硫酸雌酮半抗原的合成及应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种硫酸雌酮半抗原的合成及应用。


背景技术：

2.硫酸雌酮，英文名称（estra-1,3,5(10)-trien-17-one,3-(sulfooxy)），cas：481-97-0，分子式：c
18h22
o5s，分子量：350，是一种雌激素，硫酸雌酮是母畜胚泡分泌的雌酮的代谢物在子宫内膜中转化而来的，其进入血液循环在妊娠早期达到可测水平，可作为家畜妊娠早期诊断的指标。猪妊娠早期的一个最显著的特点是雌激素的浓度明显增加，硫酸雌酮的浓度从妊娠第16天的浓度迅速增加到25-30天的2~3ng/ml，然后在妊娠40天时又降低到很低的水平，约0.2 ng/ml。在配种后适当时间测定硫酸雌酮浓度可以作为灵敏的诊断早期妊娠的方法。如果在配种后22-28天采样测定硫酸雌酮，不仅可以准确鉴别妊娠和未孕猪，而且可以比较准确判断子宫中胎儿的数目。妊娠30天时硫酸雌酮的含量与产仔时的窝产仔数高度相关，妊娠22-29天硫酸雌酮的含量与窝产仔数呈高度相关，因此可以预测产仔数量。通过测定硫酸雌酮含量预测产仔数，其准确率为73%。
3.用于硫酸雌酮检测的方法主要有化学发光免疫分析法（clia）、酶联免疫吸附法（elisa）、放射免疫法（ria）及胶体金免疫层析测定法（gict）。采用clia、elisa方法分析具有较低的检测限，但仪器检测操作复杂，费用昂贵，无法达到现场规模快速检测的要求。采用ria方法测定血清硫酸雌酮的含量容易造成放射污染。而免疫分析方法具有成本低，效率高，灵敏度高，对技术人员要求相对低等优点，适用于大量样品的快速检测。


技术实现要素：

4.为此，本发明提供一种硫酸雌酮半抗原的合成及应用。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明实施例提供一种硫酸雌酮半抗原，其结构如式所示：本发明另一方面还提供制备式所示的硫酸雌酮半抗原的方法，其包括：将硫酸雌酮与溴乙酸叔丁酯发生取代反应，获得硫酸雌酮酸酯；再将硫酸雌酮酸酯与三氟乙酸发生水解反应，获得式所示的硫酸雌酮半抗原。
6.本发明的一个实施例中，所述方法中，所述硫酸雌酮与溴乙酸叔丁酯的质量比例为80 mg：80 mg；
所述取代反应在无水乙腈溶液中进行；反应温度为70℃，反应时间为8-20 h。
7.本发明的一个实施例中，所述方法中，中间产物与三氟乙酸的质量体积比为128 mg：300 μl；所述水解反应的时间为2-6 h。
8.本发明还提供一种硫酸雌酮人工抗原，由式所示的硫酸雌酮半抗原与载体蛋白偶联制得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
9.本发明的一个实施例中，其包括将硫酸雌酮半抗原通过生物偶联将式所示的硫酸雌酮半抗原与载体蛋白偶联制备得到。
10.本发明还提供由所述的硫酸雌酮人工抗原制备得到的特异性抗体，所述抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体。
11.上述硫酸雌酮人工抗原以下任一应用：a1）在制备抗硫酸雌酮特异性抗体中的应用；a2）在检测抗硫酸雌酮特异性抗体中的应用，也属于本发明的保护范围。
12.由所述的特异性抗体制备的硫酸雌酮检测试剂或试剂盒，也属于本发明的保护范围。
13.上述所述的特异性抗体的以下任一应用：b1）在检测硫酸雌酮中的应用；b2）在制备硫酸雌酮的免疫层析试纸条中的应用；b3）在制备硫酸雌酮的胶体金检测试纸条中的应用，也属于本发明的保护范围。
14.本实施例中，硫酸雌酮结构式如下所示：本发明具有如下优点：本发明提供了硫酸雌酮半抗原以及人工抗原的合成方法，其完全抗原可以将硫酸雌酮的化学结构暴露出来作为抗原决定簇，为高灵敏度抗硫酸雌酮抗体的制备奠定了基础。
15.试验证明：本发明获得的抗体制备的硫酸雌酮检测试纸条的灵敏度的最低检出限为0.4 μg/l（ppb）。
16.本发明人工合成的硫酸雌酮半抗原连接蛋白位点特异性强，合成过程中位点充分保留，能够充分与蛋白偶联，试验结果表明，硫酸雌酮半抗原自身连接位置与bsa的亲和力很好。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方
式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
18.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
19.图1为本发明实施例提供的硫酸雌酮半抗原液质图谱；图2为本发明实施例提供的硫酸雌酮人工抗原和硫酸雌酮在相同浓度下的波长变化趋势图；图3为本发明实施例提供的硫酸雌酮胶体金检测试纸条操作过程示意图；图4和图5为本发明实施例提供的硫酸雌酮胶体金检测试纸条检测阳性结果的示意图；图6为本发明实施例提供的硫酸雌酮胶体金检测试纸条检测阴性结果的示意图；图7和图8为本发明实施例提供的硫酸雌酮胶体金检测试纸条检测无效的示意图。
具体实施方式
20.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实施例1、硫酸雌酮人工抗原的制备本发明硫酸雌酮半抗原合成的含有羧基的硫酸雌酮半抗原其结构如式所示：硫酸雌酮半抗原的反应过程如下所示：
本实施例的硫酸雌酮人工抗原的制备过程包括以下步骤：步骤一、硫酸雌酮半抗原中间产物硫酸雌酮酸酯制备取硫酸雌酮（e1s）80 mg，加入4 ml无水乙腈中，称取80 mg溴乙酸叔丁酯，40 mg koh，20 mg无水nai，70度反应过夜。将过夜反应物液质检测，收率91%，处理，蒸干乙腈，加入4ml水，二氯甲烷萃取4次，旋干有机相，得到128 mg反应物。
22.步骤二、硫酸雌酮半抗原制备将得到的128 mg反应物溶解到二氯甲烷中，加入300 μl三氟乙酸，反应4h。蒸干二氯甲烷，再多加几次二氯甲烷蒸干多余的三氟乙酸，得到硫酸雌酮半抗原，液质检测硫酸雌酮半抗原，如图1所示，硫酸雌酮半抗原液质图谱：收率91%。
23.步骤三、硫酸雌酮人工抗原制备称取硫酸雌酮半抗原45 mg，溶解在4 ml的dmf中，搅拌2 min，称取66 mg nhs，2 mg edc，溶解到2 ml水中，加入到硫酸雌酮半抗原溶液中活化过夜。
24.步骤四、硫酸雌酮人工抗原制备称取38 mg bsa溶于3 ml，0.01 mol/l，ph7.4的pbs溶液中，4℃下缓慢滴入到上述反应液中，室温搅拌反应两小时。用0.01 mol/l pbs在4℃下透析三天，每天换三次透析液，以除去未反应的小分子物质，透析分装，获得硫酸雌酮人工抗原，将该硫酸雌酮人工抗原在-20℃中保存。
25.取相同浓度的硫酸雌酮人工抗原和硫酸雌酮，测定不同波长的测定值，测定结果如图2所示，检测中明显看出硫酸雌酮和硫酸雌酮人工抗原相同浓度od值的波长曲线变化趋势不同，可以说明硫酸雌酮人工抗原合成成功。
26.实施例2、硫酸雌酮人工抗原免疫小鼠血清效价及测定将实施例1制备的硫酸雌酮人工抗原按照50 μg的量，与等量弗氏佐剂乳化后，皮下多点注射免疫若干只balb/c小鼠。首次免疫时佐剂为弗氏完全佐剂，后续免疫佐剂为弗氏不完全佐剂。免疫间隔为2周，3次免疫后以间接elisa测定血清效价。
27.将硫酸雌酮人工抗原用0.05 m ph值9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1 μg/ml，50 μl/孔包被至96孔酶标板中，4℃过夜包被，然后用pbst重复洗板3次，最后1次拍干；采用1%明胶封闭酶标板，200 μl/孔，37℃封闭2小时后用pbst洗板；将免疫后的小鼠血清从1:200倍开始2倍倍比稀释，50μl/孔加入酶标板，并以未免血清作为阴性对照，37℃孵育30 min；弃去
孔中液体，重复洗板3次；加入羊抗鼠igg hrp酶标抗体50 μl/孔，继续37℃孵育30 min；弃去孔中液体，重复洗板3次；加入tmb底物显色液，50 μl/孔，室温孵育10 min；再以2 m硫酸终止反应，酶标仪读取450 nm吸光度值，以od
450nm
值大于或等于阴性对照的2.1倍（p/n≥2.1）所对应的血清效价最高稀释倍数即为血清的elisa效价，经测定血清效价为1:25600，抑制率均达到50%以上，表明硫酸雌酮人工抗原免疫小鼠后可以发生免疫反应并对硫酸雌酮有抑制作用，见表1，血清效价及抑制率检测结果。实施例3、硫酸雌酮单克隆抗体的制备1、杂交瘤细胞株筛选选择硫酸雌酮人工抗原免疫小鼠的脾细胞与1.5
×
107个处于对数生长期的sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到能100%分泌硫酸雌酮特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株1f2-3e5，2a3-1f6，5b7-1h6，6f3-8a10，添加硫酸雌酮标准品5 ppb，检测结果显示4株细胞株均有较好的抑制率，均在60%以上，其中1f2-3e5抑制率达80%以上，见表2 ，4株杂交瘤细胞株抑制率，选择单克隆抗体杂交瘤细胞株1f2-3e5冻存以备后期使用。
28.2、硫酸雌酮单克隆抗体制备细胞复苏：取出硫酸雌酮单克隆抗体杂交瘤细胞株1f2-3e5冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将balb/c小鼠（6~8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5
×
105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到硫酸雌酮单克隆抗体。
29.3、检测硫酸雌酮单克隆抗体灵敏度及特异性将硫酸雌酮标准品稀释至终浓度为0、0.4、0.6、0.8、1.0 ppb，选择雌二醇、雌三
醇、孕酮、地塞米松、倍他米松激素作为特异性样品，进行elisa检测，计算平均od
450nm
值，表明硫酸雌酮灵敏度为0.4 ppb，并与雌二醇、雌三醇、孕酮、地塞米松、倍他米松激素无交叉反应，见表3，硫酸雌酮单克隆抗体灵敏度及特异性检测结果。
30.实施例4、硫酸雌酮胶体金检测试纸卡的制备本实施例提供硫酸雌酮胶体金检测试纸卡的制备过程：1、氯金酸的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸（sigma公司）稀释成0.01%（质量百分含量），置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100 ml0.01%氯金酸加入2.5 ml柠檬酸三钠（sigma公司），继续加热搅拌反应至红色时停止加热，冷却至室温时补足水，制备好的胶体金外观纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。
31.2、硫酸雌酮单克隆抗体-胶体金标记物的制备（1）在磁力搅拌下，用0.2 mol/l碳酸钾溶液调节上述氯金酸ph值至7.2，每毫升氯金酸溶液中加入100-150 μg实施例3制备的硫酸雌酮单克隆抗体，继续搅拌均匀30 min，加入10% bsa至bsa在氯金酸溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置30 min，12000 rpm，4℃离心30 min，弃上清液，收取沉淀。
32.（2）复溶缓冲液：含酪蛋白，吐温（0.02 mol/l)，ph值为7.2的磷酸缓冲液；其中，酪蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0.05%~0.1%（体积百分含量），吐温在复溶缓冲液中的终浓度为0.05%~0.15%（质量百分含量）。
33.（3）用复溶缓冲溶液洗涤两次，用体积为初始氯金酸体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到硫酸雌酮单克隆抗体-胶体金标记物浓度为50 μg/ml溶液，4℃备用，用于胶体金结合垫包被。
34.3、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含0.5% bsa，ph=7.2，0.1 mol/l的磷酸缓冲液浸泡2h，37℃干
燥2h，得样品吸收垫。
35.4、硝酸纤维素膜的制备包被过程：用磷酸缓冲液将硫酸雌酮人工抗原稀释到10 mg/ml，用biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上的检测线t，包被量为1.0 μg/cm。
36.用ph=7.2，0.01 mol/lpbs缓冲液稀释羊抗鼠igg抗体浓度至200 μg/ml，用biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上的质控线c，将包被好的反应膜37℃干燥2 h，得硝酸纤维素膜。
37.5、硫酸雌酮胶体金检测试纸条的组装将样品吸收垫，胶体金结合垫、硝酸纤维素膜，吸收垫依次按顺序黏贴在底板上，样品吸收垫的末端与胶体金结合垫的始端相连，胶体金结合垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸收垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸收垫的末端与底板的末端对齐，组装成胶体金试纸条。
38.6、胶体金试纸卡的制备试纸卡包括试纸条和卡壳，将试纸条装入卡壳中。卡壳包括上壳体和下壳体，上壳体设置有加样孔，观察窗，分别用来向试纸条上加注待测样品，观察试纸条上检测线和质控线的颜色变化，下壳体设置有用来固定试纸条的固定位，制备得到硫酸雌酮胶体金检测试纸条。
39.实施例5、硫酸雌酮胶体金检测试纸卡的检测本实施例的硫酸雌酮胶体金检测试纸卡主要检测原理：硫酸雌酮胶体金检测试纸卡以竞争法为基础，采用胶体金免疫层析技术，快速检测猪早孕。
40.一、本实施例提供实施例3制备的硫酸雌酮胶体金检测试纸卡的检测过程：1、试剂和样品的准备可采用未经处理的新鲜母猪尿液作为待检样本，撕开试纸卡铝箔袋包装，取出试纸卡，放于平整、洁净的试验台面上。
41.2、操作步骤用标配的一次性塑料吸管吸取一定量150 μl（约6-7滴）待检样本，滴加至加样孔。滴加操作完成后，等待10-15分钟判定结果，15分钟后的结果无效。如图3所示。
42.3、检测结果判定阳性：质控线（c）和检测线（t）均显色，c线显色比t线强，或质控线（c）显色，检测线（t）不显色，如图4和图5所示。
43.阴性：质控线（c）线和检测线（t）线均显色，t线显色比c线强，如图6所示。
44.无效：质控线（c）和检测线（t）均未显色如图7所示，或仅检测线（t）显色而质控线（c）未显色如图8所示。
45.本实施例的硫酸雌酮胶体金检测试纸卡贮藏与有效期：2-8℃保存，切勿冷冻。有效期：12个月，批号和有效期见包装盒。
46.二、本发明实施例3制备的检测试纸卡的灵敏度检测、特异性检测、临床样本检测1、硫酸雌酮检测试纸卡的灵敏度将1 mg/ml的硫酸雌酮标准品稀释成不同浓度，使硫酸雌酮终浓度为0μg/l、0.4 μg/l、0.6 μg/l、0.8 μg/l、1.0 μg/l，按照检测方法进行检测，验证产品的最低检出限。结果
表明，本发明的硫酸雌酮检测试纸卡的最低检出限为0.4 μg/l（ppb）。
47.2、硫酸雌酮检测试纸卡的特异性检测500 μg/l的雌二醇、雌三醇，孕酮、地塞米松、倍他米松等激素，按照检测方法进行检测，结果均呈阴性，表明本产品的特异性良好，与其他激素不发生交叉反应。
48.3、检测临床样本检测猪尿液中硫酸雌酮，从北京某大型养殖场选取育肥猪尿液50份（编号为y01~50）和妊娠15~30天的母猪尿液30份（编号为r01~30），共计80份，将样品设盲，重新编号为1~80，验证猪早孕快速检测试纸卡临床应用效果，结果表明产品的阳性检出率和阴性检出率均为100%，结果见下表4所示。
49.表4样品编号重新编号检验结果样品编号重新编号检验结果y0171—y2653—y0239—y2732—y0379—y2834—y0463—y2954—y058—y3050—y063—y3112—y0756—y3230—y0876—y3314—y0917—y3422—y1042—y3552—y1144—y3611—y1221—y3731—y1310—y3874—y1472—y396—y152—y4013—y167—y4166—y1716—y4236—y1878—y4315—y1959—y4470—y2061—y4549—y2173—y4651—y2228—y4720—y2346—y4858—y2457—y495—y2565—y5045—续表4样品编号重新编号检验结果样品编号重新编号检验结果r0167+r1640+
r0260+r1775+r039+r1827+r0435+r1933+r0537+r2041+r064+r2162+r0755+r2225+r0823+r2369+r0919+r2426+r1077+r2524+r1143+r2680+r1218+r271+r1368+r2848+r1438+r2929+r1547+r3064+由表4可知，本发明的硫酸雌酮检测试纸条检测结果表明产品的阳性检出率和阴性检出率均为100%。
50.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。