂
[0132][0133]
1、文库构建
[0134]
1.1组装重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)
[0135]
表2 pcr反应条件和步骤
[0136]
[0137][0138]
其中，变性，退火，延伸(1)这三个步骤，重复30次
[0139]
引物序列：
[0140]
forward(f):
[0141]5′
l-vh 1：acaggtgcccactcccaggtgcag(seq id no:23)
[0142]5′
l-vh 3：aaggtgtccagtgtgargtgcag(seq id no:24)
[0143]5′
l-vh 4/6：cccagatgggtcctgtcccaggtgcag(seq id no:25)
[0144]5′
l-vh 5/7：caaggagtctgttccgaggtgcag(seq id no:26)
[0145]5′
l vk 1/2：atgaggstcccygctcagctgctgg(seq id no:27)
[0146]5′
l vk 3：ctcttcctcctgctactctggctcccag(seq id no:28)
[0147]5′
l vk 4/5：atttctctgttgctctggatctctg(seq id no:29)
[0148]5′
l vλ1：ggtcctgggcccagtctgtgctg(seq id no:30)
[0149]5′
l vλ2：ggtcctgggcccagtctgccctg(seq id no:31)
[0150]5′
l vλ3：gctctgtgacctcctatgagctg(seq id no:32)
[0151]5′
l vλ4/5：ggtctctctcscagcytgtgctg(seq id no:33)
[0152]5′
l vλ6：gttcttgggccaattttatgctg(seq id no:34)
[0153]5′
l vλ7：ggtccaattcycaggctgtggtg(seq id no:35)
[0154]5′
l vλ8/9/10：gagtggattctcagactgtggtg(seq id no:36)
[0155]
reverse(r):
[0156]3′
ck：tgctgtccttgctgtcctgct(seq id no:37)
[0157]3′
cλ：caccagtgtggccttgttggcttg(seq id no:38)1.2构建轻链可变区噬菌体展示文库
[0158]
1.2.1准备pata-scfv-2载体为文库克隆
[0159]
1.2.2消化载体和pcr产物
[0160]
表3消化载体和pcr产物的反应体系
[0161][0162]
1.2.3连接
[0163]
表4连接反应体系
[0164][0165]
16℃孵育过夜，65℃加热灭活10min。
[0166]
1.2.4电转
[0167]
1.2.4.1 tg1感受态细胞的制备。
[0168]
1.2.4.2 37℃预温1ml soc培养基(sigma，s1797)。将电穿孔比色皿(0.1厘米的间隙)和微离心管放在冰上(每个转换反应一个比色皿和一个微离心管)。
[0169]
1.2.4.3从-80℃的冰箱中取出electrocompetent细胞，放在冰上直到它们完全融化(10-15分钟)。细胞解冻后，轻轻混匀。将50μl细胞放入在冰上的冷冻微离心管中，。
[0170]
1.2.4.4小心地将3μl的dna混合物加入到冷冻的电穿孔比色皿中，不要产生气泡。用你的手腕快速向下轻弹试管，使细胞沉积在底部。
[0171]
1.2.4.5在600ω，10μf和1.8kv下电穿孔。在脉冲的10秒内，立即在每个试管中加入1ml预热的soc培养基。37℃，250rpm摇晃1小时。
[0172]
1.2.4.6收集所有的电转化培养基。连续稀释10μl培养物到90μl soc培养基中，涂布于lb/amp/glucose上。37℃孵育过夜。通过计数菌落数量，乘以培养体积，除以平板接种体积，计算转化子总数。
[0173]
1.3构建vl-vh噬菌体展示文库
[0174]
1.3.1消化载体和pcr产物
[0175]
表5消化反应体系
[0176][0177]
1.3.2连接
[0178]
表6连接反应体系
[0179][0180]
16℃孵育过夜，65℃加热灭活10min。
[0181]
1.3.3电转
[0182]
1.3.3.1 tg1感受态细胞的制备。
[0183]
1.3.3.2 37℃预温4ml soc培养基(sigma，s1797)。将电穿孔比色皿(0.2厘米的间隙)和微离心管放在冰上(每个转换反应一个比色皿和一个微离心管)。
[0184]
1.3.3.3从-80℃的冰箱中取出electrocompetent细胞，放在冰上直到它们完全融化(10-15分钟)。细胞解冻后，轻轻混匀。
[0185]
1.3.3.4小心地将6μl的dna混合物加入到冷冻的电穿孔比色皿中，不要产生气泡。用你的手腕快速向下轻弹试管，使细胞沉积在底部。
[0186]
1.3.3.5在600ω，10μf和2.5kv下电穿孔。在脉冲的10秒内，立即在每个试管中加入2ml预热的soc培养基。37℃，250rpm摇晃1小时。
[0187]
1.3.3.6收集所有的电转化培养基。连续稀释10μl培养物到90μl soc培养基中，涂布于lb/amp/glucose上。37℃孵育过夜。通过计数菌落数量，乘以培养体积，除以平板接种体积，计算转化子总数。
[0188]
1.4文库评估
[0189]
1.4.1菌落pcr：以构建好的文库为模板，进行pcr。
[0190]
表7pcr反应条件
[0191][0192]
其中，变性，退火，延伸(1)这三个步骤，重复30次。
[0193]
引物序列：
[0194]
forward(f):agcggataacaatttcacacagga(seq id no:39)
[0195]
forward(r)：gcccccttattagcgtttgccatc(seq id no:40)
[0196]
pcr后琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1-图3所示。
[0197]
1.4.2测序：挑选阳性克隆送到武汉擎科生物科技有限公司测序，测序质控结果如图4所示。
[0198]
1.5表达mda5蛋白
[0199]
人工合成mda5基因序列，将mda5基因重组到表达载体质粒pfastbac1中，得到mda5-pfastbac1表达载体；克隆位点ecori/xbai。
[0200]
mda5的氨基酸序列(seq id no:1)为：
[0201]
mgshhhhhhhhhhsgmsngystdenfryliscfrarvkmyiqvepvldyltflpaevkeqiqrtvatsgnmqavelllstlekgvwhlgwtrefvealrrtgsplaarymnpeltdlpspsfenahdeylqllnllqptlvdkllvrdvldkcmeeelltiedrnriaaaenngnesgvrellkrivqkenwfsaflnvlrqtgnnelvqeltgsdcsesnaeienlsqvdgpqveeqllsttvqpnlekevwgmennssessfadssvvsesdtslaegsvscldeslghnsnmgsdsgtmgsdsdeenvaaraspepelqlrpyqmevaqpalegkniiiclptgsgktrvavyiakdhldkkkkasepgkvivlvnkvllveqlfrkefqpflkkwyrviglsgdtqlkisfpevvkscdiiistaqilensllnlengedagvqlsdfsliiidechhtnkeavynnimrhylmqklknnrlkkenkpviplpqilgltaspgvggatkqakaeehilklcanldaftiktvkenldqlknqiqepckkfaiadatredpfkeklleimtriqtycqmspmsdfgtqpyeqwaiqmekkaakegnrkervcaehlrkynealqindtirmidaythletfyneekdkkfavieddsdeggddeycdgdededdlkkplkldetdrflmtlffennkmlkrlaenpeyenekltklrntimeqytrteesargiiftktrqsayalsqwitenekfaevgvkahhligaghssefkpmtqneqkeviskfrtgkinlliattvaeegldikecniviryglvtneiamvqargraradestyvlvahsgsgviehetvndfrekmmykaihcvqnmkpeeyahkilelqmqsimekkmktkrniakhyknnpslitflckncsvlacsgedihviekmhhvnmtpefkelyivrenkalqkkcadyqingeiickcgqawgtmmvhkgldlpclkirnfvvvfknnstkkqykkwvelpitfpnldysecclfsded；
[0202]
基因序列如seq id no:2所示。
[0203]
将mda5-pfastbac1表达载体转染到dh10bac感受态中培养，收集沉淀进行gst标签亲和层析得到mda5蛋白；纯化后的mda5还需要进行sds-page电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)以验证其纯度，纯化后的mda5 sds-page电泳图如图5所示，纯度大于95％。
[0204]
实施例二：与mda5特异性结合的单克隆抗体的制备
[0205]
表8本实施例中使用的主要试剂
[0206]
试剂编号制造商96-well plate42592costartween 20p2287sigmatrisres3098t-b7sigmaglycineg8200solarbiopeg181986sigmapbsc10010500btlifebsaa104912-100galaddinskim milk6342932bd
[0207]
1、第一轮
[0208]
1.1生物淘选
[0209]
1.1.1包被：包被免疫管，4℃孵育过夜。抗原组：1ml mda5转染液(50μg/ml)，对照组：500μl转染液(0μg/ml)。
[0210]
1.1.2洗涤：弃掉免疫管中液体，用5ml 0.05％pbst洗涤三遍。
[0211]
1.1.3封闭：在管中加入5ml 5％脱脂牛奶(pbst溶解)，37℃孵育2小时。
[0212]
1.1.4洗涤：弃掉免疫管中液体，用5ml 0.05％pbst洗涤一遍。
[0213]
1.1.5孵育：用1％脱脂牛奶(pbst溶解)稀释噬菌体文库，取1ml加入免疫管中，32℃孵育2小时。
[0214]
1.1.6洗涤：弃掉免疫管中液体，用5ml 0.05％pbst洗涤三遍，用pbs洗涤两遍。
[0215]
1.1.7洗脱：用1ml的甘氨酸-盐酸(ph 2.2)洗脱与mda5结合的噬菌体，再用tris-hcl中和至ph 7.0。
[0216]
1.2测定稀释噬菌体的滴度
[0217]
1.2.1培养大肠杆菌tg1直到od600＝0.4-0.6。
[0218]
1.2.2混合10μl稀释的洗脱后噬菌体和190μl大肠杆菌tg1。
[0219]
1.2.3 37℃培养混合物15分钟，然后倒到2
×
yt-a(amp 100μg/ml)培养基中。将培养基倒扣培养在37℃处过夜。
[0220]
1.3噬菌体文库扩增
[0221]
1.3.1将10μl e.coli tg1加到800μl of 2yt培养液中，在37℃混合培养至od600＝0.4-0.6。
[0222]
1.3.2将培养至对数期的tg1转入10ml 2yt-g培养液(终浓度2％葡萄糖)，在摇床上37℃培养至od600＝0.4-0.6。
[0223]
1.3.3加入洗脱后的产物，37℃孵育30分钟，37℃摇床培养30分钟。
[0224]
1.3.4加入30ml 2yt-ag培养液(终浓度0.1％amp，2％葡萄糖)，37℃摇床培养1小时。
[0225]
1.3.5加入m13ko7(m13ko7:tg1＝20:1)，37℃孵育30分钟，37℃摇床培养30分钟。
[0226]
1.3.6菌液在5000rpm离心5分钟。用40ml 2yt-ak(终浓度amp 100μg/ml，kan100μg/ml)重悬，30℃摇床孵育过夜。
[0227]
1.3.7 8000rpm离心10分钟，取出上清，用1ml pbs重悬，12000rpm离心5分钟，将上
0.6。
[0249]
4.2m13ko7感染培养物(moi＝20:1)，37℃孵育30分钟，37℃摇床培养30分钟。将菌液离心，并用等体积2
×
yt-ak(终浓度amp 100μg/ml，kan 100μg/ml)重悬沉淀，30℃培养过夜。
[0250]
4.3将培养物离心，上清液可用于elisa。
[0251]
4.4包被：包被酶标板，4℃孵育过夜。抗原组：100μl/每孔mda5蛋白(4μg/ml)，对照组：100μl/每孔蛋白稀释液(0μg/ml)。
[0252]
4.5洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl的0.05％pbst洗涤三遍。
[0253]
4.6封闭：每孔加入300μl的5％脱脂牛奶(pbs溶解)，37℃封闭2小时。
[0254]
4.7噬菌体孵育：每孔中加入100μl噬菌体上清，32℃孵育2小时。
[0255]
4.8洗涤：同步骤4.5。
[0256]
4.9二抗孵育：每孔加入100μl用封闭液稀释的anti-m13-hrp antibody(1:9000)，32℃孵育1小时。
[0257]
4.10洗涤：同步骤4.5。
[0258]
4.11显色：每孔加100μl tmb，室温孵育，然后每孔加50μl 2m hcl终止反应。
[0259]
4.12读板：使用酶标仪在450nm-630nm读取数值，并对高特异性克隆进行测序。
[0260]
表11抗原组单克隆噬菌体elisa的结果
[0261][0262][0263]
表12对照组单克隆噬菌体elisa的结果
[0264] 123456789101112a0.040.020.030.030.030.030.030.030.030.030.050.16b0.020.020.020.030.020.020.110.030.020.020.050.07c0.030.020.230.030.020.040.040.030.030.020.030.12d0.030.020.030.030.030.030.040.030.020.030.030.12e0.030.020.030.020.030.030.020.330.020.030.030.10f0.040.020.020.020.030.020.020.030.020.020.030.04g0.060.020.020.050.080.020.060.160.030.030.130.04h0.110.050.030.060.100.230.040.110.040.040.040.12
[0265]
5、阳性克隆验证elisa
[0266]
5.1将50μl阳性克隆加入2ml 2yt-ag培养基(终浓度0.1％amp，2％葡萄糖)中培养至od600＝0.4-0.6。
[0267]
5.2m13ko7感染培养物(moi＝20:1)，37℃孵育30分钟，37℃摇床培养30分钟。将菌液离心，并用等体积2
×
yt-ak(终浓度amp 100μg/ml，kan 100μg/ml)重悬沉淀，30℃培养过夜。
[0268]
5.3将培养物离心，上清液可用于elisa。
[0269]
5.4包被：包被酶标板，4℃孵育过夜。抗原组：100μl/每孔mda5蛋白(4μg/ml)，对照组：100μl/每孔蛋白稀释液(0μg/ml)。
[0270]
5.5洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl的0.05％pbst洗涤三遍。
[0271]
5.6封闭：每孔加入300μl的5％脱脂牛奶(pbs溶解)，37℃封闭2小时。
[0272]
5.7噬菌体孵育：每孔中加入100μl噬菌体上清，32℃孵育2小时。
[0273]
5.8洗涤：同步骤4.5。
[0274]
5.9二抗孵育：每孔加入100μl用封闭液稀释的anti-m13-hrp antibody(1:9000)，32℃孵育1小时。
[0275]
5.10洗涤：同步骤4.5。
[0276]
5.11显色：每孔加100μl tmb，室温孵育，然后每孔加50μl 2m hcl终止反应。
[0277]
5.12读板：使用酶标仪在450nm-630nm读取数值，并对高特异性克隆进行测序。
[0278]
表13阳性单克隆噬菌体elisa的结果
[0279][0280]
将该阳性克隆送去测序，得到的高特异性抗体的序列如下：
[0281]
表14 76f-mda5-r2p1-g5抗体序列
[0282][0283][0284]
抗体序列的测序
[0285]
筛选得到的噬菌体阳性克隆，进行全序列测序，得到相应的抗体重链轻链，以及全序列如下：
[0286]
76f-mda5-r2p1-g5抗体的重链碱基序列(seq id no:17)为：
[0287]
gaattcgccgccaccatgaagcacctgtggttctttctgctgctggtggccgctcctagatgggtgct
gagccaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctagagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagacatcggcggtatgcttttgatatctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagtgctagcaccaagggaccttctgtgttccctctggctccttcttctaagtccacttccggtggtacagcagctctgggttgtctggtgaaggattacttcccagaaccagtgactgtgtcctggaactccggagctctgacttctggagtgcatactttcccagcagtgctgcaatctagcggactgtactctctgtcttccgtggtgactgtgccttcttcttccctggggactcaaacttacatctgcaacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggagccaaagagctgcgataagacccacacctgtccaccttgtccagctccagaactgctgggtgggccttctgtgtttctgttcccacctaagccaaaggataccctgatgatctctaggaccccagaagtgacctgtgtggtcgtcgatgtgtctcatgaagaccctgaagtgaagttcaactggtacgtggacggggtggaagtgcataacgcaaagaccaagcccagggaagagcaatacaactccacctacagggtggtctccgtcctgacagtcctgcatcaggattggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaataaagccctgcctgcccctatcgagaaaaccattagcaaagccaaaggccagcccagggagccccaggtctatacactgccccccagcagggaggagatgacaaaaaatcaggtcagcctgacatgcctggtcaaaggcttttatcccagcgacattgccgtcgagtgggagtccaatggccagcccgagaataattataaaacaacaccccccgtcctggacagcgacggcagcttttttctgtatagcaaactgacagtcgataaaagcaggtggcagcagggcaatgtcttttcctgcagcgtcatgcacgaggccctgcacaatcactatactcagaaaagcctgagcctgtcccccgggaaatgagcggccgc；
[0288]
76f-mda5-r2p1-g5抗体的重链氨基酸序列(seq id no:18)为：
[0289]
mkhlwfflllvaaprwvlsqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssyamhwvrqapgkglewvavisydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarhrryafdiwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
[0290]
76f-mda5-r2p1-g5抗体的轻链碱基序列(seq id no:19)为：
[0291]
gaattcgccgccaccatggtgctgcagacccaggtgttcatctctctgctgctgtggatctccggcgcctacggccaggctgtgctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgatgttggtggttataactatgtctcctggtaccaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgatgtcagtaagcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgacaatctctgggctccaggctgaggatgaggctgattattattgtagctcatatgtagtcagctacacttgggtattcggcggaggcaccaaggtgaccgtcctccgtacggtggctgcaccttctgtgttcatcttccctccatctgatgagcagctgaagtctggaaccgcatctgtcgtctgtctgctgaacaacttttaccccagggaggctaaggtccaatggaaggtggacaacgccctgcagtctggtaatagccaggaaagcgtgaccgaacaggattccaaggactccacctactccctgtcctccacactgacactgagcaaagccgactatgaaaagcacaaagtgtatgcctgcgaggtcactcatcagggcctgtccagccccgtgactaaaagctttaataggggggagtgctgagcggccgc；
[0292]
76f-mda5-r2p1-g5抗体的轻链氨基酸序列(seq id no:20)为：
[0293]
mvlqtqvfislllwisgaygqavltqpasvsgspgqsitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapkl
miydvskrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssyvvsytwvfgggtkvtvlrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
[0294]
实施例三：elisa检测抗体不同稀释浓度条件下的od值
[0295]
酶联免疫吸附反应elisa实验步骤：
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1.包被：100μl/每孔mda5蛋白(4μg/ml)包被酶标板，4℃孵育过夜。
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2.洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl的0.05％pbst洗涤三遍。
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3.封闭：每孔加入300μl的5％脱脂牛奶(pbs溶解)，37℃封闭2小时。
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4.阳性抗体孵育：将76f-mda5-r2p1-h2抗体进行梯度稀释，每孔中加入100μl稀释后的抗体溶液，37℃孵育1小时。
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5.洗涤：同步骤4.5。
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6.二抗孵育：用封闭液10000倍稀释goat anti-human igg(h+l)antibody(jackson，code：109-035-088)，每孔加入100μl稀释的二抗，37℃孵育30分钟。
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7.洗涤：同步骤4.5。
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8.显色：每孔加100μl tmb，37℃孵育10分钟，然后每孔加50μl 2m hcl终止反应。
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9.读板：使用酶标仪在450nm-630nm读取数值，如图6所示，结果显示76f-mda5-r2p1-g5与mda5具有较强的特异性结合的能力。
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实施例四：蛋白印迹验证76f-mda5-r2p1-g5抗体
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蛋白印迹实验步骤：
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1.细胞收集：将细胞培养至对数生长期，收集细胞沉淀，加入适量裂解液裂解细胞(磷酸酶及蛋白酶抑制剂：ripa裂解液＝1：100)，冰上孵育30分钟。
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2.蛋白提取：将裂好的细胞4℃、12000rpm离心15分钟，保留上清液。向上清液中加入裂解液1/3体积的4
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protein sds loading buffer，100℃煮10分钟后将样品放4℃保存。
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3.下层胶制备：4ml7.5％下层胶溶液、4ml7.5％下层胶缓冲液及80μl促凝剂混合后浇筑胶板，1-2ml无水乙醇压胶，等待凝固，回收无水乙醇。
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4.上层胶制备：1ml上层胶溶液、1ml上层胶缓冲液及20μl促凝剂继续浇筑胶板，等待30分钟后胶板凝固。
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5.电泳：每孔加入30μl蛋白，上样后电压调至80v开始电泳，待marker齐后将电压调至120v，待marker跑至胶板末端时停止电泳。
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6.转膜：海绵上放置3层滤纸，将胶小心放置其上，再将与胶大小一致的膜放置上方，排空气泡。叠加2层滤纸及一层海绵，将叠好的三明治夹紧后放入电泳槽中，加转膜液，电泳槽放至一泡沫箱内，槽四周加冰环绕。湿转300a，120min。
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7.封闭：5％脱脂牛奶(tpbs溶解)封闭1小时。
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8.一抗孵育：用抗体稀释液1:100稀释76f-mda5-r2p1-g5抗体，4℃孵育过夜。
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9.洗膜：1xtbst洗涤三遍，每次10分钟。
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10.二抗孵育：用抗体稀释液20000倍稀释goat anti-human igg(h+l)antibody(jackson，code：109-035-088)，37℃孵育1小时。
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11.洗膜：同步骤9。
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12.发光检测成像。如图7所示。结果显示76f-mda5-r2p1-g5在a549和raw细胞内均有表达。
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本公开并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，提供所述实施方案例如来说明本公开的各方面。从本文的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得明显。可以在不脱离本公开的真正范围和精神的情况下实践这类变化，并且这类变化旨在落入本公开的范围内。