1.本发明涉及抗-肿瘤抗原奈米抗体
技术领域：
：，具体涉及一种抗-肿瘤抗原奈米抗体暨其核酸编码序列及其应用。
背景技术：
：：2.癌症又名为恶性肿瘤，为细胞不正常增生，且这些增生的细胞可能侵犯身体的其他部分，为由控制细胞分裂增殖机制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不断增加的趋势，癌症是国人十大死因之一，且已连续多年居十大死因的榜首。3.常规的肿瘤治疗方法包括手术治疗、放射线治疗、化学治疗及标靶治疗等。肿瘤免疫治疗为上述治疗方法以外的另一种治疗肿瘤的方法，是通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫及体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散及复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。然而，目前的肿瘤治疗方法仍存在效果不彰及副作用强烈的问题，甚至会衍生出其他免疫相关疾病。4.人类白血球抗原-g(humanleukocyteantigen-g,hla-g)已被发现高度表现于多种实体肿瘤上，且有抑制免疫细胞的特性。因此，已有研究人员致力于研发以hla-g作为辨识肿瘤的标靶分子并找出这些标靶分子是否具有成为抗癌药物的潜力。5.为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出新颖且更有效治疗癌症及免疫相关疾病的医药品以造福有此需求的广大族群。技术实现要素：6.有鉴于此，本发明的目的为提供一种抗-肿瘤抗原奈米抗体，其与一人类白血球抗原-g(humanleukocyteantigen-g,hla-g)专一性结合，该抗-肿瘤抗原奈米抗体包含一选自于下列所组成的群组中的胺基酸序列：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3，及seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3的任意组合。7.在本发明的一实施例中，该胺基酸序列是该抗-肿瘤抗原奈米抗体的一重链可变域(heavychainvariabledomain,vhh)的胺基酸序列。8.在本发明的一实施例中，该抗-肿瘤抗原奈米抗体与一可结晶片段区域(fragmentcrystallizableregion,fcregion)缀合。9.在本发明的一实施例中，该抗-肿瘤抗原奈米抗体与一第二抗体缀合以形成双特异性t细胞连接(bispecifict-cellengager,bite)、三特异性t-细胞连接(triplespecifict-cellengager,trite)、双特异性杀手细胞连接(bispecifickillercellenager,bike)、三特异性杀手细胞连接(triplespecifickillercellengager,trike)，或任一双特异性抗体。10.在本发明的一实施例中，该抗-肿瘤抗原奈米抗体阻断该hla-g与该hla-g的一受体的交互作用及/或结合。11.在本发明的一实施例中，该受体是杀手细胞免疫球蛋白样受体两个ig域及长胞质尾4(killercellimmunoglobulinlikereceptor,twoigdomainsandlongcytoplasmictail4,kir2dl4)或白血球免疫球蛋白样受体子族b成员1(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorsubfamilybmember1,lilrb1)。12.本发明的另一目的为提供一种经分离的核酸，其编码一如前所述的抗-肿瘤抗原奈米抗体的胺基酸序列，该经分离的核酸包含一选自于下列所组成的群组中的核苷酸序列：seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6，及seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6的任意组合。13.本发明的另一目的为提供一种医药组成物，包含一如前所述的抗-肿瘤抗原奈米抗体及一医药学上可接受的载剂。14.本发明的另一目的为提供一种如前所述的抗-肿瘤抗原奈米抗体用于制备一治疗癌症及免疫相关疾病的医药品的用途。15.本发明的另一目的为提供一种用于检测hla-g表现量的方法，包含对一待测样品投予一如前所述的抗-肿瘤抗原奈米抗体。16.在本发明的一实施例中，该待测样品是血液、尿液、痰液、唾液或体液。17.综上所述，本发明抗-肿瘤抗原奈米抗体的功效在于：藉由竞争型酵素结合免疫吸附分析法(competitiveenzymelinkedimmunosorbentassay,competitiveelisa)证明抗-hla-g奈米抗体在ic50的50％阻断活性内阻断hla-g与其受体:杀手细胞免疫球蛋白样受体两个ig域及长胞质尾4(killercellimmunoglobulinlikereceptor,twoigdomainsandlongcytoplasmictail4,kir2dl4)及白血球免疫球蛋白样受体子族b成员1(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorsubfamilybmember1,lilrb1)之间的交互作用、增强自然杀手细胞(naturalkillercell,nkcell)对人类乳癌细胞株mda-mb-231的细胞溶解(cytolysis)作用及细胞毒性、藉由西方墨点分析(westernblotting)证明抗-hla-g奈米抗体可以识别人类癌细胞株mda-mb-231及a549细胞的细胞溶解产物中的hla-g蛋白质、流动式细胞测量分析(flowcytometricanalysis)、藉由免疫细胞化学分析证明抗-hla-g奈米抗体可以识别细胞膜上的hla-g蛋白质、hla-g的表现与质膜标志pan-钙黏素(pan-cadherin)共定位于mda-mb-231及a549细胞上，及藉由免疫组织化学染色(immunohistochemistrystaining,ihcstaining)证明抗-hla-g抗体可用以侦测hla-g的表现，藉此达到治疗癌症及免疫相关疾病的效用。特别地，相较于习知的抗体必须藉由载体将基因转染至细胞中表现抗体功能而有低产量及效果不彰的缺点，本发明抗-肿瘤抗原奈米抗体可在体外大规模制备后直接投药至需要的个体内进行治疗。另外，本发明也可达到检测hla-g表现量的效用。18.以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。19.【图式简单说明】20.图1a至图1h显示藉由竞争型酵素结合免疫吸附分析法(competitiveenzymelinkedimmunosorbentassay,competitiveelisa)测定抗-hla-g奈米抗体的hla-g/杀手细胞免疫球蛋白样受体两个ig域及长胞质尾4(killercellimmunoglobulinlikereceptor,twoigdomainsandlongcytoplasmictail4,kir2dl4)或白血球免疫球蛋白样受体子族b成员1(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorsubfamilybmember1,lilrb1)轴阻断，其中lilrb1表示白血球免疫球蛋白样受体子族b成员1(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorsubfamilybmember1)；kir2dl4表示杀手细胞免疫球蛋白样受体两个ig域及长胞质尾4(killercellimmunoglobulinlikereceptor,twoigdomainsandlongcytoplasmictail4)；nb表示奈米抗体(nanobody)；87g表示商用抗-hla-g单株抗体。21.图2是一数据图，显示抗-hla-g奈米抗体增强自然杀手细胞(naturalkillercell,nkcell)对人类乳癌细胞株mda-mb-231的细胞溶解(cytolysis)作用，其中hla-gmab(87g)表示商用抗-hla-g单株抗体(87g)。22.图3a显示抗-hla-g奈米抗体的西方墨点分析结果，使用细胞株为人类乳癌细胞株mda-mb-231，商用抗体(commercialantibody)为hla-g(e8n9c)rabbitmab#79769，上排数字表示mda-mb-231细胞株的细胞溶解产物(celllysate)的量(μg)，初级抗体(primaryantibody)的浓度为1ng/ml，商用抗体组的二级抗体为抗-兔子-辣根过氧化酶(anti-rabbit-horseradishperoxidase,anti-rab-hrp)(1:1000)，抗-hla-g奈米抗体为重链可变域(heavychainvariabledomain,vhh)奈米抗体(1ng/ml)，实验组(#9、#20)的二级抗体为抗-vhh-hrp(1:1000)。23.图3b显示抗-hla-g奈米抗体的西方墨点分析结果，使用细胞株为人类非小细胞肺癌细胞株a549，商用抗体为hla-g(e8n9c)rabbitmab#79769，上排数字表示a549细胞株的细胞溶解产物的量(μg)，初级抗体的浓度为1ng/ml，商用抗体组的二级抗体为抗-兔子-辣根过氧化酶(1:1000)，抗-hla-g奈米抗体为重链可变域(vhh)奈米抗体(1ng/ml)，实验组(#9、#20)的二级抗体为抗-vhh-hrp(1:1000)。24.图4显示抗-hla-g奈米抗体的流动式细胞测量分析结果，其中人类乳癌细胞株mda-mb-231及人类非小细胞肺癌细胞株a549的量为1×106，商用抗体(commercialab)为pe(#12-9957-42)(它是一种抗-hla-g单株抗体，0.25μg配于100μlpbs溶液中)及87g，抗-hla-g奈米抗体为重链可变域(vhh)奈米抗体(0.25μg配于100μlpbs溶液中)，二级抗体为兔子抗-骆驼vhh,ifluor555(rabbitanti-camelidvhh,ifluor555)(0.5μg配于100μlpbs溶液中)，mfi表示平均萤光强度(meanfluorescenceintensity)，unstained表示未染色，clone表示选殖株。25.图5a及5b显示抗-hla-g奈米抗体的免疫细胞化学分析，其中图5a使用细胞株为人类乳癌细胞株mda-mb-231，图5b使用细胞株为人类非小细胞肺癌细胞株a549，商用抗体4h84是一种抗-hla-g单株抗体，抗-hla-g奈米抗体的浓度为1ng/ml，二级抗体为抗-vhh-萤光素(fluorescein,fitc)(1:5000)。26.图6显示抗-hla-g奈米抗体的免疫组织化学染色结果，其中所用样品为人类胎盘，商用抗体为4h84(它是一种抗-hla-g单株抗体)(#sc-21799)，浓度200μg/ml，作用浓度4μg/ml，商用抗体组的二级抗体为山羊抗-兔子hrp，dab表示二胺基联苯胺(diaminobenzidine)(是辣根过氧化酶最敏感、最常用的显色反应物)，抗-hla-g奈米抗体为重链可变域(vhh)奈米抗体(作用浓度4μg/ml)，实验组(#9)的抗体包括兔子抗-骆驼vhh抗体(rabbitanti-camelidvhhantibody)、生物素(biotin)(0.5μg配于100μlpbs溶液中)及山羊抗-兔子hrp。27.【实施方式】28.定义29.本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在±20％的范围内，较佳为在±10％的范围内，最佳为在±5％的范围内。30.如本文中所使用的，用语“抗-人类白血球抗原-g(humanleukocyteantigen-g,hla-g)奈米抗体(nanobody,nb)”与“抗-肿瘤抗原奈米抗体”可交换使用。31.如本文中所使用的，用语“第二抗体”意指可与奈米抗体缀合以形成双特异性t细胞连接(bispecifict-cellengager,bite)、三特异性t-细胞连接(triplespecifict-cellengager,trite)、双特异性杀手细胞连接(bispecifickillercellenager,bike)、三特异性杀手细胞连接(triplespecifickillercellengager,trike)，或任一双特异性抗体的抗体。较佳地，第二抗体可包括，但不限于：抗cd3ε、cd3、程序性细胞死亡配体1(programmedcelldeathligand1,pd-l1)、程序性细胞死亡配体2(programmedcelldeathligand2,pd-l2)、t细胞免疫球蛋白结构域及黏蛋白结构域3(t-cellimmunoglobulindomainandmucindomain3,tim3)、表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)、egfrviii、人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,her2)、b细胞成熟抗原(b-cellmaturationantigen,bcma)、cd19、cd20、cd34、cd16、fc、上皮细胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule,epcam)、间皮素(mesothelin)、纽约食道鳞状上皮细胞癌-1(newyorkesophagealsquamouscellcarcinoma-1,ny-eso-1)、糖蛋白100(glycoprotein100,gp100)及黏蛋白1(muc1)抗体。32.如本文中所使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指缓解(alleviating)、减少(reducing)、改善(ameliorating)、减轻(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障碍(disorder)的一或多个临床征兆(clinicalsign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆转(reversing)一正在被治疗中的病况(condition)或症状(symptom)的严重性(severity)的进展(progression)。33.依据本发明的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道地(parenterally)投药的剂型(dosageform)，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterileaqueoussolution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterilepowder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似之物。[0034]依据本发明的医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteralroutes)来投药：腹膜内注射(intraperitonealinjection)、皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)、肌肉内注射(intramuscularinjection)、静脉内注射(intravenousinjection)以及病灶内注射(intralesionalinjection)。[0035]依据本发明的医药品可包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药学上可接受的载剂。例如，该医药学上可接受的载剂可包含一或多种选自于由下列所构成的群组中的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。[0036]依据本发明的该医药学上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,pbs)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueoussolutioncontainingalcohol)，以及它们的组合。[0037]如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核酸片段”等术语意指呈单股或双股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且当中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturallyoccurringnucleotides)或人造化学仿效物。如本文中所用的，“核酸”此术语可与“基因”、“cdna”、“mrna”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交换使用。[0038]实施例1.抗-hla-g奈米抗体的制备[0039]在本实施例中，抗-人类白血球抗原-g(humanleukocyteantigen-g,hla-g)奈米抗体(nanobody,nb)的制备流程如下。关于重链可变域(heavychainvariabledomain,vhh)的生产流程如下。vhh基因建构于表现载体pet22b(amp抗性)或psb-init(cmr抗性)中；质体经限制性内切酶消化及定序验证鉴定。将1μl经鉴定的质体(约50ng)加入bl21(de3)中，37℃作用过夜。用单菌落接种含有抗性的lb培养基，并在37℃、220r/min下培育培养物过夜。隔夜培养物以1:100的比例接种于含抗性的新鲜lb培养基(10l-20l)中，并于37℃、220r/min培养。当od600达至0.8时，冷却至室温。加入最终浓度为0.1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside,iptg)，20℃、220r/min诱导过夜。藉由离心(20mmtrisph8.0、150mmnacl)在细胞破裂后获取细胞及上清液。上清液藉由流通(flow-through)与ni-nta珠粒(1ml)结合。用含有合适梯度咪唑(imidazole)(10mm、20mm、50mm、100mm、250mm及500mm)的缓冲液清洗并洗脱ni-nta珠粒。用sds-page分析洗脱部分，根据蛋白质的纯度及产量(离子交换层析或凝胶过滤层析)确定后续的纯化方案。符合要求的蛋白质藉由凝胶过滤层析分离纯化，缓冲液更换为pbs缓冲液。用sds-page分析蛋白质组分，将符合要求的组分合并浓缩，用0.22μm滤膜过滤、分装。之后，将蛋白质储存于-20℃或更低温度。[0040]关于奈米抗体是生产及纯化自大肠杆菌(e.coli)。为了生产奈米抗体形式的大肠杆菌，参考文献microbcellfact.2019mar11；18(1):47来进行。简言之，使用大肠杆菌菌株hb2151。编码胺苄青霉素(ampicillin)抗性的质体pet(creativebiolab)被用于细胞质蛋白生产。用pet-hla-g或hla-g多专一性奈米抗体质体新转化的大肠杆菌hb2151被接种在5ml含有50μg/ml胺苄青霉素的培养基中，并在37℃培养过夜。之后，将1ml这种预培养物接种到100ml培养基中并在37℃下生长。过夜培养后，每100ml培养物中加入两片enpresso加强片及额外剂量的葡萄糖释放酶(0.6u/l)。同时，藉由加入1mmiptg持续24小时诱导重组奈米抗体蛋白质表现。然后收集培养物并在冰上冷却5分钟，然后在6,000×g及4℃下离心15分钟。去除上清液后，细胞沉淀物藉由高容量myc-tag结合树脂使用固定化金属亲和层析(immobilizedmetalaffinitychromatography,imac)进行纯化。根据制造商操作流程(clontechlaboratories)在天然条件下进行基于重力流的层析(gravity-flow-basedchromatography)。藉由向每个200mg细菌细胞沉淀物添加1mlxtractor细胞裂解缓冲液(clontechlaboratories)，并辅以不含edta的蛋白酶抑制剂混合物(rochediagnostics)及25u核酸内切酶(thermoscientificpierce)，可实现有效的细胞裂解。在冰上作用15分钟、10,000×g及4℃离心20分钟以去除细胞碎片后，将澄清的上清液加到含有1ml预装树脂的重力流管柱上，并在室温下作用30分钟。在藉由添加含有300mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱奈米抗体之前，用20及40mm的咪唑浓度清洗管柱两次。使用截留分子量为3.5-5kda的纤维素酯膜(celluloseestermembrane)(laboratories)藉由对pbs进行透析来去除咪唑及更换缓冲液。[0041]关于抗-hla-g奈米抗体各选植株的互补决定区(complementaritydeterminingregion,cdr)的排列(alignment)及胺基酸序列显示于表1。抗-hla-g奈米抗体选殖株#9的胺基酸序列为seqidno.1；抗-hla-g奈米抗体选殖株#20的胺基酸序列为seqidno.2；抗-hla-g奈米抗体选殖株#33的胺基酸序列为seqidno.3；编码抗-hla-g奈米抗体选殖株#9的胺基酸序列的核苷酸序列为seqidno.4；编码抗-hla-g奈米抗体选殖株#20的胺基酸序列的核苷酸序列为seqidno.5；编码抗-hla-g奈米抗体选殖株#33的胺基酸序列的核苷酸序列为seqidno.6。[0042]表1[0043]选殖株cdr1cdr2cdr3#9grtyssnciytggdgiaadpnrrrmgvggsc#20gftvddsditsgggkvapawtgygct#33aytfsasgaatytrsaktavarcagrpdrstltsfaw[0044]实施例2.藉由竞争型酵素结合免疫吸附分析法(competitiveenzymelinkedimmunosorbentassay,competitiveelisa)测定抗-hla-g奈米抗体的hla-g/杀手细胞免疫球蛋白样受体两个ig域及长胞质尾4(killercellimmunoglobulinlikereceptor,twoigdomainsandlongcytoplasmictail4,kir2dl4)或白血球免疫球蛋白样受体子族b成员1(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorsubfamilybmember1,lilrb1)轴阻断(axisblockade)[0045]在本实施例中，藉由竞争型酵素结合免疫吸附分析法(competitiveenzymelinkedimmunosorbentassay,competitiveelisa)测定抗-hla-g奈米抗体的hla-g/杀手细胞免疫球蛋白样受体两个ig域及长胞质尾4(killercellimmunoglobulinlikereceptor,twoigdomainsandlongcytoplasmictail4,kir2dl4)轴阻断的操作流程如下。首先，将hla-g重组蛋白(cat#：tp305216,origene)(0.2μg/ml，每孔100μl)在96孔盘上于4℃涂覆过夜。隔天，移除涂覆缓冲液，在室温下用3％脱脂牛奶封阻2小时。接着，用pbst(0.05％tween溶于pbs中)清洗5次。添加不同浓度的抗-hla-g奈米抗体(选殖株#9、#20或#33)或商用抗-hla-g单株抗体(87g)于4℃过夜。清洗5次后，于室温加入生物素化的kir2dl4(biotinylatedkir2dl4)(sinobiological,cat:13052-h02s)(0.2mg/ml，每孔100μl)2小时。清洗9次后，每孔与100μl含有链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化酶缀合物(streptavidin-hrpconjugates)(thermofisher,catno:n100，稀释滴度：5000:1)的pbst在室温下作用2小时。以pbst清洗9次后，加入50μl的tmb受质(用于侦测hrp活性)(thermofisher,catno:n301)。之后，添加50μl的终止溶液(thermofisher,catno:n600)来终止反应，然后使用450nm波长的elisa读取仪进行测量。将商用抗-hla-g单株抗体(87g)的最高浓度设置为100％阻断kir2dl4/hla-g交互作用以计算其他反应。[0046]另外，藉由竞争型酵素结合免疫吸附分析法(competitiveelisa)测定抗-hla-g奈米抗体的hla-g/白血球免疫球蛋白样受体子族b成员1(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorsubfamilybmember1,lilrb1)轴阻断的操作流程大体上是相同于上述，不同之处在于：将生物素化的kir2dl4替换成生物素化的lilrb1(sinobiological,cat:16014-h08h)，及将商用抗-hla-g单株抗体(87g)的最高浓度设置为100％阻断lilrb1/hla-g交互作用以计算其他反应。[0047]本实施例的结果显示于图1a至图1h，其中lilrb1表示白血球免疫球蛋白样受体子族b成员1(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorsubfamilybmember1)；kir2dl4表示杀手细胞免疫球蛋白样受体两个ig域及长胞质尾4(killercellimmunoglobulinlikereceptor,twoigdomainsandlongcytoplasmictail4)；nb表示奈米抗体(nanobody)；87g表示商用抗-hla-g单株抗体。本实施例的结果证实，商用抗-hla-g单株抗体(87g)在41.4ng/ml(ic50)的50％阻断活性内阻断hla-g与其受体之一kir2dl4之间的交互作用。抗-hla-g奈米抗体选殖株#9在6.14ng/ml(ic50)的50％阻断活性内阻断hla-g与其受体之一kir2dl4之间的交互作用，阻断活性以87g正规化。抗-hla-g奈米抗体选殖株#20在814ng/ml(ic50)的50％阻断活性内阻断hla-g与其受体之一kir2dl4之间的交互作用，阻断活性以87g正规化。抗-hla-g奈米抗体选殖株#33在53.3ng/ml(ic50)的50％阻断活性内阻断hla-g与其受体之一kir2dl4之间的交互作用，阻断活性以87g正规化。商用抗-hla-g单株抗体(87g)在100.9ng/ml(ic50)的50％阻断活性内阻断hla-g与其另一受体之一lilrb1之间的交互作用。抗-hla-g奈米抗体选殖株#9在0.825ng/ml(ic50)的50％阻断活性内阻断hla-g与其另一受体之一lilrb1之间的交互作用，阻断活性以87g正规化。抗-hla-g奈米抗体选殖株#20在0.174ng/ml(ic50)的50％阻断活性内阻断hla-g与其另一受体之一lilrb1之间的交互作用，阻断活性以87g正规化。抗-hla-g奈米抗体选殖株#33在0.074ng/ml(ic50)的50％阻断活性内阻断hla-g与其另一受体之一lilrb1之间的交互作用，阻断活性以87g正规化。[0048]实施例3.抗-hla-g奈米抗体在增强自然杀手细胞(naturalkillercell,nkcell)对人类乳癌细胞株mda-mb-231的细胞溶解(cytolysis)作用的效用评估[0049]在本实施例中，抗-hla-g奈米抗体在增强自然杀手细胞(naturalkillercell,nkcell)对人类乳癌细胞株mda-mb-231(购自美国类型培养物收集中心(americantypeculturecollection,atcc))的细胞溶解(cytolysis)作用的效用评估之实验流程如下。将1×105的mda-mb-231细胞接种至12-孔盘上过夜。隔天，将5×105的初代自然杀手细胞添加至含有mda-mb-231细胞的孔中。接着，添加1μg/ml抗-hla-g奈米抗体(选殖株#9、#20或#33)或10μg/ml商用抗-hla-g单株抗体(87g)(87g,thermofisher,catno:14-9957-82)。48小时后，初代自然杀手细胞对mda-mb-231细胞的专一性溶解藉由使用流式细胞术分析的活死细胞介导的细胞毒性测定来确定。[0050]抗-hla-g奈米抗体增强自然杀手细胞对人类乳癌细胞株mda-mb-231的细胞溶解作用的结果显示于图2。本实施例的结果证实，抗-hla-g奈米抗体选殖株#9、#20及#33增强自然杀手细胞诱导的对肿瘤细胞(mda-mb-231)的细胞毒性。[0051]实施例4.抗-hla-g奈米抗体的西方墨点分析(westernblotting)结果[0052]在本实施例中，抗-hla-g奈米抗体的西方墨点分析(westernblotting)的操作流程如下。在含有蛋白酶抑制剂混合物的pro-prep蛋白质萃取溶液(intron，台北市，中国台湾省)中获取细胞，并在4℃下剧烈振荡15分钟，然后离心。收集上清液，然后使用bio-radbca试剂(bio-radhercules，ca，usa)测定蛋白质浓度。将30μg的每个样品裂解物在sds-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后电印迹到pvdf膜上。在tbst封阻中加入5％bsa后，将膜与初级抗体(溶于tbst中)在4℃下作用过夜。接着，清洗4次并以辣根过氧化酶(horseradishperoxidase,hrp)-缀合的山羊-抗小鼠或兔子igg(upstate,billerica,ma,usa)作用两小时。以tbst清洗4次后，印迹与supersignalwestpicoecl试剂(piercebiotechnology，rockford，il，usa)一起作用1分钟，然后藉由暴露于kodak-x-omat胶片来检测化学发光。[0053]抗-hla-g奈米抗体的西方墨点分析结果显示于图3a及图3b，其中图3a使用细胞株为人类乳癌细胞株mda-mb-231，商用抗体(commercialantibody)为hla-g(e8n9c)rabbitmab#79769，上排数字表示mda-mb-231细胞株的细胞溶解产物(celllysate)的量(μg)，初级抗体(primaryantibody)的浓度为1ng/ml，商用抗体组的二级抗体为抗-兔子-辣根过氧化酶(anti-rabbit-horseradishperoxidase,anti-rab-hrp)(1:1000)，抗-hla-g奈米抗体为重链可变域(heavychainvariabledomain,vhh)奈米抗体(1ng/ml)，实验组(#9、#20)的二级抗体为抗-vhh-hrp(1:1000)。[0054]图3b使用细胞株为人类非小细胞肺癌细胞株a549(购自美国类型培养物收集中心(americantypeculturecollection,atcc))，商用抗体为hla-g(e8n9c)rabbitmab#79769，上排数字表示a549细胞株的细胞溶解产物的量(μg)，初级抗体的浓度为1ng/ml，商用抗体组的二级抗体为抗-兔子-辣根过氧化酶(1:1000)，抗-hla-g奈米抗体为重链可变域(vhh)奈米抗体(1ng/ml)，实验组(#9、#20)的二级抗体为抗-vhh-hrp(1:1000)。本实施例的结果显示，藉由西方墨点分析，抗-hla-g奈米抗体选殖株#9及#20可以识别人类癌细胞株mda-mb-231及a549细胞的细胞溶解产物中的hla-g蛋白质。[0055]实施例5.抗-hla-g奈米抗体的流动式细胞测量分析(flowcytometricanalysis)结果[0056]在本实施例中，抗-hla-g奈米抗体的流动式细胞测量分析(flowcytometricanalysis)的操作流程如下。首先，将hla-g重组蛋白(cat#：tp305216,origene)(0.2μg/ml，每孔100μl)在96孔盘上于4℃涂覆过夜。隔天，移除涂覆缓冲液，在室温下用3％脱脂牛奶封阻2小时。接着，用pbst(0.05％tween溶于pbs中)清洗5次。添加不同浓度的抗-hla-g奈米抗体(选殖株#9、#20或#33)或商用抗-hla-g单株抗体(87g)于4℃过夜。清洗5次后，于室温加入生物素化的kir2dl4(biotinylatedkir2dl4)(sinobiological,cat:13052-h02s)(0.2mg/ml，每孔100μl)2小时。清洗9次后，每孔与100μl含有链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化酶缀合物(streptavidin-hrpconjugates)(thermofisher,catno:n100，稀释滴度：5000:1)的pbst在室温下作用2小时。以pbst清洗9次后，加入50μl的tmb受质(用于侦测hrp活性)(thermofisher,catno:n301)。之后，添加50μl的终止溶液(thermofisher,catno:n600)来终止反应，然后使用450nm波长的elisa读取仪进行测量。将商用抗-hla-g单株抗体(87g)的最高浓度设置为100％阻断kir2dl4/hla-g交互作用以计算其他反应。[0057]抗-hla-g奈米抗体的流动式细胞测量分析结果显示于图4，其中人类乳癌细胞株mda-mb-231及人类非小细胞肺癌细胞株a549的量为1×106商用抗体(commercialab)为pe(#12-9957-42)(它是一种抗-hla-g单株抗体，0.25μg配于100μlpbs溶液中)及商用单株抗体87g，抗-hla-g奈米抗体为重链可变域(vhh)奈米抗体(0.25μg配于100μlpbs溶液中)，二级抗体为兔子抗-骆驼vhh,ifluor555(rabbitanti-camelidvhh,ifluor555)(0.5μg配于100μlpbs溶液中)，mfi表示平均萤光强度(meanfluorescenceintensity)，unstained表示未染色，clone表示选殖株。[0058]实施例6.抗-hla-g奈米抗体的免疫细胞化学(immunocytochemistry)分析结果[0059]在本实施例中，抗-hla-g奈米抗体的免疫细胞化学(immunocytochemistry)分析的操作流程如下。将肿瘤细胞(1×105)接种在6孔盘的盖玻片上，培育过夜。在指定的处理后，将细胞固定在1％多聚甲醛(paraformaldehyde)中，用pbs清洗，在含有0.5％bsa的pbs中使用0.1％tritonx-100透化30分钟，用2％bsa封阻，并与专一性抗体(配于2％bsa/含有0.05％tween-20的pbs(pbst)中)一起作用。在清洗之后，将细胞与萤光素缀合的二级抗体一起作用，用pbst清洗，并使用含有抗褪色剂及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,dapi)的水性封固剂封固。在leicatcssp8x共焦显微镜(leica)下分析影像。[0060]抗-hla-g奈米抗体的免疫细胞化学分析结果显示于图5a及5b，其中图5a使用细胞株为人类乳癌细胞株mda-mb-231，图5b使用细胞株为人类非小细胞肺癌细胞株a549，商用抗体4h84是一种抗-hla-g单株抗体，抗-hla-g奈米抗体的浓度为1ng/ml，二级抗体为抗-vhh-萤光素(fluorescein,fitc)(1:5000)。由图5a及5b可见，藉由免疫细胞化学分析，抗-hla-g奈米抗体选殖株#9及#20可以识别细胞膜上的hla-g蛋白质，使用抗-hla-g奈米抗体选殖株#9及#20、商用抗体4h84及商用pan-钙黏素(pan-cadherin)抗体，[0061]hla-g的表现与质膜标志pan-钙黏素(pan-cadherin)共定位于mda-mb-231及a549细胞上。[0062]实施例7.抗-hla-g奈米抗体的免疫组织化学染色(immunohistochemistrystaining,ihcstaining)结果[0063]在本实施例中，抗-hla-g奈米抗体的免疫组织化学染色(immunohistochemistrystaining,ihcstaining)的操作流程如下。人类胎盘样品被固定在10％的甲醛中并包埋在石蜡中。切片(厚度＝3μm)使用苏木精及伊红染色。对于免疫组织化学，抗原回复(antigenretrieval)藉由在99℃微波进行。切片用h2o2清洗及作用20分钟以阻断内源性过氧化酶，然后在5％bsa中浸泡30分钟。然后将切片与初级抗体在4℃下作用过夜。在清洗之后，将切片以稀释的生物素-缀合的二级抗体在室温下作用2小时或在4℃下作用过夜。最后，切片在室温下与聚合物一起作用10分钟然后二胺基联苯胺(diaminobenzidine,dab)(是辣根过氧化酶最敏感、最常用的显色反应物)染色，用苏木精及伊红染色，并使用中性橡胶固定。染色的定量藉由光学显微镜(nikon，日本)以40倍及400倍放大率独立进行。[0064]抗-hla-g奈米抗体的免疫组织化学染色结果显示于图6，其中所用样品为人类胎盘，商用抗体为4h84(它是一种抗-hla-g单株抗体)(#sc-21799)，浓度200μg/ml，作用浓度4μg/ml，商用抗体组的二级抗体为山羊抗-兔子hrp，dab表示二胺基联苯胺(diaminobenzidine)(是辣根过氧化酶最敏感、最常用的显色反应物)，抗-hla-g奈米抗体为重链可变域(vhh)奈米抗体(作用浓度4μg/ml)，实验组(#9)的抗体包括兔子抗-骆驼vhh抗体(rabbitanti-camelidvhhantibody)、生物素(biotin)(0.5μg配于100μlpbs溶液中)及山羊抗-兔子hrp。本实施例的结果证实，抗-肿瘤抗原奈米抗体(即抗-hla-g抗体)可藉由免疫组织化学染色用以侦测hla-g的表现。[0065]综上所述，本发明抗-肿瘤抗原奈米抗体(即抗-hla-g抗体)藉由竞争型酵素结合免疫吸附分析法(competitiveenzymelinkedimmunosorbentassay,competitiveelisa)证明抗-hla-g奈米抗体在ic50的50％阻断活性内阻断hla-g与其受体:杀手细胞免疫球蛋白样受体两个ig域及长胞质尾4(killercellimmunoglobulinlikereceptor,twoigdomainsandlongcytoplasmictail4,kir2dl4)及白血球免疫球蛋白样受体子族b成员1(leukocyteimmunoglobulin-likereceptorsubfamilybmember1,lilrb1)之间的交互作用、增强自然杀手细胞(naturalkillercell,nkcell)对人类乳癌细胞株mda-mb-231的细胞溶解(cytolysis)作用及细胞毒性、藉由西方墨点分析(westernblotting)证明抗-hla-g奈米抗体可以识别人类癌细胞株mda-mb-231及a549细胞的细胞溶解产物中的hla-g蛋白质、流动式细胞测量分析(flowcytometricanalysis)、藉由免疫细胞化学分析证明抗-hla-g奈米抗体可以识别细胞膜上的hla-g蛋白质、hla-g的表现与质膜标志pan-钙黏素(pan-cadherin)共定位于mda-mb-231及a549细胞上，及藉由免疫组织化学染色(immunohistochemistrystaining,ihcstaining)证明抗-hla-g抗体可用以侦测hla-g的表现，藉此达到治疗癌症及免疫相关疾病的效用。特别地，相较于习知的抗体必须藉由载体将基因转染至细胞中表现抗体功能而有低产量及效果不彰的缺点，本发明抗-肿瘤抗原奈米抗体可在体外大规模制备后直接投药至需要的个体内进行治疗。另外，本发明也可达到检测hla-g表现量的效用。[0066]以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于权利要求书中。当前第1页12当前第1页12