一种哺乳动物细胞疾病模型的高通量构建方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种哺乳动物细胞疾病模型的高通量构建方法。


背景技术：

2.人类基因组中的单核苷酸变异（snvs）可引起蛋白质序列中氨基酸残基的改变，进而改变其功能，从而导致个体疾病。根据ncbi的clinvar数据库，超过3.7万种已知疾病与致病性snv有关。单核苷酸突变引起的疾病主要包括罕见病、白血病、地中海贫血、leber先天性黑发等。欧洲罕见疾病组织的一项研究表明，全世界有4亿多人患有罕见的遗传病，其中95%的疾病得不到有效的治疗。
3.目前，基于crispr发展而来的碱基编辑技术（base editing），已被报导可用于高效地进行基因组的基因突变或修复、疾病细胞模型制作、基因治疗，为未来的遗传病治疗提供了希望。目前，已经报道了三类碱基编辑工具，胞嘧啶碱基编辑器（cbe）、它将c
·
g转换为t
·
a，腺嘌呤碱基编辑器（abes），它将a
·
t转换为g
·
c，以及糖基化酶编辑器（gbe），它将c
·
g转换为g
·
c。大约50%的人类致病单核苷酸变异是c
·
g到t
·
a转换，这可以被abes纠正。然而，由于编辑效率和脱靶效应问题一直存在，研究人员一直致力于编辑器的改进和优化，期望得到不同类型不同特征的编辑器，使编辑效率和编辑范围得到提高，为其早日应用于基因治疗中而努力。
4.疾病模型的建立是理解疾病机制、开发新的基因治疗策略和研究靶向药物所必需的，因此，建立哺乳动物细胞疾病模型在早期基因治疗药物靶点研究中得到重要应用，为开发和改进碱基编辑工具的优化提供基础。然而，新型碱基编辑工具的编辑效率和精准度的研究需要大规模样本数据，传统的哺乳动物细胞疾病模型建立方法主要由人工操作完成。对于大量样本，人工操作不仅费时费力，而且成本高、错误率高。为解决这一问题，常用方法是先构建靶基因文库由慢病毒先整合到哺乳动物细胞中再通过机器学习分析各编辑器的效率及偏好性，以期对设计全新的碱基编辑工具，改进碱基编辑器的基因编辑能力提供依据。然而，实际上由于慢病毒整合的位置效应，和靶基因的真实染色体环境不同，整合后的基因编辑效率与原位编辑效率会存在很大偏差，不能完全真实的反应编辑器的编辑能力，急需更准确、高通量的手段。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种哺乳动物细胞疾病模型的高通量构建方法。包括如下步骤：第一步，应用生物信息学方法将ncbi中clinvar数据库的c-to-t或g-to-a单核苷酸的变异位置、基因名称等相关信息进行整理后，根据自定义的相关基因靶点的筛选原则对用于构建相关疾病细胞模型的grna进行设计；其中，筛选原则包括：1.pam区为ngg；2.编辑窗口选的突变的c范围为3到9位；3.排除了周围的c即编辑窗口内除了所述目的c没有其
他的c。
6.第二步，利用以上设计的grna引入动物细胞、对目的基因进行基因编辑，包括以下步骤：（1）应用高通量纳升移液工作站方法进行grna质粒的构建；（2）应用高通量液体处理工作站将步骤（1）得到的grna质粒和含有荧光蛋白基因的碱基编辑器质粒（例如带绿色荧光蛋白基因的be4max）共转入哺乳动物细胞中，通过外加药物高通量培养筛选，高通量收集样品、测序，分析编辑效率；（3）应用流式细胞仪分选单克隆获取具有目标突变的疾病细胞模型（其实就是一种细胞系）。
7.第一步中，根据上述自定义的三个原则，通过生信分析选择了1210个目的靶点，提供了可进行基因编辑的grna,所述grna的靶序列包括表1中列出了100个作为例子。其中，靶序列为1-100的所述grna为本技术首次设计并筛选获得的，具有较优的编辑效果。
8.优选地，步骤（1）中，用bsai酶切带有ccdb基因序列和药物筛选标记的质粒载体，然后与带bsai酶切位点的且能靶向目标基因的grna序列进行t4 dna连接酶连接，连接产物纯化后即为grna质粒载体。
9.优选地，步骤（1）中，使用纳升移液工作站echo进行golden gate体系配制。
10.优选地，步骤（1）中，golden gate体系为1 ul。
11.优选地，所述步骤（1）中的药物筛选标记为嘌呤霉素药物筛选标记，步骤（2）中外加的药物为嘌呤霉素。
12.优选地，步骤（2）中，通过pei将步骤（1）得到的克隆载体和带有gfp标记的be4max共转入哺乳动物细胞中，外加药物筛选，收集测序。
13.优选地，步骤（2）中，所述哺乳动物细胞为人源细胞，更优选地，所述人源细胞为hela或hek293t，更优选hek293t；优选地，步骤（2）中，使用液体处理工作站i7进行细胞种板，转染，换液，收集。
14.将步骤（2）得到的细胞根据测序结果分析编辑效率，用流式细胞仪将有编辑效率的细胞进行分选，筛选出带有绿色荧光的hek293t单克隆细胞，扩培，测序验证保存c-t单核苷酸突变的疾病模型细胞。
15.优选地，步骤（3）中，所述单克隆筛选方法为流式细胞仪分选。其中，c-to-t编辑效率接近100%的细胞株，被认为是筛选出的单碱基突变疾病细胞模型。
16.本发明保护所述方法得到的哺乳动物细胞模型在药物筛选、疾病治疗效果评价或疾病治病机理研究中的应用。
17.本发明有益效果如下：设计了一个自动化的平台，从grna设计，高通量质粒构建及提取，高通量细胞转染，高通量细胞培养、高通量测序样品制备、高通量编辑结果分析，到单克隆分选的自动化哺乳动物细胞编辑平台。在此基础上，可以使用标准化的工作流程，高效产生疾病细胞模型，极大地促进不同哺乳动物细胞模型的生产进程。
附图说明
18.此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
图1为ccdb_grna质粒图谱；图2为be4max质粒图谱；图3为clinvar:vcv000011568碱基突变模型的单细胞分选；其中，a为正常细胞col7a1基因第1632为精氨酸（cga），当c突变成t时形成终止密码子（tga），翻译终止,导致致病突变；b为be4max碱基辑器在grna引导下对293t细胞进行编辑，构建疾病细胞模型；c为编辑效率为52% ; d:疾病模型细胞分选；图4为clinvar:vcv000011568碱基突变后修复效率。其中，a为疾病模型细胞株（g to a 90%突变）；b为abe-8e编辑器在grna引导下将疾病模型细胞株得修复成为正常细胞 (t to c)；c为疾病细胞进行修复成正常细胞的编辑效率为52%
±
1。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
20.一、疾病相关信息说明第一步，应用生物信息学方法将ncbi中clinvar数据库的c-to-t或g-to-a单核苷酸的变异位置、基因名称等相关信息以表格形式下载。
21.访问ncbi的variantsdatabase (变异数据库)clinvar，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/，在搜索框中分别输入“c》tand pathogenic”和“g》aand pathogenic”以检索c到t突变和g到a突变的信息，并点击页面上的download选项下载检索出的包括变异位点、基因名称和临床重要性等信息的表格，这些突变位点信息作为下一步用于设计grna构建疾病细胞模型的候选靶点。
22.二、构建疾病相关细胞模型的grna设计针对1210个目的基因靶点，提供了可进行基因编辑的grna。每个目的基因设计1条grna，1210个基因共1210条grna。
23.使用 python包seqseek，对照表格数据中的和用作参考的ncbi的核苷酸数据库中的染色体位置信息，从ncbi的核苷酸数据库中检索包含变异点的dna片段。其中，选择满足以下条件的长为20-nt的dna片段作为目标序列的grnaspacer：1）突变位点在该子序列的3到9位；2）对于c到t 变异，从4 到 8位没有额外的c；3）对于c到g 变异，从4 到 8 位没有额外的g；4）该20-nt 的dna片段后紧接着一个3-nt的ngg（作为 pam）；依据这些条件获得了1210个靶序列，每个靶序列由grna spacer及其后面的 3-nt ngg（作为 pam）组成。
24.三、构建克隆载体：利用第二步设计的grna构建克隆载体。具体方法如下：碱基编辑质粒为pcmv-be4max-p2a-gfp（addgene 12099）；1210个目的靶点的grna质粒的构建是通过在ccdb-grna质粒的u6启动子后插入n20取代ccdb基因构建。质粒（addgene 51133）用golden gate方法构建，体系为1ul，由纳升液体处理工作站（beckman-echo, usa）进行试剂添加。具体操作如下：首先，grna引物合成在384source板上，试剂混合
物i包括t4buffer（0.05 ul）和ddh2o（0.35 ul），试剂混合物ii包括ccdb质粒（0.15 ul）、t4连接酶（0.06 ul）、t4 buffer（0.1 ul）、bsa（0.1 ul）、bsai酶（0.06 ul）和ddh2o（0.03 ul），分别装在另一个384source板孔里。然后，用echo设备将每个退火反应所需的引物（上，下各0.05 ul）和混合物i（0.4 ul）共0.5ul试剂从384孔source板转移到96孔pcr板中，然后用封板机密封（180
°
c，4s），离心机离心（5000rpm，3min），pcr仪（95
°
c，5min）退火，得到dsdna。第三步，用echo将0.5ul混合液ii从384source板转移到dsdna 96pcr板上，然后密封（180
°
c，4s），离心（5000rpm，3min），在pcr仪中反应程序如下：37
°
c 3min，16
°
c 4min，重复步骤1
−
2共25个循环，50
°
c 4min，80
°
c 5min，4
°
c保持。将不需要热击和恢复培养的dh5α感受态细胞用beckman i7液体处理工作站（beckman-biomek, usa）加入到golden gate反应产物96孔pcr板中，置于0
°
c的peltier模块上孵育5min后，用beckman i7液体处理工作站将转化子转移到尖底96孔板中，用全自动克隆挑选系统（qp expression, genetix, uk）进行涂布后37
°
c培养过夜后挑选单克隆于96深孔板中，于37
°
c，800rmp高通量摇床（infors, switzerland）培养过夜后，使用磁珠法质粒提取试剂盒（biomiga, china），由beckman i7液体处理工作站按照质粒说明书编写程序，高通量提取质粒，一次可完成384个样本的提取， sanger测序后正确的用于后续实验。根据上述高通量实验步骤，相应于1210个目的基因中每个目的基因分别构建了一个质粒载体，即共1210个grna质粒载体用于后续细胞编辑实验。
25.三、细胞培养hek293t细胞取自美国典型培养物保存库（atcc），培养条件为37
°
c、5%co2，培养基为添加10%胎牛血清的dulbecco
‘
s modified eagle’s培养基（dmem）。
26.四、细胞转染对于细胞转染用beckman i7液体处理工作站完成，首先将细胞用胰蛋白酶消化离心后用培养基稀释细胞悬液于分液槽中，使用beckman i7工作站96通道接种100ul于96孔细胞培养板中，每孔大约1
×
104个细胞。在接种16~24小时后，将一定量的grna质粒与cas9质粒分别用培养基稀释后至于分液槽中，使用beckman i7工作站8通道，将grna质粒与cbe碱基编辑器质粒（带有绿色荧光蛋白的be4max，图谱如图2所示）于新的96孔板中混匀，每孔的grna转染量为80ng，be4max质粒的转染量为160ng，混匀以后静置5min，同时用培养基稀释pei后置于分液槽中，使用beckman i7工作站8通道将含有pei的培养液加入至上述96孔板中（1mg/ml的pei每孔0.72ul），然后将稀释后的质粒和稀释后的pei混合，静置20min, 使用beckman i7工作站96通道将上述混匀的转染试剂加入已接种的293t细胞培养板中，37℃培养，5%co2培养。细胞转染4-6 h后换液，使用beckman i7工作站96通道将96孔板中培养液吸走，加入100ul含10 %血清的新鲜培养基。
27.五、嘌呤霉素筛选与细胞收集、测序第3天、第5天和第7天，使用beckman i7工作站96通道进行换液，首先将嘌呤霉素溶液加入含10%血清的培养液中至于分液槽中，将原96孔板中细胞培养液缓慢吸走，使用beckman i7工作站96通道将含有嘌呤霉素溶液加入含10%血清的培养液加入到96孔细胞培养板中进行细胞筛选，第3和5天换液时嘌呤霉素浓度为用4
ꢀµ
g/ml，第7天嘌呤霉素浓度为2
µ
g/ml。第9天，使用beckman i7工作站进行细胞收集，首先将pbs至于一个分液槽中，细胞裂解液至于另一个分液槽中，使用beckman i7工作站96通道将原有培养液吸到废液槽中，将
存活下来的细胞用100ulpbs洗一遍，然后使用100ulpbs进行四角吹吸后细胞悬浮，将悬浮液吸至新的96孔pcr板中，平角离心机(hettich, germany)5000rmp离心20 min，使用beckman i7工作站96通道将上清液吸走，使用8通道每孔加入15 ul细胞裂解液混匀，使用pcr仪(analytik-jena, germany)在65
°
c 10 min，98
°
c 2min中裂解细胞。pcr扩增体系为30 ul，操作步骤如下：首先，将基因扩增的1.5ul正向引物和反向引物分别通过echo从384孔source板转移到96孔pcr板，2
×
es taq酶与ddh2o预混置于分液槽中，使用beckman i7工作站8通道每孔加入22 ul预混液于已加入引物的96孔pcr板中，使用beckman i7工作站96通道每孔再加入3ul裂解细胞作为pcr模板，使用封膜仪(miulab, china)进行封膜，pcr反应条件：94
°
c3min，94
°
c30s，60
°
c30s，72
°
c30s，2-4步骤30个循环，72
°
c2min，4
°
cstore。将pcr原液进行sanger测序。
28.六、测序结果分析与统计用editr软件对自动化平台进行基因编辑的1210个测序结果进行分析。
29.针对每个疾病位点，细胞编辑实验设计三个平行，编辑结束后对1210个编辑后的细胞pcr，进行sanger测序，使用editr软件对1210个编辑结果进行分析。
30.结果表明：应用高通量编辑平台验证be4max的原位编辑效率，大多数碱基编辑发生在pam序列上游的3 ~ 9个位置，823个基因靶点进行了c
ꢀ‑
t转换编辑，编辑效率为10%，248个基因靶点编辑效率≥50%，占全部靶点的20.33%，136个基因靶点编辑效率≤10%。76个基因由于pcr引物不好设计未得到编辑结果，175个基因靶点编辑不明显。
31.其中以100个最优靶标基因位点的编辑为例，grna的序列、疾病名称及编辑效率见表1。其中每条序列中的斜体c字，代表编辑效率所针对的位点。
32.表1. 1-100 grna序列clinvar号
流式细胞仪分选疾病模型细胞：采用荧光激活细胞分选法（facs）对单个细胞进行分选，制备方法为：将96孔板上编辑好的细胞池传代扩增至24孔板上，约2~3d后收集细胞，根据be4max的绿色荧光蛋白（gfp）荧光进行分选。单细胞通过流式分选到96孔板中，每孔含100
µ
l含10%胎牛血清和1%抗生素（100u/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素）的dmem培养液中。将分选的单细胞培养14天后，扩培到24孔板，大约2-3天后，再扩培到12孔板。一部分细胞冻存，一部分细胞经pbs洗涤、胰酶消化后，提取dna，pcr扩增，测序。最终通过sanger测序确认的单细胞疾病模型进行扩培及冻存。采用editr软件，网址baseeditr.com，分析流式细胞仪分选后的单细胞株，c-to-t编辑效率接近100%的细胞株，被认为是筛选出的单碱基突变疾病细胞模型，c-to-t编辑效率接近100%的细胞株占总测序细胞株的47.30
±
7.18%。例如，clinvar号：vcv000011568，基因col7a1(3p21.31):c.4894c》t (p.arg1632ter)碱基突变模型的单细胞分选，如图3，其中，a为col7a1基因编码vii型胶原蛋白的α链，碱基序列正常时1632氨基酸cga翻译为精氨酸，当c突变成t时形成终止密码子，翻译终止，导致隐性营养不良性大疱性表皮松解症；b为根据上述grna设计原则得到的n20序列，应用be4max碱基辑器对293t细胞进行编辑，构建c-t突变疾病细胞模型；c显示编辑效率为52% ; d为应用流式细胞仪将带有gfp的细胞进行单克隆分选。扩培后经sanger测序验证c-to-t编辑效率接近100%的细胞株占总测序细胞株的47.30
±
7.18%。
33.将流式分选及sanger测序验证的单细胞接种到24孔板中，将abe碱基编辑器（如abe-8e）与靶向基因位点的grna质粒共转染细胞，每种质粒组合转染设3个重复，转染24小时后添加5ug/ml嘌呤霉素到培养基中。转染120小时后收集部分细胞使用快速提取dna提取液提取基因组dna，对被编辑位点附近200bp~300bp区域利用taq dna聚合酶pcr，将pcr产物进行sanger测序计算编辑效率，收集细胞，提取细胞基因组，pcr并进行sanger测序检测编辑效率，验证碱基编辑修复情况。例如，clinvar号:vcv000011568，基因col7a1(3p21.31):c.4894c》t (p.arg1632ter)当使用编辑器修复纠正时，abe-8e在grna（n20序列tctcatcctcgggggccaac）引导下纠正效率可以达到52%
±
1，如图4中，a图为流式分选的单细胞扩培后经sanger测序验证，editr软件分析确定的疾病模型细胞株（gtoa），b图为疾病模型细胞株在abe-8e和grna的作用下修复成正常细胞（ato g），c代表用abe-8e编辑器对疾病细胞进行修复成正常细胞的编辑效率图。
34.本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。