一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法

1.本发明涉及分子生物学方法检测环境微生物技术领域，特别涉及一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻定量方法。


背景技术：

2.球形棕囊藻(phaeocystis globosa)属于金藻门定鞭藻纲(haptophyceae)，是全球范围普遍存在的一类有害赤潮种。在赤潮暴发早期为游离的单细胞(3-8μm)，赤潮暴发时大量单细胞聚集形成囊体从而暴发赤潮。棕囊藻囊赤潮的暴发严重危害养殖业、生态旅游业，造成巨大的经济损失，爆发球形棕囊藻赤潮还易于导致核电站冷却水系统堵塞，严重威胁到核电和公众的安全。因此，应给与球形棕囊藻高度重视，急需加强对球形棕囊藻赤潮藻的监测、预警和治理研究。
3.然而在赤潮暴发早期，针对单细胞球形棕囊藻的定量分析技术一直是国内外尚未解决的难题。目前常用的监测手段比如显微镜技术、流式技术以及卫星遥感技术灵敏度不够。大多在囊体赤潮暴发后才有所察觉，而此时才采取相应的治理措施却为时已晚，所以，如果在赤潮暴发之前能够快速监测赤潮发生早期的赤潮藻类的动态，然后采取相应的预防、消除措施，这将有效的避免极大的经济损失以及保障人类的生命健康安全，具有非常重大的实际意义。既然要提前了解赤潮种类动态，只做到对赤潮种的定性检测远远不够，还需要对其进行准确的定量。因此寻找赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的定量分析方法成了当务之急。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的试剂盒，并实现球形棕囊藻赤潮暴发早期低丰度的单细胞棕囊藻定量分析。
5.为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法，包括以下操作步骤：
7.(1)引物和探针的设计与合成：
8.在球形棕囊藻核糖体基因5.8s-its2区域的保守区域设计与合成引物和探针，设计与合成引物序列为：
9.上游引物序列pgf2：5'-atggcatttccaagtttcgc-3'，退火温度58.6℃；
10.下游引物序列pgr2：5'-gcactccccagcttcagc-3'，退火温度58.1℃；
11.taqman探针的序列pgp2：5'-fam-cgtctgaacctcctcca-nfq-mgb-3'，退火温度68℃；
12.(2)样品基因dna提取：采用天根植物基因组dna提取试剂盒进行提取，提取出样品基因的核酸溶液；
13.(3)采用步骤(1)中的引物和探针配置荧光定量pcr定量体系，并进行荧光定量pcr检测；
14.(4)采用步骤(2)提取的实际环境样本的核酸溶液与球形棕囊藻阳性对照样品的荧光定量pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序比对分析，以确定方法的特异性以及对实际环境样本中单细胞球形棕囊藻定量的可行性；
15.(5)单细胞球形棕囊藻定量：取待测样品通过流式细胞仪准确计数，之后按步骤(2)提取核酸溶液，稀释后按步骤(3)对各数量级的样品进行定量体系的配置和上机检测，其中扩增曲线的阈值设定在扩增曲线的指数期，所设置的阈值＝0.105，阈值与扩增曲线相交时的值为ct值，根据各个数量级的细胞和其所测得的ct值之间的关系建立标准曲线，得到定量方程式，以此方程式计算出球形棕囊藻单细胞的数量。
16.进一步地，在步骤(1)中，所述引物序列中，fam为标记在探针5'端的报告荧光集团，nfq为标记在探针3'末端的非荧光淬灭集团，mgb为标记在3'端的dna小沟结合物。
17.进一步地，在步骤(1)中，所述的上、下游引物的荧光定量pcr产物片段大小为147bp。
18.进一步地，在步骤(2)中，采用天根植物基因组dna提取试剂盒进行提取时的操作步骤参照试剂中说明书的方法进行，最终提取后核酸溶液的体积为50-100ul。
19.进一步地，在步骤(3)中，荧光定量pcr分析的反应体系包括：2
×
goldstar probe mixture、上游引物pgf2、下游引物pgr2、探针pgp2、dna模板、50
×
low rox、ddh2o。
20.进一步地，在步骤(3)中，荧光定量pcr分析的反应体系为20ul。
21.进一步地，在步骤(3)中，荧光定量pcr检测的反应程序采用两步法，即95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火延伸60s，此处采集荧光信号，共计40个循环。
22.进一步地，在步骤(4)中，步骤(2)中的核酸溶液与阳性对照样品的荧光定量pcr产物片段大小与所设计引物与探针时的预计产物片段大小一致；进行二代测序后通过比对和构建进化树分析，可确定特异性扩增信号的生物就是球形棕囊藻。
23.进一步地，在步骤(5)中，单细胞球形棕囊藻的定量方程式为：y＝-3.305x+34.07，线性关系r2＝0.999。
24.一种包含上述的引物和探针的试剂盒。
25.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
26.(1)本发明能同时对赤潮暴发早期低丰度的单细胞球形棕囊藻进行定性和定量，既能知道未知样本中是否有球形棕囊藻细胞，同时又能知道样本中单细胞球形棕囊藻的细胞丰度。
27.(2)该发明具有更低的细胞定量限(101个/l)，显著高于目前传统镜检工具、流式工具对单细胞球形棕囊藻的定量灵敏度(104个/l)，能在更早的时候实现球形棕囊藻赤潮的预警，然后更早的采取预防、治理措施。
28.(3)本发明操作简单，能实现高通量的定量分析，所以省时省力：根据所设计的定量pcr反应程序，其定量分析过程只需要1h左右，整个实验包括核酸制备、上机检测和检测结果的分析和计算大约可以在3h左右得到分析结果；当然本发明还可以结合仪器多孔板的配置情况，可实现对高通量的定量分析，工作效率高。
29.(4)本发明对单细胞球形棕囊藻的定量分析特异性强、灵敏度高、准确性好以及普适性高，本发明中所设计的特异性引物和探针位于球形棕囊藻核糖体基因中的较保守区(5.8s)和高变区(its2)中的保守区，即保证了方法的普适性，又提高了球形棕囊藻与其它
非目标生物之间的特异性。
30.(5)本发明能应用到赤潮暴发早期的低密度的球形棕囊藻的定量分析，在本发明应用实例中能定量出低至103个/l数量级的细胞。为监管部门对球形棕囊藻赤潮暴发的早期预警与提前防控提供了准确的预警工具，避免大量养殖、旅游、核电产业的经济损失和保证人类健康安全。
31.(6)本发明能实现了定量分析之前很难定量的低丰度球形棕囊藻，为球形棕囊藻的海域生态学、生活史研究提供新工具，具有很好的应用前景。
附图说明
32.图1为室内纯培养的球形棕囊藻rdna部分序列与棕囊藻株系(eu024766.1)的比对结果。
33.图2为引物和探针的特异性初步验证结果。
34.图3为引物和探针的荧光定量pcr产物的验证结果，其中(a)产物片段的琼脂糖凝胶电泳；(b)产物片段测序后进行比对分析构建进化树。
35.图4为用于构建标准曲线的不同数量级细胞样品的荧光定量pcr扩增曲线。
36.图5为单细胞球形棕囊藻的细胞定量标准曲线。
37.图6为所建立的单细胞球形棕囊藻定量方法对已知细胞数量样品的检测曲线。
38.图7为本发明对已知细胞数量样品的定量结果与真实结果的对比。
39.图8为本发明对自然海区样本检测时的扩增曲线。
具体实施方式
40.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
41.从自然海区分离出来室内纯培养的球形棕囊藻rdna部分序列的克隆测序：通过对单细胞球形棕囊藻进行克隆测序，得到如序列1所示的球形棕囊藻rdna部分序列，序列长度为479bp。序列经过比对分析，如图1所示，发现与球形棕囊藻株系(eu024766.1)的序列匹配度达到98％。样品克隆测序成功后，得到的球形棕囊藻rdna部分序列如下所示：
42.[0043][0044]
(2)试剂盒中的引物和探针的设计与组成:在上述步骤(1)的基础上，提出了一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的试剂盒。该试剂盒中含有用于定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的引物和探针组合。其设计方法为：首先对步骤(1)所测序的479bp球形棕囊藻rdna部分序列进行比对分析，其次是根据比对结果识别出较保守的序列，最后在保守的序列区域设计用于定量分析的引物和探针。最终本发明在球形棕囊藻核糖体基因5.8s-its2区域的保守区域设计与合成引物和探针。
[0045]
如序列1中下划线所示，试剂盒中所设计的引物与探针序列为:
[0046][0047]
其中试剂盒其中seq id no.3中的fam为标记在探针5'端的报告荧光基团，nfq为标记在探针3'末端的非荧光淬灭基团，mgb是标记在3'端的dna小沟结合物。
[0048]
(3)样品基因组dna的提取：采用天根植物基因组dna提取试剂盒进行提取,详细步骤参照试剂中说明书的方法进行，最终提取后核酸溶液的体积为50-100ul。
[0049]
(4)采用步本试剂盒中引物和探针配置荧光定量pcr定量体系：
[0050]
步骤(4)中荧光定量pcr分析的反应体系为20ul，采用康为世纪公司的探针法试剂。各反应体系成分及体积见表1。
[0051]
表1.球形棕囊藻荧光定量pcr检测体系
[0052][0053]
步骤(4)中荧光定量pcr检测的反应程序采用两步法:即95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火延伸60s，此处采集荧光信号，共计40个循环。
[0054]
(5)试剂盒中引物和探针的特异性验证：使用目标引物和探针对目标生物或非目标生物的dna模板进行验证，通过否有扩增信号产生、琼脂糖凝胶电泳以及测序分析来验证引物和探针的特异性。如图2所示：所设计的引物与探针对从自然海区分离出来纯化培养的球形棕囊藻、自然海区样本都有扩增信号，而阴性对照无扩增信号产生，初步验证了对从自然海区分离出来纯化培养的球形棕囊藻的特异性。
[0055]
进一步地，通过对荧光定量pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序比对分析，如附图3所示：自然海区样品和室内纯化培养的球形棕囊藻的产物片段大小与所设计引物与探针时的预计产物片段(147bp)大小一致，如图3中a所示；此外对海区样品和室内纯种球形棕囊藻样品的产物进行二代测序，之后通过比对和构建进化树分析，如图3中b所示，证明从自然海区样品中检出特异性扩增信号的生物就是球形棕囊藻。最后结合图2和3的结果表明所设计的引物与探针对海区里面的球形棕囊藻、室内纯培养的棕囊藻都具有很好的特异性。
[0056]
(6)单细胞球形棕囊藻定量标曲的构建：取处于指数生长期的室内纯培养的球形棕囊藻，通过流式细胞仪进行准确计数，数据如表2所示，之后按步骤(3)的核酸制备方法进行dna提取。核酸提取后按1：10进行稀释，之后按按步骤(4)对各数量级的样品进行反应体系的配置和上机检测。根据定量pcr阈值的设置原则，扩增曲线的阈值设定在扩增曲线的指数期，所设置的阈值＝0.105，阈值与扩增曲线相交时的值为ct值。不同数量级的细胞的扩增曲线见图4。
[0057]
每一个数量级的pcr反应体系中所含的细胞数量以及该细胞数量在所设的阈值条件下的ct值见表2。根据表2中各个数量级的细胞和其所测得的ct值之间的关系建立标准曲线。以每个pcr反应体系中的细胞数量的对数值为横坐标，所测得的ct值为纵坐标，然后绘制细胞定量标准曲线。如附图5所示，单细胞球形棕囊藻的定量方程式为：y＝-3.305x+34.07，线性关系r2＝0.999。
[0058]
表2不同数量级的细胞建立标准曲线的各参数值
[0059][0060]
细胞数量在10
1-106数量级的范围内都具有很好的线性关系(r2＝0.999)，表明该试剂盒能对低至101数量级的细胞进行准确定量。在球形棕囊藻赤潮的早期阶段，单细胞球形棕囊藻丰度较低时，利用本发明能实现对自然海区中低丰度的单细胞球形棕囊藻进行定量评估，从而为球形棕囊藻赤潮的早期预警与提前防控提供有效的预警工具。此外本发明对单细胞球形棕囊藻的定量极限远远超过了目前其它定量分析方法。
[0061]
对于未知细胞数量的待测样品，按照步骤(3)提取核酸，之后按照步骤(4)配制反应体系，然后进行上机检测，所测得的ct值带入步骤(6)中的定量方程y＝-3.305x+34.07，即可计算出球形棕囊藻单细胞的数量是多少。(6)单细胞球形棕囊藻定量方法的准确性验证：通过定量分析已知细胞数量的棕囊藻单细胞，然后对比本方法所定量的单细胞数量与实际数量之间的差异，最后验证本定量方法的准确性。3份已知数量的单细胞球形棕囊藻的具体细胞数量见表3，这3份样品分别代表着较低、中等、较高细胞数量的样本。之后通过步骤(3)、(4)、(6)对3份已知数量的单细胞球形棕囊藻进行定量，其扩增曲线如图6，结果如表3所示。通过对比分析，如图7所示，本发明对已知数量的单细胞球形棕囊藻的定量结果和实际值均在同一数量级范围内，数量级上没有太大差异。结果表明本发明能对单细胞球形棕囊藻进行准确的定量。
[0062]
表3所建立的单细胞球形棕囊藻定量方法对已知细胞数量样品定量结果
[0063][0064]
(8)本发明在自然海区单细胞球形棕囊藻样品定量分析中的应用：为了验证本发明是否能突破室内的模拟定量分析，最终应用到自然海区以实现对现场样本的定量分析。我们对采自自然海区的5个样本进行了单细胞球形棕囊藻的定量分析。本发明通过步骤(3)、(4)、(6)对自然海区中未知数量的单细胞球形棕囊藻进行定量，其扩增曲线见图6。
[0065]
其定量结果如表4所示，自然海区的5个样本所测得的球形棕囊藻单细胞丰度范围为：8254个/l-38431个/l，5个样本中浓度最低的单细胞在103个/l的数量级。而目前文献报道中常用的流式、镜检方法对自然海区的单细胞棕囊藻检测浓度均在104个/l的数量级以上。表明本发明已突破这一定量局限，在赤潮的早期阶段能对丰度较低的单细胞球形棕囊藻进行快速、准确的定量分析。
[0066]
表4本发明对自然海区中单细胞球形棕囊藻的定量分析结果
[0067][0068]
实施例1
[0069]
基于所建立的单细胞球形棕囊藻定量方法定量分析已知细胞数量的棕囊藻细胞。
[0070]
(1)纯种培养的单细胞球形棕囊藻样品的收集：
[0071]
本实施例一共3个样品，编号分别为样品1、样品2、样品3。如表3所示，由于样品1和样品2需要收集的细胞数量较高，因此可以很容易使用流式细胞仪(bd accuri c6)进行计数和取到一定数量的细胞。而样品3所需要收集的细胞数较少，因此我们通过稀释已知数量的较高浓度的单细胞球形棕囊藻来取到一定数量细胞。所有样品最终使用0.45um的玻璃纤维滤膜(直径25mm)过滤收集细胞，然后准备进行核酸提取。
[0072]
(2)基因组dna提取：
[0073]
采用天根植物基因组dna提取试剂盒进行提取,详细步骤参照其试剂盒中的说明书方法进行，最终提取后核酸溶液的体积为50ul。
[0074]
(3)反应体系的配置：
[0075]
荧光定量pcr检测的反应体系为20ul，采用康为世纪公司的探针法试剂。如表1所示，待测样品或阴性对照的反应体系均使用1ul核酸溶液或无菌水做模板，其余反应成分的添加参照表1。
[0076]
(4)样本检测：
[0077]
在abi 7500fast荧光定量pcr仪上，对3个样本进行检测，每个样本三个平行。仪器操作参照仪器使用说明书。荧光定量pcr扩增参数为：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火延伸60s，此处采集荧光信号，共计40个循环。
[0078]
(5)实验结果分析和计算：
[0079]
本实施例根据定量pcr阈值的设置原则，扩增曲线的阈值设定在扩增曲线的指数期，所设置的阈值＝0.105。3个样品所测得的ct值见表3，扩增曲线见附图6，阴性对照均无阳性扩增，表明扩增结果准确。把所测得的ct值带入细胞数量定量方程y＝-3.305x+34.07即可计算出反应体系中细胞的数量，再根据样本核酸提取后核酸溶液的体积(50ul)即可计算出样本中的棕囊藻细胞数量。具体的计算推演如下：
[0080]
公式1 y＝-3.305x+34.07
[0081]
公式2 x＝log
10
(反应体系中细胞数)
[0082]
公式3 y＝ct
[0083]
公式4 ct＝-3.305*log
10
(反应体系中细胞数)+34.07
[0084]
公式5 反应体系中细胞数＝10^(34.07-ct)/3.305
[0085]
公式6 样本中总细胞数＝50*10^(34.07-ct)/3.305
[0086]
本方法对已知数量的单细胞球形棕囊藻进行定量，其定量结果如表3所示。该结果通过与测定前的真实细胞数进行比较，对比结果如图6所示。
[0087]
实施例2
[0088]
本发明在自然海区样品定量分析中的应用，为了验证本发明是否能突破室内的模拟定量分析，应用到自然海区实现现场样本的定量分析，我们对采自自然海区的5个样本进行了定量分析。
[0089]
(1)自然海区样品的采集：
[0090]
本实施例一共5个样本，编号分别为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5，均由广西科学院海洋中心在赤潮航次调查中帮忙采集；海水首先经过20um的筛绢过滤，然后使用0.45um的玻璃纤维滤膜(直径47mm)过滤收集单细胞的球形棕囊藻，每份样品的滤水体积见
表3。
[0091]
(2)基因组dna提取：
[0092]
采用天根植物基因组dna提取试剂盒进行提取,详细步骤参照其试剂盒中的说明书方法进行，除了样品5在核酸提取后的核酸溶液的体积为85ul，其余4个样本均为100ul。
[0093]
(3)反应体系的配置：
[0094]
荧光定量pcr检测的反应体系为20ul，采用康为世纪公司的探针法试剂。如表1所示，待测样品或阴性对照的反应体系均使用1ul核酸溶液或无菌水做模板，其余反应成分的添加参照表1。
[0095]
(4)样本检测：
[0096]
在abi7500 fast荧光定量pcr仪上，对3个样本进行检测，每个样本三个平行。仪器操作参照仪器使用说明书。荧光定量pcr扩增参数为：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火延伸60s，此处采集荧光信号，共计40个循环。
[0097]
(5)实验结果分析和计算：
[0098]
本实施例根据定量pcr阈值的设置原则，扩增曲线的阈值设定在扩增曲线的指数期，所设置的阈值＝0.105。5个样品所测得的ct值见表4，扩增曲线见附图8，阴性对照均无阳性扩增，表明扩增结果准确。把所测得的ct值带入细胞数量定量方程y＝-3.305x+34.07即可计算出反应体系中细胞的数量，然后根据样本核酸提取后核酸溶液的体积(85或100ul)即可计算出未知样本中的单细胞球形棕囊藻细胞数量，最后根据样本的滤水体积即可计算出未知样本中的单细胞球形棕囊藻的丰度。具体的计算推演如下：
[0099]
公式1 y＝-3.305x+34.07
[0100]
公式2 x＝log
10
(反应体系中细胞数)
[0101]
公式3 y＝ct
[0102]
公式4 ct＝-3.305*log
10
(反应体系中细胞数)+34.07
[0103]
公式5 反应体系中细胞数＝10^(34.07-ct)/3.305
[0104]
公式6 样本中总细胞数＝核酸溶液体积(ul)*10^(34.07-ct)/3.305
[0105]
公式7 样本中细胞丰度＝核酸溶液体积(ul)*10^(25.89-ct)/3.305/滤水体积(l)
[0106]
本实施例对自然海区中未知数量的单细胞球形棕囊藻进行定量，其定量结果见表4。
[0107]
综合以上，通过本发明的方法不仅可以知道样本中有无球形棕囊藻，还能准确计算出样本中有多少单细胞球形棕囊藻的量，同时实现定性和定量分析海洋中低丰度的球形棕囊藻单细胞；本发明在细胞数量10
1-106数量级范围内都具有很好的线性关系(r2＝0.999)，该试剂盒能对低至32个的细胞进行准确定量。并且本发明的方法省时省力，能提前了解球形棕囊藻赤潮的数量动态以及更早的采取相应的防控措施。使用本发明的试剂盒避开球形棕囊藻rdna中突变区域在保守区域研发一对引物和一条寡核苷酸探针，因此具有更好的特异性和通用性去检测海区中单细胞的球形棕囊藻。此外所建立藻类定量的标准曲线，在定性的基础上同时实现了单细胞球形棕囊藻的定量分析；并且突破室内模拟定量分析，应用到现场样品的实际定量中。在本发明的方法能定量出低至103个/l数量级的细胞，高于其它已有的定量分析单细胞球形棕囊藻的分析方法。
[0108]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。