1.发明属于微藻破壁技术领域，具体涉及一种高效小球藻细胞壁方法及应用。
背景技术：
2.小球藻（chlorella）是一种球形单细胞绿藻，分布极广，不仅能够通过光合作用自养，在有机碳源充足的条件下还可以进行异养，并且生长繁殖速度快，是地球上唯一一种能在20小时内增长4倍的生物，所以现已被广泛养殖；小球藻细胞中含有丰富的营养物质，细胞中蛋白质含量可达60~70%，氨基酸种类齐全，是人和动物优良的蛋白质来源；同时小球藻细胞中富含多糖和不饱和脂肪酸等活性物质，具有抗氧化、增强免疫力、降血脂等保健功能；另外，小球藻中还富含维生素、矿物质，20 g小球藻粉所含的维生素、矿物质大约相当于1 kg普通蔬菜的含量；目前小球藻已广泛应用于医药、食品、饲料以及化妆品等领域。
3.小球藻具有多种生物功能，但由于细胞壁厚且坚硬，很难破碎，细胞内的有效成分不易释放，给实际应用增加了很高的成本，使其价值的发挥受到很大限制；因此，小球藻破壁技术是制约小球藻产业化发展的重要因素之一。
4.目前小球藻的破壁方法主要有研磨法、机械匀浆法、交替冻融法、超声波破碎法、酶解法等；其中，研磨法和机械匀浆法破壁效率较低，破壁过程产热多，易造成细胞内活性物质失活；交替冻融法较为温和，但耗时长，破壁效率较低；超声波破碎法破壁率较高，但长时间超声处理极易造成局部温度过高，导致蛋白质变性和活性物质失活；酶解法对于活性物质的破坏较小，但单独使用破壁耗时长、成本高。
5.针对以上小球藻细胞破壁方法中存在的种种弊端，开发一种温和、高效的小球藻细胞破壁方法对小球藻蛋白质提取和其他生物活性物质产品开发是非常有意义的。
技术实现要素：
6.针对已有小球藻细胞破壁技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种温和、高效、低能耗的小球藻细胞破壁方法及应用，提高小球藻的破壁效率，提高蛋白质的溶出率，为开发小球藻细胞内活性物质提供技术基础。
7.为了达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：s1：将小球藻在bg11培养基中培养7~10天，光照强度设置为4000 lx，培养温度为21℃。
8.s2：将s1步骤中培养7~10天的小球藻藻液以4000 g的转速离心浓缩，离心时间为5分钟，得到小球藻藻泥。
9.s3：将s2步骤中获得的藻泥用蒸馏水稀释到0.08 g/ml~0.15 g/ml浓度范围，得到一定浓度的藻液。
10.s4：向s3步骤获得的藻液中加入酶活性为10000 u/g的纤维素酶，纤维素酶与小球藻干重的质量比为1:50；调节藻液的ph值到5.0，在50℃水浴中进行酶解反应2~4小时。
11.s5：将s4步骤中纤维素酶酶解后的藻液在液氮或-80℃条件下彻底冻结后，取出于37℃水浴中融化，并重复以上冻融过程2~5次。
12.s6：将s5步骤中冻融后的藻液进行超声波破碎，超声波功率设置为200~400 w，超声时间5~10秒，超声间隔5~10秒，超声波破碎总时间为8~20分钟；超声波破碎过程中采用冰浴方式控制藻液温度在4℃以下。
13.优选地，所述s3步骤中，藻液用蒸馏水调整浓度至0.1 g/ml~0.12 g/ml。
14.优选地，所述s4步骤中，纤维素酶酶解反应时间为2.5~3小时。
15.优选地，所述s5步骤中，小球藻藻液冻融次数为3~4次。
16.优选地，所述s6步骤中，超声波功率为300~400 w。
17.优选地，所述s6步骤中，超声波破碎过程中，超声时间10秒，超声间隔10秒，总时间为10~15分钟。
18.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明优化组合使用了几种有效的破壁手段，前期使用纤维素酶处理和冻融的方法，使微藻细胞破壁所需的超声时间大大缩短，且破壁全程温度控制在4℃以下，最大限度的减少了局部产热和超声波机械力对小球藻细胞内活性物质的破坏，同时提高了微藻细胞破壁效率；经本发明所涉及的小球藻破壁方法处理后，蛋白核小球藻的蛋白质溶出率显著提高，最高可达91.6%；且由于细胞破壁处理过程温和，能够保持细胞内活性物质的活性，使其得到最大限度的提取和应用，为利用小球藻生产相关健康产品提供了技术基础。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；本领域技术人员应该明了，下面所述实施例是本发明一部分实施例，仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的限制；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1用bg11培养基培养蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），光照强度为4000 lx，培养温度为21℃，培养7天后，将藻液用转速4000 g离心5分钟，收集藻泥，加蒸馏水调整藻液浓度至0.1 g/ml；向上述小球藻藻液中加入活性为10000 u/g的纤维素酶，纤维素酶与小球藻干重的质量比为1:50；调节藻液ph至5.0；将上述混合液放在50℃水浴中孵育2.5小时；酶解结束后，将小球藻藻液在液氮中速冻后，取出于37℃水浴中融化，重复以上冻融过程3次；将冻融后的藻液进行超声波破碎，超声波功率设置为400 w，超声时间10秒，超声间隔10秒，超声波破碎总时间为10分钟。
21.实施例2用bg11培养基培养蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），光照强度为4000 lx，培养温度为21℃，培养7天后，将藻液用转速4000 g离心5分钟，收集藻泥，加蒸馏水调整藻液浓度至0.12 g/ml；向上述小球藻藻液中加入活性为10000 u/g的纤维素酶，纤维素酶与小球藻干重的质量比为1:50；调节藻液ph至5.0；将上述混合液放在50℃水浴中孵育3小时；酶解结束后，将小球藻藻液在液氮中速冻后，取出于37℃水浴中融化，重复以上冻融过程3次；将冻融后的藻液进行超声波破碎，超声波功率设置为300 w，超声时间10秒，超声间隔10秒，超声波破碎总时间为10分钟。
22.实施例3用bg11培养基培养蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），光照强度为4000 lx，培养温度为21℃，培养7天后，将藻液用转速4000 g离心5分钟，收集藻泥，加蒸馏水调整藻液浓度至0.1 g/ml；向上述小球藻藻液中加入活性为10000 u/g的纤维素酶，纤维素酶与小球藻干重的质量比为1:50；调节藻液ph至5.0；将上述混合液放在50℃水浴中孵育3小时；酶解结束后，将小球藻藻液在液氮中速冻后，取出于37℃水浴中融化，重复以上冻融过程4次；将冻融后的藻液进行超声波破碎，超声波功率设置为300 w，超声时间8秒，超声间隔8秒，超声波破碎总时间为12分钟。
23.实施例4用bg11培养基培养蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），光照强度为4000 lx，培养温度为21℃，培养7天后，将藻液用转速4000 g离心5分钟，收集藻泥，加蒸馏水调整藻液浓度至0.15 g/ml；向上述小球藻藻液中加入活性为10000 u/g的纤维素酶，纤维素酶与小球藻干重的质量比为1:50；调节藻液ph至5.0；将上述混合液放在50℃水浴中孵育3.5小时；酶解结束后，将小球藻藻液在-80℃中速冻后，取出于37℃水浴中融化，重复以上冻融过程4次；将冻融后的藻液进行超声波破碎，超声波功率设置为400 w，超声时间10秒，超声间隔10秒，超声波破碎总时间为15分钟。
24.实施例5用bg11培养基培养蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），光照强度为4000 lx，培养温度为21℃，培养7天后，将藻液用转速4000 g离心5分钟，收集藻泥，加蒸馏水调整藻液浓度至0.08 g/ml；向上述小球藻藻液中加入活性为10000 u/g的纤维素酶，纤维素酶与小球藻干重的质量比为1:50；调节藻液ph至5.0；将上述混合液放在50℃水浴中孵育2小时；酶解结束后，将小球藻藻液在液氮中速冻后，取出于37℃水浴中融化，重复以上冻融过程5次；将冻融后的藻液进行超声波破碎，超声波功率设置为300 w，超声时间8秒，超声间隔8秒，超声波破碎总时间为15分钟。
25.实施例6用bg11培养基培养蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），光照强度为4000 lx，培养温度为21℃，培养7天后，将藻液用转速4000 g离心5分钟，收集藻泥，加蒸馏水调整藻液浓度至0.1 g/ml；向上述小球藻藻液中加入活性为10000 u/g的纤维素酶，纤维素酶与小球藻干重的质量比为1:50；调节藻液ph至5.0；将上述混合液放在50℃水浴中孵育4小时；酶解结束后，将小球藻藻液在液氮中速冻后，取出于37℃水浴中融化，重复以上冻融过程2次；将冻融后的藻液进行超声波破碎，超声波功率设置为300 w，超声时间10秒，超声间隔10秒，超声波破碎总时间为8分钟。
26.对比例1本对比例1提供一种蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa）细胞破壁方法，所述方法与实施例1的区别在于不包括纤维素酶酶解过程，其他条件均保持不变，具体步骤如下所述。
27.用bg11培养基培养蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），光照强度为4000 lx，培养温度为21℃，培养7天后，将藻液用转速4000 g离心5分钟，收集藻泥，加蒸馏水调整藻液浓度至0.1 g/ml，将小球藻藻液在液氮中速冻后，取出于37℃水浴中融化，重复以上冻
融过程3次；将冻融后的藻液进行超声波破碎，超声波功率设置为400 w，超声时间10秒，超声间隔10秒，超声波破碎总时间为10分钟。
28.对比例2本对比例1提供一种蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa）细胞破壁方法，所述方法与实施例1的区别在于不包括冻融过程，其他条件均保持不变，具体步骤如下所述。
29.用bg11培养基培养蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），光照强度为4000 lx，培养温度为21℃，培养7天后，将藻液用转速4000 g离心5分钟，收集藻泥，加蒸馏水调整藻液浓度至0.1 g/ml；向上述小球藻藻液中加入活性为10000 u/g的纤维素酶，纤维素酶与小球藻干重的质量比为1:50；调节藻液ph至5.0；将上述混合液放在50℃水浴中孵育2.5小时；酶解结束后，将小球藻藻液进行超声波破碎，超声波功率设置为400 w，超声时间10秒，超声间隔10秒，超声波破碎总时间为10分钟。
30.对比例3本对比例1提供一种蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa）细胞破壁方法，所述方法与实施例1的区别在于不包括超声波破碎过程，其他条件均保持不变，具体步骤如下所述。
31.用bg11培养基培养蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），光照强度为4000 lx，培养温度为21℃，培养7天后，将藻液用转速4000 g离心5分钟，收集藻泥，加蒸馏水调整藻液浓度至0.1 g/ml；向上述小球藻藻液中加入活性为10000 u/g的纤维素酶，纤维素酶与小球藻干重的质量比为1:50；调节藻液ph至5.0；将上述混合液放在50℃水浴中孵育2.5小时；酶解结束后，将小球藻藻液在液氮中速冻后，取出于37℃水浴中融化，重复以上冻融过程3次。
32.评价试验本发明采用水溶性蛋白质溶出率评价实施例1~6和对比例1~3所述方法的蛋白核小球藻破壁率，具体是采用bca比色法测定水溶性蛋白溶出率，在碱性环境下蛋白质与cu
2+
络合并将cu
2+
还原成cu
1+
；bca与cu
1+
结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值，且吸光值与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度，该方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的紫色复合物很稳定，且受干扰物质影响小。
33.本发明中bca比色法测定水溶性蛋白溶出率采用试剂盒操作，先配制不同浓度梯度的bsa标准蛋白溶液，加入显色液，在37℃水浴中反应30分钟后，用分光光度计测量562 nm处的吸收值，制作标准曲线，待测样品的蛋白浓度根据标准曲线的回归方程计算。
34.取10 ml按s1步骤中培养7天的蛋白核小球藻，4000 g离心5分钟，将获得的藻泥在65℃条件下完全烘干，用研钵充分研磨破壁，称取干藻粉重量，加入蒸馏水调整藻液浓度至0.1 g/ml，充分振荡混匀后，10000 g离心15分钟，取上清液，按照bca比色法测定蛋白含量为a0%；将实施例1~6和对比例1~3所获得的破壁藻液用蒸馏水调整至藻液浓度0.1 g/ml，并按上述离心步骤提取水溶性蛋白，取上清液，按照bca法测定蛋白质含量为a1%；按照实施例1~6和对比例1~3中添加的纤维素酶浓度，配制同样浓度的纤维素酶溶液，按照bca比色法测定蛋白含量为a2%。
35.破壁率y可由下式计算：
根据以上公式计算实施例1~6和对比例1~3的破壁率，结果如表1所示：表l。
36.尽管以上结合实施例对本发明的实施方案进行了描述，需要说明的是，所描述的实施例仅为本发明的一部分具体实施方式，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明技术构思和技术方法范围之内，所做的任何等同替换、改进等，均属于本发明的保护范围和公开范围。