核酸多色荧光探针及制备与在实时原位观察P53介导的细胞凋亡通路顺序激活中的应用

核酸多色荧光探针及制备与在实时原位观察p53介导的细胞凋亡通路顺序激活中的应用
技术领域
1.本发明属于纳米材料和生命科学技术领域，尤其涉及核酸多色荧光探针及制备与在实时原位观察p53介导的细胞凋亡通路顺序激活中的应用。


背景技术：

2.哺乳动物细胞中有两种不同但最终会聚的凋亡途径：bcl-2调节(也称为内在、线粒体或应激)途径和死亡受体(也称为外在)途径。在bcl-2调节途径中，p53、bax和细胞色素c(cyt c)处于密切的上游和下游关系，被确定为监测细胞凋亡的有吸引力的目标。p53蛋白是一种肿瘤抑制因子，是dna损伤反应的关键因素。p53对细胞凋亡的激活涉及固有的凋亡途径，以消除含有dna损伤的应激细胞。bax是bcl-2家族的成员，是细胞凋亡内在途径的核心调节因子。凋亡刺激后，它们被激活并在线粒体外膜处寡聚化以介导其通透性，从而引起cyt c从膜间空间向细胞质的移位，随后激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)的级联反应。实时检测p53、bax和cyt c的顺序激活以及阐明这些caspase的上下游关系对于了解细胞凋亡过程和评估癌症的治疗效果至关重要治疗。
3.目前广泛使用的分析信号通路中基因和蛋白的方法是基于传统的技术，如northern印迹杂交、实时逆转录-pcr(rt-pcr)、微阵列杂交、蛋白质印迹和免疫组织化学。然而，这些方法需要大量的时间、繁琐的步骤以及大量的细胞样本。此外，这些方法中使用的细胞裂解或固定化过程使得研究这些分子的动态变化和自然状态变得不可能。因此，开发一种无创方法来检测信号通路中的多个分子十分重要。而荧光成像分析在细胞内监测中的快速、高分辨率和直接可视化的优点，使其在同时监测参与活细胞信号通路的基因和蛋白并提供有关细胞信号转导通路的有用信息方面具有巨大潜力。
4.然而，基于金纳米材料的探针中，au-s键很容易被生物硫醇裂解，包括谷胱甘肽(gsh)和半胱氨酸，它们以相对较高的浓度存在，不可避免地会导致假阳性结果。酰胺键(-co-nh-)作为肽的骨架，广泛存在于整个生理系统中，在人类生活中发挥着至关重要的作用。由于惰性化学性质，酰胺键被认为是最稳定的化学基团之一。重要的是，酰胺键很容易通过氨基基团(-nh2)和羧基基团(-cooh)的直接缩合形成。因此，酰胺键可能是au-s键的良好替代品。所以开发一种操作简便、稳定性高、可原位实时胞内相关信号通路的纳米探针，将具有很好的应用前景。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种核酸多色荧光探针s-aunss@sio
2-p及其制备方法与在p53 mrna、bax mrna和cyt c检测中的应用。本发明方法结合了核酸和金纳米材料的双重优点，可以实现对细胞中实时原位监测p53介导的细胞凋亡通路，材料制备简单，性质稳定，灵敏度高，生物相容性高。
6.本发明的第一个目的在于提供一种核酸多色荧光探针s-aunss@sio
2-p，包括由二
氧化硅包覆的对称金纳米星、靶标固定链和靶标识别链；
7.其中，所述二氧化硅包覆的对称金纳米星(s-aunss@sio2)的直径为260～300nm；所述靶标固定链选自p53固定链(p53-cdna)、bax固定链(bax-cdna)和cyt c固定链(cyt c-cdna)中的一种或多种；所述靶标识别链选自p53识别链(p53-rdna)、bax识别链(bax-rdna)和cyt c适体链(cyt c-apt)中的一种或多种；所述靶标固定链和靶标识别链通过碱基互补配对进行连接；
8.所述p53固定链、bax固定链或cyt c固定链标记有羧基基团，所述p53识别链、bax识别链或cyt c适体链标记有不同的荧光基团。
9.在本发明的一个实施例中，所述不同的荧光基团选自fam、tamra和cy5中的一种或多种。
10.在本发明的一个实施例中，所述p53固定链序列：5
’‑
cooh-aaaaagctttgaggtgc-3’；
11.bax固定链：5
’‑
cooh-aaaaaagaggcggggg-3’；
12.cyt c固定链：5
’‑
cooh-aaaaagcaacaacgtac-3’；
13.p53识别链：5
’‑
gcacaaacacgcacctcaaagc-荧光基团-3’；
14.bax识别链：5
’‑
ctcagagctggtgggccccccgcctct-荧光基团-3’；
15.cyt c适体链：5
’‑
ccgtgtctggggccgaccggcgcattgggtacgttgttgc-荧光基团-3’。
16.在本发明的一个实施例中，所述二氧化硅包覆的对称金纳米星通过以下方法制备得到：
17.s1：将pvp溶液加热至回流，加入haucl4·
3h2o的deg溶液并反应，反应结束，清洗并固液分离取固相，并将固相分散于有机溶剂中，得到i-aunps溶液；
18.s2：向pvp溶液中加入dma溶液和盐酸溶液搅拌混合均匀，加入s1中所得i-aunps溶液，然后加入haucl4溶液，加热反应得到对称金纳米星；
19.s3：将ctac加入s2中所得对称金纳米星的水溶液并搅拌，加入naoh溶液，并将teos至少分三次加入，反应得到所述二氧化硅包覆的对称金纳米星。
20.在本发明的一个实施例中，步骤s1中，所述pvp与haucl4·
3h2o的质量比为5-20：1-3。
21.在本发明的一个实施例中，步骤s2中，所述pvp与dma的质量体积比为0.5-1.5g：60-140μl。
22.本发明的第二个目的在于提供所述的核酸多色荧光探针s-aunss@sio
2-p的制备方法，包括以下步骤：
23.(1)将二氧化硅包覆的对称金纳米星(s-aunss@sio2)进行氨基化，得到所述氨基官能化的二氧化硅包覆的对称金纳米星s-aunss@sio2；
24.(2)取靶标固定链，并加入edc和nhs并孵育，加入氨基官能化的二氧化硅包覆的对称金纳米星进行反应，得到cdna修饰的s-aunss@sio2；
25.(3)将靶标识别链与步骤(2)所得cdna修饰的s-aunss@sio2混合孵育，得到所述核酸多色荧光探针s-aunss@sio
2-p。
26.在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述edc、nhs与s-aunss@sio2摩尔比为40000～60000：40000～60000：1～4；所述靶标固定链与氨基官能化的二氧化硅包覆的对称
金纳米星s-aunss@sio2的摩尔比为600～1000：1～4。
27.在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述靶标识别链与cdna修饰的s-aunss@sio2的摩尔比为300～700：1～4。
28.本发明的第三个目的在于提供所述的核酸多色荧光探针s-aunss@sio
2-p在定量或定性检测p53 mrna、bax mrna或cyt c中的应用。
29.本发明的第四个目的在于提供所述的核酸多色荧光探针s-aunss@sio
2-p在检测活细胞中实时原位监测p53介导的细胞凋亡通路的应用。
30.在本发明的一个实施例中，检测方法：将含有s-aunss@sio
2-p的培养基用于孵育细胞，然后加入含有毒素的培养基进行孵育，荧光成像采集数据。其中，利用毒素诱导细胞凋亡，使细胞内的p53 mrna、bax mrna或cyt c含量发生变化(上调)。
31.在本发明的一个实施例中，培养基中纳米s-aunss@sio
2-p的浓度为20-80pm。
32.在本发明的一个实施例中，所述s-aunss@sio
2-p与细胞孵育时间为4-8h。
33.在本发明的一个实施例中，所述细胞包括人宫颈癌细胞hela、人结直肠腺癌细胞caco-2、人肝癌细胞hepg2和人乳腺癌细胞中的一种或多种。
34.在本发明的一个实施例中，所述毒素选自t-2毒素、黄曲霉毒素b1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素中的一种或多种。
35.所述的基于dna链解旋的核酸多色荧光探针，是基于结合亲和力差异。由于具有20个对称“热点”，s-aunss可以产生更强的局部电场。通过在其表面包裹稳定的硅壳并涂覆大量氨基(-nh2)基团。氨基修饰使s-aunss@sio2能够通过简单但强的酰胺键与羧基标记的dna(p53-cdna、bax-cdna、cyt c-cdna)序列偶联。然后，染料(fam、tamra和cy5)标记的识别dna链(p53-rdna、bax-rdna、cyt c-apt)与附着的cdna杂交，形成共价多色荧光探针s-aunss@sio
2-p，导致荧光猝灭。在靶标存在的情况下，rdna和apt倾向于与靶标形成更稳定的双链体或复合物，而染料分子从s-aunss@sio2表面释放，导致荧光增强。
36.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
37.(1)与传统检测方法相比，本发明提出的s-aunss@sio
2-p具有响应快，制备简单，性质稳定，生物相容性高和成本低的特点。此外，本发明可以个性化地设计不同的dna单链和金纳米材料，对方法进行改进和优化。
38.(2)由于具有较强的酰胺键和高度稳定的硅壳，s-aunss@sio
2-p纳米系统在高浓度的生物环境(如核酸酶、生物硫醇)存在下几乎不表现出非特异性信号，表现出良好的稳定性和抗干扰性能。
39.(3)s-aunss@sio
2-p能够实际应用于细胞等生物样品中，实现了对细胞凋亡时p53介导的凋亡通路中p53 mrna、bax mrna和cyt c顺序激活的原位成像与检测，有利于阐明这些分子的上下游关系，了解细胞凋亡过程和评估癌症的治疗效果。
40.(4)s-aunss@sio
2-p是一种无损的方法，在细胞内监测具有快速、高分辨率和直接可视化的优点。
41.(5)纳米s-aunss@sio
2-p对不同细胞系内p53 mrna、bax mrna和cyt c的示踪和传感具有通用性。
附图说明
42.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
43.图1为本发明实施例1制备的对称金种的tem电镜图、紫外-可见吸收光谱图；
44.图2为本发明实施例1制备的s-aunss的tem电镜图、紫外-可见吸收光谱图；
45.图3为本发明实施例1制备的s-aunss@sio2的tem电镜图；
46.图4为本发明nanomeasurer软件对实施例1制备的s-aunss、s-aunss@sio2粒径的统计图；
47.图5为本发明实施例2中羧基dna与s-aunss@sio2偶联后上清液的hplc图谱，s-aunss@sio2及其修饰后的zeta电位、红外光谱；
48.图6为本发明实施例2中双链在s-aunss@sio2表面杂交前后的荧光光谱及荧光寿命、拉曼光谱；
49.图7为本发明实施例2中荧光链浓度优化；
50.图8为本发明实施例3中s-aunss@sio
2-p的盐稳定性测试结果；
51.图9为本发明实施例3中s-aunss@sio
2-p的稳定性、重现性测试结果；
52.图10为本发明实施例4中s-aunss@sio
2-p对靶标的响应性的光谱检测结果；
53.图11为本发明实施例4中s-aunss@sio
2-p对靶标的响应性线性拟合结果；
54.图12为本发明实施例4中s-aunss@sio
2-p的特异性检测结果；
55.图13为本发明实施例5中不同浓度的t-2毒素侵染hela细胞结果；
56.图14为本发明实施例6中不同浓度s-aunss@sio
2-p与hela细胞共培养不同时间的细胞毒性；
57.图15为本发明实施例8中以icp-ms对s-aunss@sio
2-p与hela细胞的孵育时间进行优化；
58.图16为本发明实施例9中t-2毒素侵染hela细胞不同时间后用试剂盒测定活细胞凋亡时p53 mrna、baxmrna和cyt c含量；
59.图17为本发明实施例10中核酸多色荧光探针s-aunss@sio
2-p用于活细胞中的激光共聚焦成像；
60.图18为本发明实施例10中共聚焦荧光强度与t-2毒素孵育时间的关系；
61.图19为本发明实施例11中s-aunss@sio
2-p在不同细胞系中的荧光成像；
62.图20为本发明所设计的核酸多色荧光探针s-aunss@sio2的检测原理示意图。
具体实施方式
63.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
64.实施例1二氧化硅包覆对称金纳米星(s-aunss@sio2)的合成与表征
65.首先合成二十面体金种子(i-aunps)。将0.05-0.2g pvp溶解25mldeg溶液中，在烧瓶中加热至沸腾回流。5min后，快速注入2ml含有10-30mg haucl4·
3h2o的deg溶液。10min后，停止反应并冷却至室温。将产物离心并用dmf洗涤两次。最后，将i-aunps分散在27ml dmf溶液中。用tem电镜图和紫外-可见吸收光谱图对i-aunps进行表征，结果如图1。
66.在dma存在下合成对称金纳米星(s-aunss)。将0.5-1.5g pvp溶解在15mldmf中。然后加入60-140μl40％dma和120-200μl 2.5m hcl溶液。随后，加入1mli-aunps溶液，然后加入10-30μl 0.5m haucl4溶液。最后，将反应溶液在80℃的油浴中轻轻搅拌4h。将产物离心并用乙醇洗涤两次，最后分散在2ml水中。用tem电镜图和紫外-可见吸收光谱图对s-aunss进行表征，结果如图2。
67.对s-aunss进行硅壳包覆。将2.0mm的ctac(10-40μl)加入2.5ml s-aunfs溶液中搅拌过夜，然后加入15-20μlnaoh(0.1m)。随后，以30min的间隔加入5-10μl用甲醇制备的20％teos三次。24h后，将产物以8000rpm离心5min，并使用乙醇洗三次。最后，将获得的s-aunss@sio2重新分散在2.5ml的乙醇中。用tem电镜图和紫外-可见吸收光谱图对s-aunss@sio2进行表征，并利用nanomeasurer1.2软件对其的粒径进行度量分析，结果如图2、3、4。
68.由图1可见，二十面体金种子(i-aunps)分散良好且外观均匀，在570nm处附近显示出等离子体共振峰，平均粒径为97nm。
69.由图2可见，合成的所有的s-aunss都是高度对称的，具有十个相同臂的投影轮廓和显著单分散性。同时，s-aunss拥有较宽的等离子体共振散射峰，与多数荧光基团的吸收峰匹配良好，因此可以发生荧光共振能量转移过程，导致荧光基团的共振淬灭。
70.图3可见，二氧化硅对s-aunss的成功包覆(s-aunss@sio2)。
71.图4可见，s-aunss的平均粒径为204nm，s-aunss@sio2的平均粒径为280nm。
72.实施例2 s-aunss@sio2基dna探针(s-aunss@sio
2-p)的制备
73.首先，将10-15μl氨水(25％)和2.5ml s-aunss@sio2混合并搅拌30min，然后加入4-8μlaptes，在35℃下搅拌3h，然后在65℃下搅拌1h。随后，产物以8000rpm离心5min并洗涤3次。将获得的氨基功能化的s-aunss@sio2重新分散在2.5ml的pbs(ph＝7.4,10mm)中。分别取适量羧基标记的dna(p53-cdna、bax-cdna、cyt c-cdna)并混合，加入50μl 0.2m edc/nhs并于室温孵育30min。随后，加入920μl氨基功能化的s-aunss@sio2并摇动过夜。用高效液相色谱、zeta电位和红外光谱进行表征，结果如图5所示，其中a为高效液相色谱图，b为zeta电位图，c为红外光谱图。
74.最后，产物以8000rpm离心5min，洗涤3次，再分散于10mlpbs中。然后将荧光基团标记的dna(p53-rdna、bax-rdna、cyt c-apt)添加到上述溶液中，并在37℃下孵育3h。通过反复离心去除多余的dna，并将沉淀物重新悬浮在pbs缓冲液中以获得纳米多色s-aunss@sio
2-p(s-aunss@sio
2-p)。用荧光光谱及寿命、拉曼光谱进行表征，结果如图6所示。
75.为了获得最大的负载量，更改荧光链溶液浓度以便进行优化，以荧光链在s-aunss@sio2表面杂交前后荧光强度的差值证明两条链的互补杂交。结果如图7所示。
76.如图5所见，在与s-aunss@sio2孵育前后，上清液中cooh-dna的特征峰(260nm)显着降低(图5a)。如图5b所示，由于ctac的吸附，s-aunss呈现正电荷。二氧化硅涂覆后，由于硅羟基，表面电荷变为负电荷。用-nh2基团进行氨基官能化后，表面电荷变为正电荷。当cooh-dna与s-aunss@sio2表面共价键合时，表面电荷再次变为负值。同时，1554和1634cm-1
处显着增加的特征峰对应于n-h变形和c＝o伸缩振动，也证实了cooh-dna与s-aunss@sio2之间的成功共价键合。
77.如图6所见，荧光(fam、tamra、cy5)标记dna和s-aunss@sio
2-dna的杂交后，荧光基团的荧光被猝灭，拉曼信号被增强。同时，杂交后荧光基团的荧光寿命明显减小，这也表明
s-aunss@sio2和荧光基团之间发生了能量转移。
78.使用荧光信号对荧光链浓度进行了优化(如图7所示)。杂交前后系统中荧光强度的降低间接反映了成功杂交的荧光链的数量。随着三条荧光链浓度的增加，该值先增加后保持不变。推测三条链杂交已饱和，因此分别选择1μm作为最佳浓度。
79.实施例3核酸多色荧光探针s-aunss@sio
2-p的稳定性实验：
80.最后，收集s-aunss@sio
2-p在20个不同点的拉曼光谱以评估其信号重现性。
81.(1)紫外可见光谱表征s-aunss@sio
2-p的盐稳定性：
82.将制得的s-aunss@sio
2-p离心后重悬于含有不同nacl浓度(100mm、200mm、300mm、400mm、500mm)的pbs缓冲液中，涡旋混匀，静置10min后，然后观测其紫外-可见吸收光谱。结果如图8所示。
83.(2)荧光实验评估s-aunss@sio
2-p的抗酶切及抗置换稳定性:
84.将三组纳米s-aunss@sio
2-p置于96孔荧光微孔板中，分别加入dnase i(1u/ml)、rnasea(1mg/ml)和gsh(5mm)，在37℃下监测一段时间的荧光强度后加入靶标，继续监测荧光信号以评估抗酶切及抗置换稳定性。结果如图9a-c所示。
85.(3)s-aunss@sio
2-p的ph值稳定性：
86.将s-aunss@sio
2-p离心后分别重悬于不同ph值的缓冲液中(5、6、7、8、9)，连续监测样品的荧光强度。一段时间后向每组加入靶标。继续监测样品的荧光强度。结果如图9d-f所示。
87.(4)拉曼实验评估s-aunss@sio
2-p的培养基稳定性：
88.将s-aunss@sio
2-p离心后分别重悬于缓冲液、培养基和血清中孵育0、3、6、9、12和15h，然后检测三种荧光信号的变化。结果如图9g-i所示。
89.(5)拉曼光谱表征双模纳米s-aunss@sio
2-p的信号重现性：
90.收集s-aunss@sio
2-p在20个不同点的拉曼光谱以评估其信号重现性。结果如图9j-l所示。
91.由图8所示，即使nacl浓度高达400mm(远高于细胞内离子强度)，s-aunss@sio
2-p吸收峰的位置和强度也能基本保持不变，这是因为探针表面的大量生物dna分子的修饰阻止了s-aunss@sio
2-p的聚集。
92.胞内存在一定量的核酸酶，因此高核酸酶抗性对于细胞内传感系统至关重要。dnase i和rnasea被用作模型酶来研究探针的稳定性。图9a-c发现s-aunss@sio
2-p的荧光波动很小。由于高局部盐离子浓度和表面负电荷，提出的纳米系统保护dna探针免受核酸酶降解，从而减少了非特异性信号波动。除了酶的干扰，丰富的生物硫醇，如谷胱甘肽，也是传统dna纳米探针的一大挑战，它可以显着取代附着的dna探针，导致不可靠的传感结果。s-aunss@sio
2-p的抗gsh干扰能力也被研究。图9a-c显示了s-aunss@sio
2-p在高浓度gsh(5mm)处理下荧光强度在很长一段时间内变化不大，这归因于dna和s-aunss@sio2之间的强酰胺键。
93.细胞凋亡可导致细胞内酸化，ph值在5-9范围内对s-aunss@sio
2-p的影响被研究。图9d-f表明ph值对检测效果的影响可以忽略不计。
94.如图9g-i所示，随时间改变，作为溶剂，培养基、胎牛血清对s-aunss@sio
2-p的荧光信号几乎没有影响。
95.如图9j-l所示，不同荧光基团对应的sers峰强度的相对标准偏差(rsd)均为5％左右，这说明所提出的纳米s-aunss@sio
2-p具有良好的信号再现性。
96.实施例4 s-aunss@sio
2-p的体外响应
97.s-aunss@sio
2-p(0.5nm)和目标rna(p53 mrna和bax mrna，终浓度为150nm)及cyt c(终浓度为300nm)在37℃下混合，首先优化反应时间。在不同时间(0、20、40、60、80、100、120min)测量荧光强度。将浓度为1.5nm的s-aunss@sio
2-p与不同浓度的目标rna(0、20、40、60、80、100、120、140、60、180nm)和不同浓度的cyt c(0、100、150、200、250、300、350、400、450nm)在37℃下孵育1h。在490、553和638nm的激发波长下，荧光光谱收集范围分别为500-650、560-700和655-750nm。所有荧光测量至少重复3次。光谱结果分别如图10所示。520nm、580nm、670nm的荧光强度与p53 mrna、bax mrna及cyt c浓度进行线性拟合，结果如图11所示。
98.为了确定s-aunss@sio
2-p能特异性识别两种mrna和cyt c，它们的类似物以及其他重要的生物学成分(1mm)被选择进行了比较。两种mrna的类似物包括t
p53 mismatched
、t
bax mismatched
、t
vegf
、t
hcv
、t
mir-21
、t
p21
、t
bcl-2
、t
pten
、牛血清白蛋白(bsa)、抗坏血酸(aa)、l-半胱氨酸(l-cys)和氯化镁(mgcl)。cyt c的类似物包括葡萄糖(glu)、bsa、免疫球蛋白g(igg)、牛血清白蛋白(bsa)、半胱氨酸蛋白酶3(casp-8)、α-乳白蛋白(α-la)、β-乳球蛋白(β-lg)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-8(il-8)、白细胞介素-1β(il-1β)、肿瘤坏死因子(tnf-α)、胞质接头蛋白(keap1)、三磷酸腺苷(atp)、aa、l-cys、mgcl。操作方法同上，结果如图12所示。
99.如图10、11所示，随着靶标浓度的增加，荧光强度逐渐增加(图10)。fam的荧光发射与p53 mrna浓度之间存在良好的线性关系(图11a)。回归方程为y＝2286.15
·
x-463.12，线性系数r2＝为0.98456。检测限(lod)确定为0.47nm。同样，tamra的荧光强度与baxmrna浓度在0.5-4nm之间呈现良好的线性关系(图11b)。回归方程为y＝1238.13
·
x+8.54572，r2＝0.99621，lod为0.60nm。图11c显示cyt c浓度与cy5的荧光信号之间良好的正比关系，线性响应范围为300-4000nm，回归方程为y＝1.22
·
x-95.33，r2＝0.99697，lod为259.60nm。提出的s-aunss@sio
2-p在mrna和cytc检测方面表现出了可接受的性能，同时覆盖了细胞质中rna和cytc的最低值(1nm和1μm)。
100.如图12所示，在相同的条件下，用核酸错配链、生物蛋白以及其他生物活性物质处理s-aunss@sio
2-p，以评估纳米探针的选择性。在分析物中，s-aunss@sio
2-p只对三种靶标产生了最高的荧光响应。相反，其他干扰物未引起明显的荧光恢复。
101.实施例5 t-2毒素工作浓度的确定：
102.采用cck-8法确定t-2毒素与细胞共培养的最佳浓度。将t-2毒素母液用细胞培养基稀释成不同浓度。将hela细胞以每孔5000个的密度接种100μl细胞悬液于96孔板中。将培养板放在培养箱培养24h(37℃，5％co2)后，向培养板加入10μl不同浓度的t-毒素，使培养基中t-2毒素的最终浓度分别为0.5μm、1μm、2.5μm、5μm、10μm、20μm、40μm。在培养箱孵育2.5h后，向每孔加入10μl cck-8溶液并继续孵育4h，然后测定450nm处的吸光度。利用下述公式计算细胞相对存活率。(其中，毒素既可以刺激细胞发生凋亡，上调细胞内p53 mrna、bax mrna和cyt c的表达，又可以使细胞维持一定的活性。)
103.细胞相对存活率＝(实验组吸光值-空白组吸光值)/(对照组实验值-空白组吸光
值)
×
100％。通过origin软件拟合t-2毒素对hela细胞的ic
50
，结果如图13所示。
104.如图13所示，随着t-2毒素浓度增加，hela细胞活力也依次降低。通过origin软件拟合得到t-2毒素的ic
50
值约为5μm。在确保t-2毒素对hela细胞产生一定毒性，并保持一定的细胞存活率情况下，采用5μm t-2毒素作为后续实验的工作浓度。
105.实施例6 cck-f法评测s-aunss@sio
2-p的细胞毒性：
106.hela细胞以每孔5000个的密度接种于96孔荧光板中。在37℃，5％co2空气条件下培养至细胞贴壁后，弃去培养基，用pbs清洗三次细胞后加入含有不同浓度s-aunss@sio
2-p(100pm、50pm、25pm、12.50pm)的dmem基本培养基，继续培养不同时间(6h、12h、24h、36h)。然后培养基被弃去，用pbs缓冲液清洗细胞。pbs缓冲液被弃去后，每孔加入100μl cck-f试剂继续培养30min。随后于酶标仪中检测各孔荧光强度。未处理的细胞被作为对照，设其活性为100％，计算出不同探针浓度、不同作用时间下的细胞活性。钙黄绿素am和pi被联合使用，对与探针孵育过的细胞进行双重荧光染色。结果如图14所示。
107.由图14可知，甚至100pnm的s-aunss@sio
2-p刺激细胞36h，也可维持hela细胞活性在90％以上。双重荧光染色发现，与对照相比，视野中只能观察到绿色荧光，而看不到红色荧光。这些数据证实s-aunss@sio
2-p具有低毒性，适用于细胞环境。
108.实施例7 icp-ms对s-aunss@sio
2-p与细胞孵育时间进行优化：
109.为了进一步验证细胞中确实己经吞入s-aunss@sio
2-p，用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)对与探针孵育后细胞中的金元素含量进行了定量分析。具体做法如下：hela细胞与50pm s-aunss@sio
2-p在37℃孵育不同时间。然后，将细胞从培养皿中分离出来，超声处理并在王水中溶解过夜，用纯水将溶液稀释至10ml用于icp-ms检测。同时用王水消解不同浓度的s-aunss@sio2-p，适当稀释后进行icp-ms分析。获得质量响应峰(cps)并拟合标准曲线。因此，每个细胞中的探针量可以通过icp-ms测量的标准曲线来确定。结果如图15所示。
110.由图15可知，hela细胞对s-aunss@sio
2-p的吸收在大约6h达到饱和。此时，以1
×
104细胞计，细胞中s-aunss@sio
2-p的浓度约为16pm。
111.实施例8试剂盒测定活细胞凋亡时p53 mrna、bax mrna和cyt c含量：
112.根据指定的方案，使用总rna抽提试剂盒从t-2毒素处理过的细胞中提取总细胞rna，然后使用hiscript试剂盒的逆转录(rt)反应制备cdna样品。使用qpcr试剂盒进行cdna的qpcr分析。20μl反应溶液包含2μl cdna样品、10μl sybr qpcr master mix、2μl引物混合物和6μl无酶水。pcr条件如下：初始95℃30s，然后是95℃10s和60℃30s的40个循环。以gapdh为内参并使用2-δδct
方法评估p53 mrna和baxmrna。同时使用双抗夹心酶联免疫吸附(elisa)检测试剂盒测定了被毒素处理后的hela中cyt c水平。向预先包被了抗cyt c抗体的酶标孔中，加入标准品和破碎后细胞上清，温育后，加入生物素标记的抗cyt c抗体。再与hrp标记的链霉亲和素结合，经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入显色底物tmb，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。最后，在450nm处测定反应孔样品吸光度，样本中的cyt c浓度与吸光度成正比，通过绘制标准曲线计算出样本中cyt c的浓度。结果如图16所示。
113.由图16发现，在hela细胞中，细胞中的p53 mrna、bax mrna和cyt c呈毒素孵育时间依赖性增加。
114.实施例9核酸多色荧光探针s-aunss@sio
2-p用于活细胞凋亡时的荧光成像：
115.首先，hela细胞在共聚焦培养皿中预培养24h至80％覆盖后，将s-aunss@sio
2-p添加到培养皿中。在37℃孵育6h后，用pbs缓冲液洗涤细胞三次，然后加入t-2毒素(5μm)，并立即将培养皿放入共聚焦激光扫描显微镜(clsm)的细胞工作站中。显微镜聚焦在一组细胞上，并进行了多通道图像采集。结果如图17所示。同时用image j软件分析每个细胞的荧光强度。结果如图18所示。
116.如图17、18所示，在用t-2毒素刺激之前，在细胞中没有观察到背景中的荧光。孵育30min后，hela细胞中fam(绿色，p53 mrna)的荧光首先出现，并随着细胞凋亡的进展逐渐增强。随着孵育时间的流逝，在孵育60min后观察到tamra荧光(黄色，bax mrna)。cy5与cyt c激活相关的时间依赖性荧光信号直到t-2毒素处理90min才检测到，然后随着细胞凋亡的进展信号逐渐增强。
117.实施例10 s-aunss@sio
2-p在其他细胞系的通用性检测：
118.选择人肝癌细胞hepg2、人乳腺癌细胞mcf-7和人结直肠腺癌细胞caco-2来确定s-aunss@sio
2-p在人相关细胞中的通用性。s-aunss@sio
2-p与hepg2、mcf-7和caco-2孵育后，分别用t-2毒素刺激细胞。染色固定后，立即进行激光共聚焦成像。结果如图19所示。
119.由图19所示，t-2毒素孵育前，细胞内荧光信号较弱。孵育2.5h后，可以看出细胞内三个通道的荧光信号增强。可以得出结论，所提出的核酸多色荧光探针具有出色的通用性，可以实现各种人类细胞系中凋亡通路的监测。
120.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。