马链球菌兽疫亚种的实时荧光定量PCR检测引物、方法与应用

马链球菌兽疫亚种的实时荧光定量pcr检测引物、方法与应用
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，具体地说，涉及马链球菌兽疫亚种的实时荧光定量pcr检测引物、方法与应用。


背景技术：

2.马链球菌兽疫亚种(streptococcus equi ssp.zooepidemicus，sez)是猪链球菌病的主要病原体之一，属兰氏分群的c群链球菌，呈阳性，该菌主要引起马、猪、牛、犬、猫等多种动物下呼吸道感染，并引起败血症、脑膜炎、关节炎等症状，严重时会引起突发性死亡。
3.sez的感染流行范围广，死亡率高。除了对猪具有感染性外，该菌还能够通过粪便传播感染家禽，导致家禽产蛋率下降，严重时引发猝死；也有报道表示该病原能感染宠物龙猫，导致龙猫子宫出现脓肿的症状。由此可见，sez的危害性极大，对宿主没有特异性，阻碍了动物健康发展。因此建立一种准确、灵敏、快速的sez诊断方法具有重要的意义。
4.目前sez诊断方法主要包括血清学和分子生物学等：血清学诊断主要采用平板凝集试验、elisa等方法。但这些方法存在敏感度相对较低，当抗体水平相对较低时，无法检测；且需要专业人员进行操作，既费时且成本高，只能用于实验室的诊断，不适合用于大量样品的检测；现有分子生物学诊断中建立的多重pcr检测技术只能区分马链球菌亚种与其他猪链球菌且灵敏相对较低。因此，需要针对上述的缺陷进行改进。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种敏感度较高、成本低且快速的用于大量样品检测的马链球菌兽疫亚种的检测方法。
6.为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
7.马链球菌兽疫亚种的实时荧光定量pcr检测引物，其核苷酸序列如seq id no.1-2所示。
8.本发明公开的一对特异性扩增引物，可解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供了一种有益的选择或创造条件。该特异性扩增引物对包含特异性扩增马链球菌兽疫亚种的pgm基因的上游引物和下游引物。本发明采用pgm基因扩增引物建立了实时荧光定量pcr方法，可快速检测sez引起的疾病，便于发现早期感染动物。
9.本发明的引物中，上游引物qpgm-f的序列为5
′‑
ccccgtagctctctgcaat-3
′
(seq id no.1)，下游引物qpgm-r的序列为5
′‑
gcagactgggacgctacc-3
′
(seq id no.2)。其特异性扩增的gpcr基因片段长度为89bp。
10.本发明还提供上述引物在制备马链球菌兽疫亚种检测试剂或试剂盒中的应用。以及含有上述引物的试剂或试剂盒。
11.本发明的试剂盒中，还包括sybr greenⅱmix混合液和阳性标准品，所述阳性标准品为包含马链球菌兽疫亚种的pgm基因的重组质粒。
12.优选，所述重组质粒的构建步骤包括：提取、pcr扩增、回收马链球菌兽疫亚种的
tap 12.5μl，实施例1中所述上、下游引物各1.0μl(10μmol/l)，模板1.0μl，ddh2o 7.5μl。扩增程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。pcr扩增产物经1.0％琼脂糖电泳。然后按照dna purification kit说明书步骤，回收纯化pcr产物，将pcr纯化产物通过solutioni连接酶与pmd19-t载体相连，后将连接产物热转化至dh5α大肠杆菌感受态中，在固体lb
amp+
平板筛选获得阳性克隆，即为阳性标准品。将阳性标准品进行pcr验证并将pcr验证成功的质粒送去测序。pcr验证结果如图1：泳道标号1为重组质粒pmd19t-sez，泳道标号2为阴性对照(ddh2o)。
31.将重组质粒pmd19t-sez送上海生工生物工程有限公司进行测序。利用分光光度计测定重组质粒的od
260nm
/od
280nm
比值和浓度，根据公式：质粒拷贝数(copies/μl)＝(质粒浓度
×
10-9
×
稀释倍数
×
6.02
×
10
23
)/(660道尔顿/碱基
×
碱基数)，将标准质粒浓度换算为拷贝数。
32.实施例3荧光定量pcr标准曲线的建立
33.将重组质粒pmd19t-sez进行梯度稀释，得3.87
×
102copies/μl～3.87
×
109copies/μl 8个稀释度的标准品，将其作为反应模板。每个稀释梯度设3个样品重复并建立阴性对照。荧光定量pcr反应体系为20μl：sybr greenⅱmix(2
×
)10μl，上、下游引物(seq id no.1-2)各0.6μl(10μmol/l)，模板2μl，ddh2o 6.8μl。反应条件为：(1)预变性：95℃，30s，4.4℃/s，1个循环；(2)pcr反应：95℃，5s，4.4℃/s；54℃，30s，2.2℃/s；72℃，30s，4.4℃/s，共40循环。(3)溶解曲线：95℃，5s，4.4℃/s；60℃，1min，2.2℃/s；95℃，0s，0.11℃/s。
34.以标准品拷贝数的对数为x轴，
△
ct值为y轴，绘制标准曲线如图2所示，标准曲线为y＝-3.306x+38.526，相关系数r2＝0.9982。扩增效率efficiency＝100.67％。
35.实施例4特异性试验
36.按照mini best viralrna/dna extraction kit提取沃式葡萄球菌(mh36926264.1，由佛山科学技术学院预防兽医重点实验室提供)、巴氏葡萄球菌(mg255966.1，由佛山科学技术学院预防兽医重点实验室提供)、大肠杆菌(购自宝日生物技术(北京)有限公司)、沙门菌(购自宝日生物技术(北京)有限公司)dna。利用实施例3建立的sez荧光定量pcr进行检测，以重组质粒pmd19t-sez为阳性对照，以验证该检测方法的特异性。结果如图3所示，图中标号1为重组质粒pmd19t-sez的扩增曲线，标号2、3、4、5分别为沃式葡萄球菌、巴士葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌扩增曲线。可见本荧光定量pcr试剂盒具有良好的sez特异性。
37.实施例5灵敏度试验
38.将重组质粒pmd19t-sez进行10倍倍比稀释，获得了3.87
×
102copies/μl～3.87
×
109copies/μl8个稀释度的标准品，将其作为模板，进行实施例3建立的荧光定量pcr的灵敏度检测。同时对相同模板进行普通pcr扩增(反应体系和条件参见实施例2)，观察两种检测方法的灵敏度。
39.普通pcr结果如图4所示，其中m:marker、1-9泳道分别是：3.87
×
101copies/μl 3.87
×
102copies/μl、3.87
×
103copies/μl、3.87
×
104copies/μl、3.87
×
105copies/μl、3.87
×
106copies/μl、3.87
×
107copies/μl、3.87
×
108copies/μl、3.87
×
109copies/μl标准品；可见普通pcr最低检测浓度为3.87
×
106copies/μl。
40.荧光定量pcr结果如图5所示，标号1～8分别为：3.87
×
109copies/μl、3.87
×
108copies/μl、3.87
×
107copies/μl、3.87
×
106copies/μl、3.87
×
105copies/μl、3.87
×
104copies/μl、3.87
×
103copies/μl、3.87
×
102copies/μl所对应的扩增结果。可见，即使浓度为3.87
×
102copies/μl的样品也能顺利实现扩增检出。综上述荧光定量pcr灵敏度远高于普通pcr。
41.实施例6重复性试验
42.选取3.87
×
102copies/μl～3.87
×
109copies/μl共8个浓度重组质粒pmd19t-sez进行批内重复试验；在3个不同时间，对上述8个稀释度的质粒标准品进行批间重复性试验，每个浓度重复3次反应。根据模板cq值计算批内、批间的变异系数(cv)，验证实施例3建立的荧光定量pcr方法的可靠性和重复性。结果如表1所示。
43.表1荧光定量pcr方法的重复性试验(n＝3)
[0044][0045][0046]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。